小建中湯對脾虛泄瀉幼鼠腸粘膜免疫功能影響的研究

王靜，冉志玲，杜淵，王新雪

（1.西南醫(yī)科大學中西醫(yī)結合學院，四川 瀘州 646000；2.西南醫(yī)科大學附屬中醫(yī)醫(yī)院，四川 瀘州 646000）

0 引言

腹瀉病是我國兒科關注的重點，是五歲以下兒童死亡的常見原因之一。急性腹瀉在兒童腹瀉病診斷治療指南推出以后診療得到了規(guī)范，治療水平得到極大提高，急性腹瀉的死亡率已大大降低[1]，而慢性腹瀉病程長，病因復雜、治療方式局限，療效欠佳，常伴有營養(yǎng)物質吸收障礙，并導致營養(yǎng)不良、生長發(fā)育障礙、免疫功能低下及反復感染等，嚴重影響兒童體格與智力發(fā)育，因此我們建議應該加強對慢性腹瀉的研究。從中醫(yī)來講，慢性腹瀉屬于中醫(yī)“久泄”范疇，脾虛是該病發(fā)生的關鍵環(huán)節(jié)，也是腹瀉遷延不愈，反復發(fā)作的主要因素。我院兒科基于《黃帝內經》“甘生脾”理論，臨床上運用小建中湯治療小兒脾虛泄瀉療效好。為探索小建中湯是否能通過提高腸道局部粘膜免疫功能從而達到治療脾虛泄瀉的目的，本研究通過觀察幼鼠的一般情況、胸腺指數、脾指數，同時采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA法）檢測腸粘膜分泌型免疫球蛋白（SlgA）、IL-2、IL-4的水平變化，以期為小建中湯治療脾虛泄瀉提供可能的實驗依據?，F(xiàn)將研究結果報道如下：

1 實驗方案

1.1 動物

昆明幼年雄性小鼠48只，體重20.55±1.13g，動物由西南醫(yī)科大學實驗動物中心提供（SCXK（川）2018-17）。

1.2 藥物及試劑

中藥煎液：采用目前較為公認的柯氏觀點（根據漢代出土文物中衡器與量器換算的結論）[2]，東漢1升≈ 200毫升（今），1兩≈15.62g（今）計算東漢時期小建中湯原方劑量約為：飴糖 150g（生產許可證號 SC11332040400877）、桂枝 45g、芍藥90g、生姜45g、大棗45g、炙甘草30g,根據人與動物劑量折算表[3]換算出相應的幼鼠用藥劑量，將其制成生藥濃度約2.63g/mL 的濃縮液150mL，設定為小建中湯高劑量；小建中湯現(xiàn)代方劑學教材推薦劑量參考第九版方劑學教材[4]為飴糖 30g、桂枝 9g、芍藥 18g、炙甘草 6g、生姜 9g、大棗 9g、制成生藥濃度為0.52g/mL的水煎液150mL，設定為小建中湯低劑量；生大黃水煎液: 大黃300g，制成生藥濃度為1g/mL藥液300mL。上述中藥水煎液完成后均保存于4℃冰箱。以上藥材（除飴糖外）由西南醫(yī)科大學附屬中醫(yī)醫(yī)院中藥房提供，中藥煎劑由西南醫(yī)科大學附屬中醫(yī)醫(yī)院制劑室協(xié)助完成。

試劑：小鼠分泌型免疫球蛋白A（SlgA）elisa試劑盒、小鼠白介素4（IL-4）、白介素2（IL-2）elisa試劑盒均購自睿信生物。

1.3 分組及造模

將48只幼鼠隨機分為2組，正常組（A組）12只，造模組36只，采用生大黃水煎液復制脾虛泄瀉幼鼠模型。每天給予A組幼鼠生理鹽水0.2mL/10g灌胃，每天一次。其余幼鼠均灌服生大黃水煎液0.2mL/10g，每天一次，連續(xù)7天造模。參考北京師范大學脾虛動物造模成功的標準[5]及脾氣虛證模型診斷標準[6]，認為本研究幼鼠出現(xiàn)大便不成型，食少納呆，體重增長減慢或減輕，神態(tài)萎靡，毛色無光澤、枯槁或疏散或豎立，蜷縮聚堆、抓取時掙扎無力癥狀，即可認為脾虛泄瀉造模成功。于第8天將造模成功的幼鼠再隨機分為3組，脾虛泄瀉組（B組）、小建中湯高劑量組（C組）、小建中湯低劑量組（D組）。

1.4 給藥方法

第8天，對C組予以小建中湯高劑量（2.63g/mL）藥液灌胃治療，對D組進行小建中湯低劑量（0.52g/mL）藥液灌胃治療，每只0.2mL/10g，每天一次，連續(xù)灌藥10d。A組和B組予生理鹽水灌胃，每只0.2mL/10g，每天一次，連續(xù)10d。

1.5 標本采集

于第18天麻醉后（苯巴比妥鈉50mg/kg腹腔注射）采用頸椎脫臼法處死各組幼鼠，取幽門下小腸組織20cm置于標本凍存管內，迅速放于液氮中速凍，然后轉移至-80°冰箱保存?zhèn)溆?，解剖后稱重幼鼠的胸腺和脾臟。

1.6 觀察指標

（1）一般情況：觀察每日幼鼠的精神、飲食、皮毛光澤、運動、體重、大便性狀情況。

（2）胸腺指數：稱量幼鼠的體重和胸腺，計算胸腺指數=胸腺重量(mg)/體重(g)。

（3）脾指數：稱量幼鼠的體重和脾臟，計算脾指數=脾臟重量(mg)/體重(g)。

（4）腸粘膜組織slgA含量測定：取幽門下20cm小腸組織，平鋪于無菌培養(yǎng)皿中，縱向剪開，放入裝有8mLPBS溶液的離心管中，渦旋15s，3000rpm離心20min，收集上清液，按照幼鼠slgAelisa試劑盒嚴格進行操作。

（5）腸粘膜組織IL-2、IL-4濃度測定：取上述小腸組織上清液，按照幼鼠白介素4（IL-4）、白介素2（IL-2）elisa試劑盒進行操作。

1.7 統(tǒng)計方法

采用SPSS 17.0進行統(tǒng)計學分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示。先進行正態(tài)檢驗及方差齊性檢驗，對兩組間比較采用獨立樣本T檢驗，對多組間比較采用單因素方差分析，多樣本間的兩兩比較采用LSD-t 檢驗。

2 結果

2.1 造模后幼鼠的一般情況

實驗前正常組和造模組的幼鼠活躍、皮毛柔順整潔有光澤、飲食可、大便正常、抓取時掙扎有力，且實驗前兩組幼鼠體重比較無差異性（P=0.689＞0.05）。造模7d結束，第8天時造模組幼鼠的表現(xiàn)為大便不正常（不成型，肛門周圍皮毛污穢或稀軟便等），毛發(fā)豎立、疏散、少光澤、神態(tài)萎靡、瞇眼、食少、聚堆、灌胃抓取時掙扎無力等表現(xiàn)，且造模組的幼鼠體重較正常幼鼠顯著增長緩慢（P＜0.05）（由表1可知），提示造模成功。

表1 造模前后幼鼠的體重變化（±s）

表1 造模前后幼鼠的體重變化（±s）

注：數據均為正態(tài)分布，具有方差齊性，故采用獨立樣本T檢驗；P＜0.05,表明組間具有差異性

組別 造模前（g） 造模后（g）正常組（n=12） 20.667±1.285 26.242±2.341造模組（n=36） 20.514±1.089 21.919±2.126 T 0.402 5.950 P 0.689 0.000

2.2 小建中湯對脾虛泄瀉幼鼠一般情況及體重的影響

予以小建中湯干預后，脾虛泄瀉幼鼠逐漸精神好轉，飲食增加，皮毛光澤整潔，大便由不成型便到軟便、正常便，逐漸活躍好動，掙扎、有力，提示脾虛癥狀逐漸恢復。由表2可知，給藥前，正常組幼鼠的體重顯著高于其余三組造模成功的幼鼠（P＜0.05)，且B、C、D三組幼鼠給藥前的體重沒有差異性（P＞0.05）。經予以小建中湯干預后，C、D組的幼鼠體重出現(xiàn)明顯增長，均顯著高于B組（脾虛泄瀉組）（P＜0.05），且與正常幼鼠的體重無差異性（P＞0.05）。表明，小建中湯有促進脾虛泄瀉幼鼠體重增長的作用。

表2 小建中湯對幼鼠的體重影響（±s）

表2 小建中湯對幼鼠的體重影響（±s）

注：*，表示與A組進行對比，P＜0.05；#，表示與B組比較，P＜0.05

組別 給藥前（g） 給藥后（g）A組(正常組) 26.242±2.341 28.975±1.622#B組（脾虛泄瀉組） 21.825±2.362* 25.892±3.290*C組（小建中湯高劑量組） 22.017±2.412* 30.108±3.098#D組（小建中湯低劑量組） 21.917±1.723* 28.375±2.845#齊性檢驗 0.764(P=0.521) 2.110(P=0.113)F 11.314 4.894 P 0.000 0.005

2.3 小建中湯對脾虛泄瀉幼鼠胸腺指數及脾指數的影響

由表3可知，脾虛泄瀉幼鼠的胸腺指數和脾指數明顯低于正常組幼鼠（P＜0.05）。對脾虛泄瀉幼鼠予以小建中湯干預后，C、D兩組的胸腺指數較脾虛泄瀉組均了出現(xiàn)顯著性增長（P＜0.05）。C組的脾指數增長顯著，D組的脾指數增加無顯著統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。從數據結果來看，C和D組的胸腺和脾指數均高于B組（脾虛泄瀉組），同時接近于A組（正常組）。說明，小建中湯有提高脾虛泄瀉幼鼠胸腺指數和脾指數水平的作用。

表3 小建中湯干預對幼鼠胸腺指數和脾指數的影響（±s）

表3 小建中湯干預對幼鼠胸腺指數和脾指數的影響（±s）

注：#,表示與B組進行對比，P＜0.05

組別 脾指數（mg/g） 胸腺指數（mg/g）A組（正常組） 6.446±1.819# 2.299±0.601#B組（脾虛泄瀉組） 4.540 ±1.754 1.526±0.461 C組（小建中湯高劑量組） 6.191±1.688# 2.304±0.536#D組（小建中湯低劑量組） 5.718±1.686 2.008±0.401#齊性檢驗 0.069(P=0.976) 1.265(P=0.298)F 2.835 6.295 P 0.049 0.001

2.4 小建中湯對脾虛泄瀉幼鼠腸粘膜slgA的作用

由表4可知，脾虛泄瀉幼鼠腸粘膜分泌SlgA的水平較正常組幼鼠出現(xiàn)顯著性下降（P＜0.05）。經予以小建中湯干預后，C組和D組幼鼠腸粘膜分泌的SlgA水平，較B組（脾虛泄瀉組）明顯升高（P＜0.05），且C組幼鼠分泌SlgA的水平高于D組（P＜0.05）。表明小建中湯可以促進脾虛泄瀉幼鼠腸粘膜分泌SlgA，且小建中湯高劑量提高脾虛泄瀉幼鼠SlgA水平的作用優(yōu)于小建中湯低劑量組。

2.5 小建中湯對脾虛泄瀉幼鼠小腸粘膜組織IL-2、IL-4含量的影響

由表4可知，與正常幼鼠相比，脾虛泄瀉幼鼠小腸組織分泌的 IL-2水平下降（P＜0.05），而 IL-4水平升高（P＜0.05）；與脾虛泄瀉組比較，小建中湯干預后，C組和D組幼鼠的IL-2水平顯著性上升（P＜0.05），C組的IL-2水平高于D組,但不顯著（P=0.056）。而小建中湯干預后C、D組IL-4水平均有下降，但C組IL-4水平下降更顯著（P＜0.05），而D組IL-4水平降低無顯著意義（P＞0.05）。說明，小建中湯可以上調小腸粘膜組織中IL-2的水平，而降低IL-4的水平，且小建中湯高劑量組對IL-2、IL-4的調節(jié)作用更明顯。

表4 小建中湯對脾虛泄瀉幼鼠小腸粘膜SlgA、IL-2、IL-4的影響（±s）

表4 小建中湯對脾虛泄瀉幼鼠小腸粘膜SlgA、IL-2、IL-4的影響（±s）

注：表示與B組進行對比，#，P＜0.05；表示D組進行比較，※,P＜0.05

組別 slgA（μg/mL） IL-2（pg/mL） IL-4（pg/mL）A組（正常組） 24.463±2.315# 158.746±30.522# 130.938±16.594#B組（脾虛泄瀉組） 18.441±2.856 103.121±21.108 168.703±17.098 C組（小建中湯高劑量組） 27.570±2.658#※ 181.261±22.798# 153.185±17.656#D組（小建中湯低劑量） 25.423±2.520# 161.04±25.597# 162.066±11.699齊性檢驗 0.401(P=0.753) 1.010(P=0.397) 1.042(P=0.384)F 27.265 21.122 12.807 P 0.000 0.000 0.000

3 討論

小兒素體脾弱，運化功能尚未臻全，加之后天調護失宜，罹患他病或久病遷延不愈，進一步損傷脾胃，致脾弱不健運，胃虛不腐熟，水谷不化，精微不布，精華糟粕不分，合污而下，混走大腸，從而發(fā)生脾虛泄瀉。小兒脾虛泄瀉以病程長，遷延不愈為特點，精微不能輸化，氣血化生乏源，不足以濡養(yǎng)臟腑肌膚，易生疳證；久泄致土虛木旺，內風從生，可成慢驚風；土虛不生金，皮膚毛竅不榮，腠理不密，正氣虧虛，易為外邪所害，故患兒容易反復感冒；脾虛泄瀉，所生疳證、慢驚風、反復感冒與今慢性腹瀉易合并營養(yǎng)不良、反復呼吸道感染、驚厥具有高度的一致性，因此，脾虛是慢性腹瀉的主證，小兒脾虛泄瀉是兒科醫(yī)生們高度重視的疾病之一。

脾虛泄瀉者，脾不健運，水谷精微不化，氣血不充，形神失養(yǎng)，則神疲、倦怠、發(fā)力；脾胃升降失職，脾不升則精微物質不能輸布，無以營養(yǎng)皮毛，則出現(xiàn)皮膚毛發(fā)枯燥、少華；胃不降則受納腐熟失常，不思飲食，則出現(xiàn)體重減輕、體重不增或增長減慢。脾虛致泄者，先損脾氣、再傷脾陽，不能發(fā)揮溫煦作用，則畏寒怯冷。本實驗結果顯示脾虛泄瀉造模后的幼鼠，出現(xiàn)大便溏泄、體重增長緩慢、食少，神態(tài)萎靡，毛色欠光澤、豎立，蜷縮聚堆、抓取時掙扎無力癥狀，符合脾虛泄瀉模型標準。

現(xiàn)代大量的研究證實脾虛泄瀉與人體免疫功能紊亂關系密切。胸腺是人體重要的中樞性免疫器管，通過分泌多種細胞因子和胸腺激素，促進胸腺細胞（處于不同階段的T細胞）分化、發(fā)育、成熟，主要參與細胞免疫，輔助體液免疫，同時也是機體固有免疫（γδT細胞）的組成部分。脾臟是機體最大的外周免疫器管，含有大量的B細胞、部分T細胞和少量巨噬細胞，主要參與體液免疫、細胞免疫，對非特異性免疫有輔助作用。器官的重量一定程度上可以反映免疫細胞的數量。本實驗結果顯示造模成功的脾虛泄瀉幼鼠胸腺及脾臟指數較正常幼鼠下降，可以初步提示脾虛泄瀉幼鼠免疫功能下降，但予以小建中湯藥液干預后，脾臟及胸腺指數均有上升，說明小建中湯對免疫功能有改善作用。

腸道局部免疫功能下降，被認為是脾虛泄瀉遷延不愈的主要原因[7]。正常情況時 ,腸粘膜相關淋巴組織中含有大量的B細胞 ,其中 70 %至 90 %是分泌 IgA的[8]。分泌型IgA（SlgA）是腸粘膜的主要免疫球蛋白，可阻止細菌粘附定植于腸道粘膜表面，還可中和腸道內病毒與病菌的毒素作用，同時可以與補體及溶酶體共同作用溶解細菌，是腸粘膜發(fā)揮抗感染免疫防御的關鍵因子，被稱為是腸粘膜免疫的核心[9]。有大量的實驗發(fā)現(xiàn)在脾虛泄瀉腸粘膜分泌SlgA的量會下降[10-12]。本研究發(fā)現(xiàn)大黃致脾虛泄瀉幼鼠小腸粘膜分泌的SlgA含量較正常幼鼠減少，符合目前已有的研究結論。與脾虛泄瀉幼鼠相比，小建中湯可以上調腸粘膜對SlgA的分泌，東漢時期仲景原方劑量對SlgA產生的促進作用優(yōu)于現(xiàn)代方劑學教材推薦的劑量。

輔助性T細胞（Th細胞），是輔助T、B細胞參與免疫反應的亞群。Th1和Th2細胞是相互調節(jié)、相互抑制的，二者的平衡失調與多種疾病的發(fā)生相關。IL-2、IL-4分別代表Th1細胞和Th2細胞，介導細胞免疫和體液免疫。有實驗證實，脾虛泄瀉大鼠較正常大鼠相比血清IL-2下降，而IL-4升高[13]。相反，也有學者通過大黃苦寒瀉下法建立脾虛模型，發(fā)現(xiàn)脾虛小鼠血清IL-2、IL-4均較正常鼠下降[14]。本實驗發(fā)現(xiàn)大黃致脾虛泄瀉幼鼠的腸粘膜組織中IL2、IL-4含量與正常幼鼠比較，IL-2下降，而IL-4上升，這可能與Th2細胞分泌的IL-4會抑制Th1細胞的分化和增值，從而使Th1細胞分泌IL-2減少有關。提示脾虛泄瀉時Th0（未完全分化的Th細胞）向Th2分化增多，破壞Th1和Th2的平衡關系。經小建中湯干預后，脾虛泄瀉幼鼠小腸粘膜組織分泌的IL-2水平升高，而IL-4的水平會下降。說明小建中湯可以通過促使脾虛泄瀉幼鼠的小腸粘膜組織分泌IL-2而抑制IL-4的產生，使脾虛泄瀉狀態(tài)Th0分化Th1細胞占優(yōu)勢，重新調節(jié)Th1和Th2的比例來改善腸道免疫功能，改善脾虛癥候的作用。同時東漢時期仲景小建中湯原方劑量和現(xiàn)代方劑學推薦劑量相比，仲景原方劑量對脾虛泄瀉Th1和Th2的這種調節(jié)作用要優(yōu)于現(xiàn)代教材推薦的劑量。

小建中湯可以改善腸道局部粘膜免疫功能，中醫(yī)學認為小建中湯關鍵的作用在于甘溫補脾建中。久瀉、虛瀉者，先損脾氣，繼損脾陽，脾氣虧虛，水濕不化，困阻脾陽，脾陽不振，中陽不舉，則泄瀉遷延難愈。治療要點，重在補益脾氣，使脾運復健，脾陽振奮，則水濕得以溫化。根據《黃帝內經》中記載“土生甘，甘生脾”“五味入胃，.甘先入脾..”，認為甘味生于谷,谷是土之所生,甘為土之味也，味甘者，最能補人以脾氣，故臨床上我們采用甘味湯劑小建中湯治療脾虛泄瀉能獲得滿意效果。小建中湯為甘溫補脾建中的代表方劑，方中重用甘溫質潤者，膠飴（又名飴糖）為君，以甘潤建土，《本草綱目》稱其為“補虛冷，益氣力..健脾胃，補中”。桂枝味辛、甘，性溫，走而不守，《本草綱目》日：“桂枝透達營衛(wèi)，脾主營，肺主衛(wèi)，甘走脾，辛走肺也”，桂枝合甘潤膠飴配伍，可入脾經，溫通脾陽，振奮中氣，復脾運之職，同時防飴糖滋膩之性礙脾。芍藥，味苦，酸，性微寒。《醫(yī)學啟源》稱其可安脾經，收胃氣，止瀉痢，和血脈，固腠理。合君藥以酸甘化陰，以復失之津，且有斂氣止瀉、柔肝扶土之功。生姜、大棗、草可助君藥補脾健胃，化生氣血，充養(yǎng)五臟六腑。諸藥相配伍，有溫中健脾止瀉之力，同時有燮理陰陽、補益氣血、固實腠理、柔肝緩急之功，可治脾虛泄瀉繼發(fā)疳證、慢驚風、反復感冒等，故謂之乃脾虛泄瀉之妙方也。本方以建立中氣為本，中氣立，脾胃復其升降，脾健運且升清，而胃腐熟且通降，可以改善脾虛本質，從而可以提高脾虛泄瀉幼鼠的腸道粘膜免疫功能的作用。

綜上，小建中湯可以上調脾虛泄瀉幼鼠胸腺指數、脾指數、小腸粘膜組織的slgA、IL-2，下調IL-4水平，來調節(jié)腸道粘膜免疫功能，改善脾虛本質，這可能是治療脾虛泄瀉的機制之一，且仲景原方劑量對改善腸粘膜免疫功能的作用優(yōu)于現(xiàn)代方劑學教材推薦劑量。小建中湯治療脾虛泄瀉值得推廣，且經方配伍及劑量應該得廣泛的重視。