結腸癌患者MMR蛋白表達情況及臨床病理特征

高瑞梓，杜正華，陳樂，郭源，張龍，李紀鵬

（1.西安醫(yī)學院研究生院 外科學專業(yè)，陜西 西安 710068；2.中國人民解放軍空軍軍醫(yī)大學第一附屬醫(yī)院 消化外科，陜西 西安710068）

0 引言

結腸癌是一種地域差異顯著的惡性腫瘤[1]，其發(fā)病和死亡負擔與區(qū)域經濟發(fā)展和生活、飲食習慣密切相關。作為結腸癌發(fā)生的第二大分子途徑，由dMMR/MSI-H產生的結腸癌約在未篩選的結腸癌中占比20%左右，其中四分之一來自MMR基因種系突變所引發(fā)的遺傳綜合征（Lynch綜合征），而在散發(fā)型患者中，dMMR/MSI-H也被發(fā)現與部分患者的化療和免疫治療反應及預后密切相關[2]。然而dMMR發(fā)生頻率在不同地區(qū)和人種間差異顯著[5-12]，為了探索結腸癌dMMR頻率的分布情況和dMMR/MSI-H表型患者的臨床特征，本文回顧性分析1279例結腸癌患者MMR蛋白MLH1、MSH2、MSH6和PMS2的表達缺失頻率及dMMR與結腸癌腫瘤病理特征的相關性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本研究收集2010年1月至2017年12月于中國人民解放軍空軍軍醫(yī)大學第一附屬醫(yī)院西京醫(yī)院消化外科接受手術治療的結腸癌患者資料1351例，經過篩選，將其中符合納排標準的1279例患者納入研究。納入標準：（1）接受根治性結腸癌手術治療；（2）術后經病理科確診為結腸癌。排除標準：（1）免疫組化或臨床病理資料不完整；（2）接受任何術前放化療或其它抗腫瘤治療者。所有患者均已簽署知情同意書。

1.2 方法

采用免疫組化IHC法檢測4種MMR蛋白（MLH1、MSH2、MSH6、PMS2）表達情況 ，取術中切除新鮮標本，常規(guī)10%福爾馬林固定，石蠟包埋，選擇代表性區(qū)域4μm連續(xù)厚切片，使用BOND-Max全自動免疫組化儀（美國 Leica 公司）按各抗體優(yōu)化執(zhí)行程序自動完成烤片、脫蠟、EDTA溶液高壓熱修復抗原、標記一抗、標記二抗、DAB顯色和蘇木素復染全流程，取出切片，用溫和洗滌液清洗，并用乙醇及二甲苯脫水、透明、封片。主要試劑：鼠抗人hMLH1、hMSH2、hMSH6和hPMS2單克隆抗體，均購自福州邁新生物技術開發(fā)公司。

所有切片標本均在光鏡下檢查，并由空軍軍醫(yī)大學第一附屬醫(yī)院西京醫(yī)院病理科至少兩名有經驗的病理科醫(yī)師進行獨立判讀。依據免疫組化染色半量化標準，抗體核染色陰性者為相應蛋白表達缺失，核染色陽性者為相應蛋白表達完整。任何1種或1種以上MMR蛋白表達缺失則判定為MMR蛋白表達缺失（dMMR），并分入dMMR組，無MMR蛋白表達缺失則判定為MMR蛋白表達正常（pMMR），并分入pMMR組。

1.3 統(tǒng)計分析

本研究采用PASW Statistics 18.0進行統(tǒng)計學分析。計數資料采用頻數和百分比描述，符合正態(tài)分布的計量資料采用均數和標準差描述，采用t檢驗、χ2檢驗及Fisher精確檢驗分析臨床病理特征的統(tǒng)計學差異，并認為P＜0.05即差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 MMR蛋白表達情況

1279 例結腸癌患者dMMR率分布情況如表1所示，總體dMMR率為22.0%（282/1279），其中MLH1蛋白缺失率為 7.2%（92/1279），MSH2蛋白缺失率為5.6%（72/1279），MSH6蛋白缺失率為7.0%（90/1279），PMS2蛋白缺失率為15.5%（198/1279），同時存在MLH1+PMS2蛋白聯合缺失，頻率為7.0%（90/1279），MSH2+MSH6蛋白聯合缺失，頻率為4.9%（63/1279）。

表1 MMR蛋白表達情況

2.2 MMR蛋白表達與臨床病理特征的相關性

1279 例結腸癌患者中，282例dMMR患者與997例pMMR患者比較，年齡更?。?5.65%±15.48 vs 60.81±12.96，P＜0.001）。TNM分期方面，dMMR患者中Ⅱ期患者的比例顯著高于pMMR患者（64.5% vs 40.8%，P＜0.001），而Ⅲ、Ⅳ期患者的比例明顯低于pMMR患者（22.7% vs 42.9%，P＜0.001；3.9 vs 8.6%，P＜0.001）。dMMR患者腫瘤位于右半結腸的比例顯著高于其在pMMR患者中的比例（65.6% vs 41.0%，P＜0.001）。大體類型方面，dMMR患者中腫瘤呈隆起型生長的患者所占比例顯著高于pMMR患者（22.7% vs 16.6%，P=0.017），而呈浸潤型生長的患者所占比例則明顯低于pMMR患者（1.8% vs 4.1%，P=0.017）。在dMMR患者中，腫瘤呈低分化的患者所占比例顯著高于pMMR患者（36.9% vs 16.3%，P＜0.001），而呈中分化的比例則明顯低于pMMR患者（55% vs 76.5%，P＜0.001）。與pMMR患者相比，dMMR患者的腫瘤最長徑更長（6.07±2.49 vs 4.63±1.93，P＜0.001）。且與pMMR患者相比，dMMR患者中N0和M0的患者占比較多（75.2% vs 49.6%，96.1% vs 91.4%，P均 ＜0.05）。T分期和性別在dMMR與pMMR結腸癌患者的比較中沒有明顯差異。發(fā)病年齡更小、分化不良更多見、位于右半結腸的比例更高、更傾向于呈隆起型生長而不是浸潤型生長、腫瘤最長徑更長、淋巴結轉移和遠處轉移率較低且TNM分期更早，差異均有統(tǒng)計學意義，P＜0.05。T分期與性別在兩組患者間沒有明顯差異。具體如表2所示。

表2 MMR蛋白表達與臨床病理特征的相關性

3 討論

作為消化系統(tǒng)最為常見的惡性腫瘤之一，結直腸癌2020年全球新發(fā)病例將超過190萬人，死亡病例預計約93.5萬人，占全球癌癥新發(fā)病例和死亡人數的大約10%[13]。根據以往的研究，結直腸癌發(fā)病率的地域差異非常顯著，世界各地區(qū)結腸癌發(fā)病率的差異高達9倍，發(fā)病率最高的地域主要集中于歐洲部分地區(qū)、澳大利亞/新西蘭和北美，而中南亞與大部分非洲地區(qū)結直腸癌的發(fā)病率往往較低[2]。在由于經濟發(fā)展和生活習慣的改變，我國結腸癌負擔正快速增長，2015年新發(fā)病例數均居于第五位[14]，而2020年已躍居第二位，僅次于肺癌[13]。且在地域分布上也同樣出現了經濟發(fā)達地區(qū)相比欠發(fā)達地區(qū)更高發(fā)的特點[14]。

作為結腸癌發(fā)生的第二大途徑，dMMR/MSI-H通路的分子基礎是由于各種遺傳因素和理化因素的損害所致的MMR基因種系突變或體細胞系甲基化，使MMR蛋白表達缺失，MMR功能也隨之喪失，即dMMR。由于微衛(wèi)星本身是遍布在基因組中的重復的核苷酸序列片段，尤其容易因DNA聚合酶滑移而出現堿基異常插入或移除，并出現重復次數（長度）變化[15]。正常情況下，每一種特定的微衛(wèi)星原則上在同一個體的所有細胞中都應該是長度相同的，而dMMR時，一部分長度異常縮短或延長的微衛(wèi)星序列無法被MMR系統(tǒng)修復，這就是微衛(wèi)星不穩(wěn)定狀態(tài)（MSI）。這些不穩(wěn)定的微衛(wèi)星序列伴隨有絲分裂傳遞給子代細胞進而大量累積，逐漸使基因組的穩(wěn)定性喪失，進入高突變狀態(tài)，最終導致惡性腫瘤的易感性大幅上升。有研究發(fā)現，一些微衛(wèi)星位點本身的多態(tài)性可能與人種關系密切，比如微衛(wèi)星BAT26在99%以上的白種人中長度統(tǒng)一，即為單態(tài)的，而在25%的非洲人種（包括非裔美國人）中出現多種長度不同的等位基因，即為多態(tài)的[16]。這也可能是導致dMMR/MSI-H表型結腸癌出現明顯地域性差異的原因之一。

在以白種人群體為主要樣本的研究中，dMMR/MSI-H率為20%-30%，西班牙人群體相對較低，De Jesus-Monge等報道為4.3%，亞洲地區(qū)報道為10%-15%[5-12]，本研究結果顯示dMMR率為22.0%（282/1279），具體如表3所示，本研究總體上與國外研究接近但與國內報道相比偏高，究其原因可能與幾個方面有關。

一方面由于各研究使用的檢測方法有區(qū)別，一般認為，PCR法作為診斷金標準更加精確，但是由于IHC法成本更低，操作簡便，可以在大多數病理部門進行，目前應用更加廣泛。與PCR法相比，IHC法最突出的優(yōu)勢在于對靶基因的定位，由于dMMR與MSI-H存在因果關系，直接檢測MMR蛋白可以提示引起MSI-H的具體突變基因。目前國際上，多數專家共識建議以PCR法進行預先檢測，在結果不明確或不可用時再進行PCR檢測[17-18]。事實上，在近些年的研究中，單獨使用PCR法檢測MSI的比例已由52%減少至20%左右[19]。在敏感度和特異度方面，有報道證明IHC法與PCR法總體接近，一致性范圍可高達90.4%至99.6%[20]。也有報道IHC法預測MSI狀態(tài)的準確率為76%，特異度為100%[21]?？梢奍HC法檢測dMMR與PCR法檢測MSI結果依然有一定的偏差，也許是由于比起PCR法，IHC法更依賴于病理醫(yī)師，標本、固定、染色、判讀等技術原因。這可能是本研究結果相比國內其他報道偏高的原因之一。

另一方面，研究者出于不同研究目的，選擇的樣本群體也有不同，一部分研究嚴格篩選并排除了具有陽性家族史的患者，而本研究由于缺乏詳細遺傳學資料未對樣本進行篩選。既往的研究認為Lynch綜合征患者絕大多數為dMMR/MSI-H表型，并且遺傳性結腸癌中Lynch綜合征的占比非常大[20]，顯然排除遺傳性結腸癌后dMMR/MSI-H頻率將隨之降低，本研究結果高于針對散發(fā)性病例報道也支持這一理論。

更值得注意的是，目前的大多數研究中將結腸癌與直腸癌樣本一同納入研究，事實上，結腸與直腸本質上是不同的器官，二者的胚胎學起源、解剖結構、生理功能上均不相同，結腸癌與直腸癌的發(fā)病率、死亡率、分子基礎、臨床特征、治療反應和預后也存在差異[22]，Korphaisarn等[8]等報道結腸癌發(fā)生dMMR/MSI-H的頻率顯著高于直腸癌 (20.4% vs 7.6%，P=0.01)。Ye等[10]的研究也證明了結腸癌dMMR率明顯更高（15.2% vs 5.1%，P＜0.01）。本研究針對結腸癌患者分析后發(fā)現了相比國內針對結直腸癌的報道更高的dMMR率，這也驗證了上述規(guī)律。

此外，筆者注意到目前國內研究報道多半集中在北京、福建、廣東等華北及東南沿海地區(qū)，而本中心患者主要來源于中西部地區(qū)，因此本研究結果也在一定程度上可以為dMMR率的地域性差異提供參考。

本研究結果顯示4種MMR蛋白MLH1、MSH2、MSH6和PMS2的缺失率分別為7.2%、5.6%、7.0%和15.5%，同時MLH1+PMS2蛋白聯合缺失率7.0%，MSH2+MSH6蛋白聯合缺失率4.9%?？傮w與以往報道相接近，但PMS2缺失率較高，目前關于PMS2的研究較少，有學者報道PMS2蛋白缺失者發(fā)生遠處轉移的比例更小[12]，但具體機制仍不明確。此外，還可能與檢測方法、結果判讀、地域差異、結腸與直腸的差異有關，仍需進一步探索。

由于與Lynch綜合征具有相似的分子基礎，許多研究認為dMMR /MSI-H表型結腸癌患者總體上傾向于出現與Lynch綜合征相似的臨床特征[23]。本研究結果顯示與pMMR組相比，dMMR組患者總體上出現了年齡更小、更好發(fā)于右半結腸、腫瘤分化程度較低、最長徑較長、更傾向于隆起型、且分期較早、淋巴結侵犯和遠處轉移較少等臨床特征，與文獻報道基本相符，這一結果表明dMMR表型結腸癌的腫瘤生物學行為傾向于類似Lynch綜合征的表現。

值得注意的是，本研究顯示dMMR頻率在各分期分布不同（Ⅰ期 24.8%、Ⅱ期 30.9%、Ⅲ期 13%、Ⅳ期 11.3%），Ⅳ期dMMR頻率與總體相比明顯降低（11.3% vs 22%），事實上，關于IV期結腸癌患者dMMR率的數據很少，大部分來自小樣本研究，報道范圍在0.5 - 21%之間，2018年Baretti等報道，dMMR/MSI-H表型僅占轉移性CRC的4%[24]，Ⅳ期患者dMMR率低提示了dMMR/MSI-H表型結腸癌的轉移侵襲能力可能較低，這可能說明了dMMR /MSI-H分子途徑在腫瘤發(fā)生發(fā)展的不同時期扮演了不同的角色。本研究結果支持這樣的假設，原因目前仍需要探索，有研究者認為，這可能與dMMR時一些編碼區(qū)微衛(wèi)星突變，導致終止密碼子提前出現并產生無功能的截短蛋白有關，這些蛋白質對于患者的免疫系統(tǒng)而言是一種新的抗原，因此dMMR/MSI-H表型患者具有高免疫性的特點，得到免疫保護的可能性增加[25]，這也許是轉移能力減弱的原因之一。

需要看到的是，由于dMMR發(fā)生率在人群中較低，在Ⅳ期可能尤其低，納入研究的樣本數量不足以支撐我們得出可靠的結論，這一現象仍需要后續(xù)研究的補充和驗證。

依據本研究可得出結論：（1）結腸癌患者dMMR率約為22%，且在各期分布不同（Ⅰ期24.8%、Ⅱ期30.9%、Ⅲ期13.1%、Ⅳ期11%）。（2）dMMR表型結腸癌具有年齡更小、更好發(fā)于右半結腸、分化不良更多見、腫瘤最長徑較長、更傾向于隆起型、且分期較早、淋巴結侵犯和遠處轉移較少等臨床特征。為結腸癌的診斷分類與dMMR/MSI-H通路的探索提供新的參考。目前仍存在一些不足：（1）由于缺少詳細的家族史，未能進一步區(qū)分散發(fā)性與遺傳性結腸癌進行分析；（2）下一步可繼續(xù)擴大樣本量并納入隨訪資料探索dMMR表型結腸癌的預后特征。