黃芪類中藥中芒柄花素和毛蕊異黃酮的HPLC測定

陳潔

摘 要：黃芪作為一種經(jīng)典的中藥，在臨床中能夠起到補中益氣、利水消腫、斂汗固脫的功效?，F(xiàn)代研究認為其還有調(diào)節(jié)血壓、增強免疫力以及保護心肝的作用，在臨床中具有非常重要的藥用價值。很多中成藥中都含有黃芪，基于此，運用高效液相色譜（HPLC）測定法對中藥黃芪中所含的異黃酮類成分進行測定。逐一對成品中的芒柄花素（F）、毛蕊異黃酮（C）以及黃芪異黃烷苷（A）進行定性檢測，并對F和C的含量進行了有效的測定，以期為臨床用藥提供安全保障。

關(guān)鍵詞：黃芪類;HPLC測定法;芒柄花素（F）;毛蕊異黃酮（C）

現(xiàn)階段，隨著我國對藥品安全的重視程度不斷提高，為了保障用藥安全，需要對藥品中的各種藥物成分及其含量進行有效測定，確保其按照相應(yīng)的比例進行配比，保障臨床用藥的安全。目前，對于黃芪質(zhì)量控制多選用黃芪甲苷作為標準進行測定，但檢測儀器需要蒸發(fā)光散射檢測器，導致成本較高。運用高效液相色譜（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）測定法對其中所含的異黃酮類成分及含量進行定性和定量的檢驗，能夠有效提高黃芪質(zhì)量標準，現(xiàn)將相關(guān)結(jié)果報告如下。

1 ? ?儀器、試劑以及樣品的準備

整個測定過程所用的儀器為高效液相色譜儀、色譜柱，用到的試劑為無水乙醇、正庚烷溶劑，并保證所用試劑等級均為AR級。黃芪藥材均由實驗室人員采集、收集和鑒定，并按照品種進行分類，分為蒙古黃芪（主要產(chǎn)地為山西、河北、內(nèi)蒙古）、莢膜黃芪（主要產(chǎn)地為四川、黑龍江）、多花黃芪（主要產(chǎn)地為甘肅、青海、西藏）以及金翼黃芪（主要產(chǎn)地為陜西、寧夏）。HPLC測定條件：層析柱YWG80-5 μm，流動相：正庚烷-無水乙醇-水-乙酸乙酯（80.00∶20.00∶0.05∶0.05），流速：1 mL/min，檢測波長：280 nm（定性）或250 nm（定量）。

2 ? ?方法與結(jié)果

2.1 ?運用HPLC對黃芪中的異黃酮類成分進行定性測定

準備黃芪細粉2 g，向其中加入30 mL乙醇溶液，將溶液充分混合，通過水浴回流對溶液進行提取和過濾，并將得到的濾液放入蒸發(fā)皿中進行水浴加熱蒸發(fā)，得到殘留物。向殘留物中加入質(zhì)量分數(shù)為0.3%的氫氧化鈉溶液10 mL進行充分溶解，而后過濾。用稀鹽酸將濾液的pH調(diào)整為5～6。再將溶液分配到分液漏斗中，并用20 mL的乙酸乙酯溶液對其進行萃取，得到乙酸乙酯層，用無水硫酸鈉對溶液進行脫水處理，繼而過濾。利用1 mL的乙酸乙酯溶液溶解得到濾液，進而得到測定試樣溶液[1-2]。

先通過F、C以及A的對照品溶液進行樣品的層析，將檢測儀器的波長定為280 nm，其他HPLC測定條件不變。分別取上述過程中的溶液1～2 μL進行層析，發(fā)現(xiàn)試液中已經(jīng)包含了這3種異黃酮成分，在所檢測的10種試樣中，均能檢測出F、C、A成分的存在。

2.2 ?運用HPLC對黃芪中的異黃酮類成分F、C進行定量測定

2.2.1 ?檢測色譜條件

根據(jù)F、C對紫外線（UV）光譜的最大吸收量，確定其波長為250 nm。流動相：用不同配比的正庚烷-無水乙醇-水-乙酸乙酯等系統(tǒng)進行測定實驗，并根據(jù)被測定成分分析分離情況，確定最后配比為80.00∶20.00∶0.05∶0.05，保持水浴流速為1 mL/min，層析柱壓為90 kg/cm2。在此測定條件下，F(xiàn)的保留時間為5.23 min，C的保留時間為7.54 min。

2.2.2 ?標準曲線

取適量含有無水乙醇溶液的F與C（其中含有F 0.036 9 mg/mL，含有C 0.163 5 mg/mL）。并用微量注射器分別對1、2、3、4、5 μL相關(guān)溶液進行層析，以峰高值作為縱坐標，以進樣量作為橫坐標，繪制相關(guān)測定值的標準曲線。得出F的質(zhì)量在0.036 9～0.193 5 μg內(nèi)呈線性相關(guān)，C的質(zhì)量在0.163 5～0.832 1 μg內(nèi)呈線性相關(guān)，并得出回歸方程分別為：

F∶Y=142 7+808 6 X，r=0.993 5

C∶Y=﹣306+578 1 X，r=0.993 8

2.2.3 ?精密度

對上述溶液進行5 μL進樣，連續(xù)試驗5次，能夠測得F的平均峰高為42 168，CV=1.67%;測得C的平均峰高為29 518，CV=0.86%。

2.2.4 ?具體的測定方法

精密稱取黃芪細粉，取3 g放入索氏提取器中，加入 ? ? 90 mL無水乙醇溶液進行過夜浸泡。通過水浴回流提取出無色的浸出液，整個水浴回流的過程將持續(xù)5 h，將得到的浸出液轉(zhuǎn)入蒸發(fā)皿中，通過水浴加熱得到殘留物，并分別用 ?20 mL的乙醚和20 mL質(zhì)量分數(shù)為0.5%的鹽酸溶液進行交替溶解，進而將溶解液分別轉(zhuǎn)入分液漏斗中進行分層并取乙醚層。得到的乙醚層再用10 mL的乙醚提取兩次，合并后的乙醚溶液用質(zhì)量分數(shù)為0.3%的氫氧化鈉溶液10 mL進行3次提取，最后合并堿溶液，用稀鹽酸將溶液的pH調(diào)整為5～6后，分別用10 mL的乙醚溶液進行4次提取，最后合并乙醚溶液，用無水硫酸鈉進行脫水處理，并通過過濾除去其中所含的乙醚，得到的殘留物再用2 mL的無水乙醇進行洗滌和溶解，并將得到的溶液轉(zhuǎn)入容量為2 mL的容量瓶中，再加入無水乙醇至相關(guān)刻度搖勻，然后將其按照上述對HPLC測定條件的設(shè)置，進行3 μL試樣層析測定，并用外標兩點法對F、C進行定量測定。

2.2.5 ?回收率的測定

運用HPLC測定法測定2 g黃芪樣品的F和C含量，并精密稱取對照樣品2 g，按照同種方法對其進行測定，計算出回收率，結(jié)果為：F的回收率為97.36%，CV=4.61%;C的回收率為98.13%，CV=4.94%，n=3。

2.2.6 ?樣品測定結(jié)果

樣品測定結(jié)果如表1所示。

3 ? ?結(jié)語

運用HPLC測定法對黃芪類藥物中的F、C、A進行定性測量，并對其中的F和C進行定量測量，測試過程靈敏度高、重現(xiàn)性好。同時，所用的流動相系統(tǒng)以及樣品預(yù)處理方式簡單、快捷，能夠?qū)S芪中所含的異黃酮成分進行有效測定，為黃芪質(zhì)量標準提供了借鑒。鑒于黃芪中所含的異黃酮成分具有很好的溶解性，整個測試過程用乙醚溶液進行提取，并考察了整個過程F和C的回收率。

通過實驗發(fā)現(xiàn)，無論是哪個產(chǎn)地的黃芪，經(jīng)過HPLC測定方法進行測定后，都能得出其含有F、C以及A的結(jié)論，并且再對F和C進行定量測量，能夠計算出10種樣品中F和C的含量，以便臨床使用時，根據(jù)具體要求選擇適合的黃芪類藥物。

異黃酮類物質(zhì)是黃芪類藥物中的重要組成部分，在黃芪中占有很大的比例，且異黃酮類物質(zhì)直接決定了黃芪類藥物的藥理性質(zhì)，異黃酮類物質(zhì)含量的增加、異黃酮類物質(zhì)含量的下降，都將導致黃芪類藥物質(zhì)量改變。因此，實驗室需要運用HPLC測定法對黃芪類中異黃酮物質(zhì)進行定性和定量測量，以此來保障黃芪的質(zhì)量。

[參考文獻]

[1]撒偉文，王寶琴.黃芪類中藥中芒柄花素和毛蕊異黃酮的HPLC測定[J].中成藥，1991，13（9）：32-33.

[2]楊星辰，史秀峰，楊費莉.高效液相色譜法考察黃芪蜜炙前后4種異黃酮含量的變化[J].中南藥學，2012（2）：15-18.

High performance liquid chromatography determination of Formononetins and Pistil isoflavones in Astragalus membranaceus

Chen Jie

（Nanjing Jinling Pharmaceutical Co. Ltd.， Jinling Pharmaceutical Factory， Nanjing 210038， China）

Abstract：As a classic Chinese medicine， Astragalus membranaceus can play the role of tonifying， promoting diuresis and detumescence， astringent and solid off. Modern studies suggest that it can also regulate blood pressure， enhance immunity and protect the heart and liver， which has very important medicinal value in clinic. Many Chinese patent medicines contain Astragalus. Based on this， the isoflavones in Astragalus were determined by high performance liquid chromatography. The quality of Formononetin（F）， Pistil isoflavones（C）and Astragaloside（A） in the finished product were detected one by one， and the contents of F and C were determined effectively， in order to provide safety guarantee for clinical medication.

Key words：Astragalus membranaceus; high performance liquid chromatography determination; Formononetin（F）; Pistil isoflavones（C）