基于點擊化學的殼聚糖水凝膠的制備及性能

徐思詩，郎美東

(華東理工大學材料科學與工程學院，上海 200237)

1 引 言

水凝膠作為一種具有高吸水和保水性的高分子交聯(lián)網(wǎng)絡材料，在生物醫(yī)學領域有著十分廣泛的應用。由于生物醫(yī)用材料在無毒性、生物相容性和生物可降解性方面有著十分嚴格的要求，研究者們常采用天然大分子如多糖、多肽、蛋白質等作為水凝膠的主鏈結構[1-3]。殼聚糖(CS)是一種由甲殼素脫乙?；玫降奶烊粔A性多糖，能夠溶于酸性溶液，具有優(yōu)異的無毒性、生物粘附性、抗菌性及生物可降解性[4-6]。

CS水凝膠可分為官能化改性后通過共價鍵交聯(lián)形成的化學水凝膠，以及通過靜電作用力形成的物理水凝膠[7-9]。Li等[10]用氯乙酸將殼聚糖羧甲基化制得N，O-羧甲基殼聚糖(NOCC)，同時利用糖單元保留的部分氨基與氧化透明質酸(OHA)的醛基發(fā)生席夫堿反應，形成一種可注射原位交聯(lián)NOCC-OHA 水凝膠。Birch等[11]在中性條件下利用果膠和CS制備了一種用于創(chuàng)口敷料的溫敏性聚電解質復合水凝膠CS/Pec，其儲能模量G'會隨溫度的升高逐漸減小。然而其G'max也小于1000 Pa，凝膠強度有待加強。另外，多數(shù)改性CS水凝膠的凝膠時間長達幾小時甚至幾天，制備方法頗為復雜，這使其投入實際應用變得較為困難。

點擊化學反應的概念最早源自Sharpless，是指一些操作簡單得就像敲擊鼠標一樣的化學反應，這些反應具有快速、高選擇性、廣泛適用性、對氧氣與水不敏感、操作便捷、產物易純化等眾多優(yōu)點，極大地簡化了化合物的合成步驟[12-13]。其中，巰基-烯點擊化學反應是制備各種原位交聯(lián)水凝膠的理想方式[14-15]。Zhao等[16]將巰基化殼聚糖CS-NAc與雙鍵化葡聚糖Dex-Ma通過巰基-烯點擊化學反應交聯(lián)形成CNDM 水凝膠，隨著投料比與質量分數(shù)的改變，凝膠時間從12 min到12 h 不等。Ma 等[17]將CS 與PEG-DA 進行Michael 加成反應，制備得到的雙鍵化殼聚糖PEGDA-CS具有光交聯(lián)特性和良好的水溶性。但基于巰基-烯點擊化學殼聚糖水凝膠相關的研究并不充分，無論是CS改性的實驗操作，還是水凝膠的交聯(lián)時間及可重復性等都有較大提高空間。

本研究參考了Dong等[18]的工作。采用甲磺酸(MSA)作為反應的溶劑與催化劑，將CS質子化，使得丙烯酰氯的取代發(fā)生在對位的羥基上，通過一步法就能得到接枝率很高的水溶性丙烯?；鶜ぞ厶?CS-AC)。之后首次將其應用于巰基-烯點擊化學水凝膠的制備中，以帶有端巰基的二硫蘇糖醇(DTT)為交聯(lián)劑，在紫外光(UV)光照下快速交聯(lián)形成水凝膠。分析對比不同雙鍵/巰基投料比水凝膠的凝膠時間、流變行為、溶脹率等性質。此外進行了細胞毒性實驗及抗菌實驗，探索水凝膠在載藥抗菌材料方面的潛在應用。

2 實 驗

2.1 原料

試驗用原材料主要為殼聚糖(CS，DD=90%+)、甲磺酸(MSA)、丙烯酰氯、DL-二硫蘇糖醇(DTT)、2-羥基-2-甲基-1-[4-(2-羥基乙氧基)苯]-1-丙酮(I2959)、小鼠胚胎成纖維細胞(NIH-3T3)。

2.2 丙烯?；鶜ぞ厶?CS-AC)的制備

稱取2 g CS溶于15 m L MSA 中，在25～35℃下攪拌至完全溶解。使用恒溫低溫反應鍋在0 ℃攪拌2 h后，緩慢滴入8 m L 丙烯酰氯，充分混合后繼續(xù)在0 ℃攪拌6～8 h，使CS與丙烯酰氯充分反應。將反應液用500 m L 丙酮與乙醚的混合溶液(體積比1∶1)沉降，離心分離。得到的沉淀物用40 m L 甲醇溶解，之后用丙酮與乙醚的混合溶液進行再沉降。沉淀物用乙醚清洗2～3次，離心分離，在室溫下抽真空干燥8～12 h 得到白色干燥粉末狀產物CS-AC，置于冰箱保存。

由于丙烯酰氯十分不穩(wěn)定，在高溫或遇水情況下極易分解，故投入摩爾量為CS糖單元10倍左右的量進行反應，設計接枝度為100%，即每個糖單元上都接枝上一個雙鍵。具體反應式如圖1所示。

圖1 CS-AC的合成反應式Fig.1 Synthesis route of CS-AC

2.3 巰基-烯點擊化學水凝膠(CS-AC/DTT)的制備

首先稱取6組0.1 g CS-AC分別溶于2 m L H2O中。之后每組分別加入10 mg光引發(fā)劑I2969，以及不同質量的DTT 配成不同雙鍵/巰基投料比的前驅體溶液，置于玻璃培養(yǎng)皿中，用365 nm 的紫外光照射進行巰基-烯點擊化學交聯(lián)，并記錄比較各組凝膠時間(溶液不流動，形成可以倒置的凝膠狀)。重復上述實驗5次，各組水凝膠凝膠時間取平均值。

UV 光照交聯(lián)結束后，將水凝膠取出，置于MWCO=14 k Da的透析袋中進行透析操作，以除去未反應的I2959及DTT。透析24 h后，冷凍干燥。共成功制備得到對照組自交聯(lián)水凝膠CS-CC-CS以及三組不同雙鍵/巰基投料比的點擊化學水凝膠CS-AC/DTT-0.25、CS-AC/DTT-0.5和CS-AC/DTT-1(其中0.25、0.5和1分別為各組水凝膠前驅體溶液中巰基與雙鍵投料比理論值)。

圖2 為CS-AC/DTT 點擊化學水凝膠的合成示意圖。

圖2 CS-AC/DTT 水凝膠合成示意圖Fig.2 Synthesis diagram of CS-AC/DTT hydrogel

2.4 表征與測試

使用Nicolet 6700型紅外光譜儀對CS-AC 及CSAC/DTT進行FTIR測試，掃描波長為4000～500 cm-1，采用KBr壓片法制備測試樣品。

使用Bruker Avarice 400 型核磁共振波譜儀在400 MHz，室溫下進行CS-AC 的1H-NMR 測試，樣品溶于D2O 中。

使用MARS III旋轉流變儀(Thermo)對四組水凝膠進行流變行為測試，采用變頻掃描模式，頻率變化從0.1～10 Hz，固定量應變1%，溫度分別為25 ℃和37 ℃。

分別稱取相同質量的四組凍干水凝膠CS-CCCS、CS-AC/DTT-0.25、CS-AC/DTT-0.5 和CS-AC/DTT-1，浸泡在p H=7.4的PBS緩沖液中。在25 ℃水浴鍋中靜置過夜，待其達到溶脹平衡后取出稱重，利用式(1)計算四種水凝膠的溶脹率(Seq%)：

式中：Weq指的是溶脹平衡時凝膠的質量，Wd指的是樣品凍干凝膠的質量。于37 ℃水浴鍋中重復上述步驟對四組水凝膠樣品進行溶脹性實驗。

水凝膠的處理采用浸提液法。首先各稱取8 mg四組凍干水凝膠，在DMEM 培養(yǎng)液中充分浸潤后，各加入2 m L培養(yǎng)液，靜置24 h后得到浸提液。用各組浸提液于96孔板中培養(yǎng)小鼠胚胎成纖維細胞NIH-3T3(空白對照組與四組水凝膠浸提液，每組平行設5個孔，一共25個孔)24 h。對各孔細胞進行MTT 測試，使用酶標儀測定490 nm 下細胞孔板中的OD 值，按照式(2)計算cell viability：

其中：ODsample指的是樣品組OD 值，ODcontrol為對照組OD 值。

采用物理負載的方式制備載有外用抗生素莫匹羅星(MUP)的水凝膠，用耐甲氧西林金葡萄球菌(MRSA)進行水凝膠的抗菌性測試。共設置了四組樣品：不載藥水凝膠CS-CC-CS、CS-AC/DTT 和載藥水凝膠CS-CC-CS-MUP、CS-AC/DTT-MUP，分別記為a、b、c、d，每組設置3個平行實驗。

每個瓊脂培養(yǎng)基上涂布的細菌濃度為106cfu/mL的MRSA 懸液100μL。將各樣品水凝膠用打孔器裁剪成相同大小(厚度3 mm，直徑10 mm)的圓片，放置于各培養(yǎng)基中心位置。置于37 ℃恒溫培養(yǎng)12 h后觀察比較四組水凝膠周圍的抑菌圈的大小并按式(3)進行計算：

其中：D2為抑菌圈外圍總直徑，D1為樣品原始直徑。

3 結果與討論

3.1 丙烯酰基殼聚糖(CS-AC)的結構分析

圖3分別為CS、CS-AC 以及CS-AC/DTT 的紅外吸收光譜圖。對比CS和CS-AC 可以看出，接枝產物CS-AC在1731及806、778 cm-1處的位置增加了C=O伸縮振動峰和碳碳雙鍵中=CH 的面外彎曲振動峰，分別在1634和1412 cm-1處出現(xiàn)了明顯的C=C伸縮振動峰和面內彎曲振動峰。這表明CS成功接枝了雙鍵。對比CS-AC和CS-AC/DTT 可以看出，交聯(lián)后的水凝膠樣品的C=C 的吸收峰均有明顯減少，由此可以說明在UV 照射下，CS-AC 與DTT 發(fā)生了巰基-烯點擊化學反應，體系交聯(lián)形成水凝膠。

圖4 為CS-AC 的1H-NMR 譜圖?？梢钥闯鲈讦?6.5～6.0處有明顯的CH2=CH-中三個質子的信號峰，進一步證明了CS-AC 中碳碳雙鍵的成功接枝。同時根據(jù)譜圖，通過式(4)計算出CS-AC的雙鍵接枝度：

圖3 CS-AC/DTT 的紅外吸收光譜圖Fig.3 FTIR spectra of CS-AC/DTT

其中：A 為信號峰的面積。計算得到CS-AC的雙鍵接枝度大約為100%，即CS的每個糖單元上都接枝了一個雙鍵。

圖4 CS-AC的核磁共振氫譜Fig.4 1 H-NMR spectra of CS-AC

3.2 水凝膠性能分析

3.2.1 凝膠時間分析 共設計了六組不同雙鍵/巰基投料比的水凝膠，表1為每組投料比和凝膠時間。分析交聯(lián)現(xiàn)象發(fā)現(xiàn)，當巰基多于雙鍵時，無法交聯(lián)成凝膠。推測是由于體系中過量的巰基會發(fā)生副反應，阻礙巰基-烯點擊化學反應的進行，破壞交聯(lián)體系。其中，雙鍵/巰基比為1∶0.5時交聯(lián)速度最快，10 min以內就能完全交聯(lián)成凝膠。雙鍵/巰基比為1∶1時稍慢，可能是由于體系中實際的活性雙鍵小于活性巰基導致過量巰基破壞交聯(lián)體系。總體而言隨著巰基投料量減少，交聯(lián)時間變長，基本能在20 min內交聯(lián)完全。而對照組自交聯(lián)水凝膠CS-CC-CS需在40 min以上才能自交聯(lián)形成凝膠，由此可以看出CS-AC/DTT 水凝膠能大大縮短CS水凝膠的交聯(lián)時間。

表1 水凝膠配比及凝膠時間Table 1 Feed ratio and gelation time of hydrogels

3.2.2 水凝膠流變行為分析 圖5(a)～(h)展示了25℃和37℃下各組水凝膠樣品在變頻掃描模式下的流變行為。從圖可見，各組水凝膠的儲能模量G'均大于損耗模量G″，展現(xiàn)出很好的凝膠特性。各組水凝膠的G'max在不同溫度下都展現(xiàn)出類似的變化趨勢，具體如表2 所示。對于CS-CC-CS、CS-AC/DTT-0.25和CS-AC/DTT-0.5，凝膠時間越短，水凝膠的G'max變小，這是由于體系快速交聯(lián)成凝膠態(tài)時，仍有較多雙鍵沒有反應，交聯(lián)點不夠多，導致水凝膠強度不是很大。而對于CS-AC/DTT-1水凝膠，如之前分析的由于體系內交聯(lián)網(wǎng)絡被破壞，故呈現(xiàn)出的G'max大大減小。另外，隨著測試溫度升高，各組水凝膠的強度都有所提高。推測這是由于隨著溫度上升，水凝膠內的水分有所減少，同時殘留的雙鍵略有打開增加了交聯(lián)點，使得整個凝膠的形態(tài)由原來的剛而脆逐漸變得增加了一定的韌性，使得凝膠強度增大?？傮w而言，除去巰基過量的CS-AC/DTT-1水凝膠，其它各組水凝膠都展現(xiàn)出5～10 k Pa左右的比較優(yōu)異強度。

表2 水凝膠在25 ℃和37 ℃下的最大儲能模量Table 2 G'max of hydrogels at 25 ℃and 37 ℃

3.2.3 水凝膠的溶脹性能分析 圖6展示了四組凍干水凝膠分別在25 ℃和37 ℃下在p H=7.4 的PBS溶液中的溶脹率。從圖可見，CS-AC/DTT-0.5水凝膠的溶脹率最大，在37 ℃下高達1415%。這是由于該組水凝膠具有最短的交聯(lián)時間，體系中的交聯(lián)點少，交聯(lián)度低，因此體系可以吸收較多的水分。而CS-CC-CS自交聯(lián)水凝膠由于具有較高的交聯(lián)度，故溶脹率較低。另外，CS-AC/DTT-1 水凝膠由于體系中過量巰基破壞了部分交聯(lián)網(wǎng)絡，使得溶脹率有所下降。隨著溫度從25 ℃升至37 ℃，四組水凝膠的溶脹率都有一定的上升。

3.2.4 水凝膠的細胞毒性分析 圖7為四組水凝膠樣品浸提培養(yǎng)NIH-3T3 細胞的細胞存活率結果。從圖可見，四組細胞存活率均大于90%，根據(jù)GB/T 14233.2-2005標準可以判斷四組水凝膠材料的細胞毒性保持在1級，即材料對細胞增殖無明顯抑制作用。其中，CS-CC-CS 自身就具有較好的細胞相容性，而CS-AC/DTT 中引入的巰基以及巰基-烯交聯(lián)網(wǎng)絡也未對材料的細胞相容性有影響。

圖5 水凝膠流變行為：CS-CC-CS(a)25 ℃，(e)37 ℃；CS-VE/DTT-0.25(b)25 ℃，(f)37 ℃；CS-VE/DTT-0.5(c)25 ℃，(g)37 ℃；CS-VE/DTT-1(d)25 ℃，(h)37 ℃Fig.5 Hydrogel rheological behavior：CS-CC-CS (a)25 ℃，(e)37 ℃；CS-VE/DTT-0.25(b)25 ℃，(f)37 ℃；CS-VE/DTT-0.5(c)25 ℃，(g)37 ℃；CS-VE/DTT-1(d)25 ℃，(h)37 ℃

圖6 水凝膠的溶脹率Fig.6 Swelling rate of hydrogels

圖7 水凝膠的細胞毒性Fig.7 Cytotoxicity of hydrogels

3.2.5 水凝膠的抗菌性能分析 圖8 為水凝膠的抗菌實驗結果，抑菌圈寬度見表3。對比圖8(a)和(b)可以看出，無論是CS-CC-CS還是CS-AC/DTT，未載藥時就具有一定的抗菌性，這是由CS本身的抗菌性決定的，接枝雙鍵以及與巰基交聯(lián)都沒有消除其抗菌性。對比不載藥組圖8(a)、(b)和載藥組(c)、(d)可以看出，載有莫匹羅星的兩組水凝膠表現(xiàn)出了十分明顯的抗菌性，說明通過物理負載的方式，水凝膠成功負載了莫匹羅星并且能夠通過擴散法產生抑菌效果。

圖8 水凝膠的抑菌效果(a)CS-CC-CS；(b)CS-AC/DTT；(c)CS-CC-CS-MUP；(d)CS-AC/DTT-MUP(黑色圈表示樣品水凝膠圓片原本大小，紅色圈表示培養(yǎng)12 h后抑菌圈外圍大小)Fig.8 Antibacterial effect of hydrogels (a)CS-CC-CS；(b)CS-AC/DTT；(c)CS-CC-CS-MUP；(d)CS-AC/DTT-MUP(black circle represents orginal size of hydrogel wafer sample，red circle represents size of inhibition zone after 12 h cultivation

表3 水凝膠的抑菌圈大小Table 3 Inhibition zone width of hydrogels

4 結 論

通過一步法可以將丙烯酰氯成功地接枝到CS上，合成帶有雙鍵側基的可溶性丙烯?；鶜ぞ厶荂SAC。通過1H-NMR 結果計算得到雙鍵接枝率大約為100%，即每個糖單元上都帶有一個碳碳雙鍵。該改性操作為CS糖單元引入了新的反應位點，可供其進一步與其它官能化化合物進行交聯(lián)反應。

CS-AC與DTT 在紫外光照射和I2959引發(fā)下進行巰基-烯點擊化學反應，交聯(lián)得到CS-AC/DTT 水凝膠。其最短在10 min之內就能凝膠完全，相較于自交聯(lián)水凝膠CS-CC-CS大大縮短了凝膠時間。水凝膠具有5～10 k Pa左右的儲能模量以及高達1415%的優(yōu)異的溶脹率。各組水凝膠對小鼠胚胎成纖維細胞NIH-3T3無明顯細胞毒性。

通過物理法負載了莫匹羅星的水凝膠對于MRSA具有很好的擴散抑菌效果。表明該CS-AC/DTT 水凝膠在制備載藥及抗菌材料方面具有潛在應用。