ITO 平面微電極上P(VDF-TrFE)薄膜的制備及性能表征

沈淑嫻，何旭昭，董靈慶，程 逵，翁文劍

(浙江大學材料科學與工程學院，浙江杭州 310027)

1 前 言

生物電廣泛存在于人體之中，內(nèi)源性電場在調(diào)節(jié)諸如胚胎發(fā)生、傷口愈合、組織修復與重塑等許多生物學過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[1-4]。受骨骼自然壓電特性的啟發(fā)[5]，通過采用外源的電刺激并提供適當?shù)纳憝h(huán)境來模仿內(nèi)源性電場已被用于調(diào)節(jié)成骨類細胞和干細胞的成骨分化并促進骨骼生長。

McCullen等[6]使用叉指型金電極提供交變電場刺激，結(jié)果表明1 V/cm 強度的電場明顯增強了h ASCs的成骨分化能力。Park等[7]用平行電極在限定的納米管TiO2基底表面附近產(chǎn)生電場，并證明強度為200或400 m V/cm 的恒定電場誘導了MSCs的成骨分化。Thrivikraman 等[8]使用細胞外基質(zhì)涂覆的導電聚苯胺模擬骨組織微環(huán)境，將細胞間歇性暴露在耦合產(chǎn)生的電場中，結(jié)果顯示h MSCs的成骨分化潛能顯著增強。Hu等[9]證明了導電的聚吡咯薄膜可支持350 m V/cm 的電場刺激，并且恒定電場促進了r BMSCs細胞外基質(zhì)中的鈣沉積。

在這些研究中，電場的產(chǎn)生主要通過平行電極、平面電極、電容耦合或電感耦合來施加電信號[10]。與其他傳統(tǒng)的裝置相比，具有叉指型陳列的平面微電極在電極上方、下方和垂直于電極方向均能產(chǎn)生電場；極小的電極間隔類似生理特征尺寸，僅需要較小的電壓即可產(chǎn)生生理所需的電場強度，不易產(chǎn)生電化學效應(yīng)；電場被定位在電極緊鄰處且近似于平行，細胞所處的電場刺激是恒定的[6，11-13]。但是，平面電極在產(chǎn)生電場的同時必然伴隨著微電流，而且由于叉指型的設(shè)計電極的表面成分必然不均勻，而表面覆膜的方式恰恰可以消除由此帶來的影響。

聚偏氟乙烯三氟乙烯P(VDF-Tr FE)作為一種重要的鐵電聚合物，具有優(yōu)良的生物相容性、耐腐蝕性等特性，P(VDF-Tr FE)基材料被廣泛應(yīng)用于骨組織修復[14-15]。Tang等[16]在Ti表面制備了一層P(VDFTr FE)薄膜，證明極化后的P(VDF-Tr FE)顯著提高了MC3T3-E1細胞的成骨分化能力。Lopes等[17]發(fā)現(xiàn)BTO/P(VDF-Tr FE)復合膜能夠顯著促進骨缺陷中的新骨形成，同時骨組織與P(VDF-Tr FE)之間形成了一層連接組織，這表明P(VDF-Tr FE)與骨組織之間的界面結(jié)合十分緊密。另外，P(VDF-Tr FE)具有獨特的電響應(yīng)活性，包括鐵電性、壓電性、熱釋電性，是一種非常具有研發(fā)潛力的材料[18-21]。

因此，本研究采用平面微電極覆膜的方式，通過旋涂法在ITO 電極上涂覆P(VDF-Tr FE)薄膜。通過改變不同的工藝參數(shù)來調(diào)控薄膜的致密度、厚度和絕緣性能，進而篩選出在電刺激時只顯示純電場作用的樣品。然后對純電場刺激影響MSCs生長行為進行簡單的生物學評價。

2 實 驗

2.1 原材料

P(VDF-Tr FE)(70/30)粉末，純度≥99.0%；ITO基板，尺寸為10 mm×10 mm×1mm，電極寬度和間隔為500μm；N，N-二甲基-甲酰胺(DMF)，純度≥99.5%；丙酮，純度≥99.7%；無水乙醇，純度≥99.7%。

2.2 儀器設(shè)備

分析天平，TG-382-A；磁力攪拌器，C-MAG HS4；鼓風干燥箱，DHG-9070AS；勻膠機，KW-4A；馬弗爐，KSL-1200X-J；超凈臺，HCW-HS；三氣培養(yǎng)箱，HF100；離心機，TDZ5-WS；滅菌鍋，GI54T；高速離心機，Neofuge 13R。

2.3 ITO 上涂覆P(VDF-Tr FE)薄膜的制備

按照圖1所示的流程，先稱取一定量的P(VDFTr FE)粉末溶于DMF 中，磁力攪拌2 h 直至完全溶解。再用移液槍量取100μL 溶液滴于清洗干凈的ITO 基板中心，以4000 rpm 的轉(zhuǎn)速高速旋轉(zhuǎn)60 s使其分散均勻。然后將基板置于烘箱干燥2 h 直至DMF完全蒸發(fā)，最后經(jīng)過退火處理即可。

圖1 旋涂法制備P(VDF-Tr FE)薄膜的流程圖Fig.1 Illustration for preparation of P(VDF-Tr FE)films on ITO by spin-coating

2.4 薄膜的材料學表征

將潔凈的樣品進行噴金預處理。通過場發(fā)射掃描電子顯微鏡(SEM，SU-70)觀察薄膜的表面形貌。測試電壓為3 k V。

將ITO 基板上的薄膜刮凈一部分，自制一個臺階，均勻選取若干個點，通過表面輪廓儀(DEKTAKXT)對涂膜進行接觸式測量，測得臺階的高度差即為薄膜的厚度。

采用由計算機控制的電化學工作站(CHI660D)，將ITO 基板的一側(cè)用作工作電極，另一側(cè)用作參比電極，在電解液中進行電化學分析。在不同電壓的雙相脈沖信號下收集充放電曲線。在施加某一電壓時，曲線的某一充電周期內(nèi)電流對時間的積分即為在該脈沖信號下通過薄膜的電荷量。

通過掃描開爾文探針顯微鏡(NTEGRA Spectra C)測量正負電極在薄膜表面處的電壓差。使用的探針是市售的涂Pt的硅懸臂(HA_FM/Pt)，頻率為49 k Hz，振幅為0.5 V(峰值峰)。

2.5 電刺激流程

將覆膜的ITO 電極置于由聚四氟乙烯(PTFE)制成的細胞培養(yǎng)裝置中，如圖2所示。將帶有Pt絲的兩個壓塊用塑料螺釘分別固定在電極導帶兩端，使Pt線與導電條帶緊密接觸，然后將兩端的鉑絲分別引出連接到信號發(fā)生器(DG1022)，對被測樣品施加不同電壓的電刺激。

圖2 電刺激細胞培養(yǎng)裝置示意圖Fig.2 Device for electrical stimulation and culturing of cells

2.6 細胞行為評價

2.6.1 細胞培養(yǎng) 本研究使用的是大鼠股骨和脛骨中的第3～4 代間充質(zhì)干細胞(MSCs)。將MSCs培養(yǎng)在溫度為37 ℃、CO2含量為5%的濕潤氣氛中，使用的培養(yǎng)基含有α-改性的MEM 必需培養(yǎng)基和10%胎牛血清，并添加1%丙酮酸鈉、1%MEM 非必需氨基酸和含有1×104單位/m L 青霉素和10 mg/m L鏈霉素的1%抗生素溶液。在細胞培養(yǎng)期間，每兩天更換培養(yǎng)基。在進行電刺激前，細胞均需預先培養(yǎng)1天，使細胞在電極上充分粘附和鋪展[22]。

2.6.2 細胞粘附與增殖 將MSCs以2×104個/cm2的密度接種在PTFE 培養(yǎng)裝置中的樣品上。分別在培養(yǎng)1天和3 天后，使用細胞計數(shù)試劑盒(CCK-8)測定樣品上細胞的粘附和增殖。先將樣品轉(zhuǎn)移到新的24孔板中，然后將500μL 新鮮的培養(yǎng)基和50μL CCK-8溶液添加到每個孔中。在37℃下孵育3 h后，將溶液分配到新的96孔板中，并用酶標儀(MK3)測量在450 nm處的吸光度。

2.6.3 細胞ALP活性 堿性磷酸酶(ALP)活性代表了細胞的初始成骨分化程度。將MSCs 以2×104個/cm2的密度接種在PTFE 培養(yǎng)裝置中的樣品上。培養(yǎng)7天后，先將樣品轉(zhuǎn)移至新的24孔板中，并用PBS洗滌3次。再用Cel Lytic緩沖液將樣品上的細胞裂解，并把獲得的細胞裂解液在4 ℃下高速離心15 min。然后收集上清液，用ALP試劑盒進行反應(yīng)測試。最后用酶標儀測量在405 nm 處的吸光度。單位細胞的ALP活性表示為總ALP 活性除以在BCA 蛋白質(zhì)分析中測試的總蛋白質(zhì)含量。

2.6.4 細胞的形態(tài) 將MSCs以2×103個/cm2的密度接種在PTFE培養(yǎng)裝置中的樣品上。分別在培養(yǎng)1天和3天后，將樣品轉(zhuǎn)移至新的24孔板中，并用PBS洗滌3次。然后加入用PBS稀釋的4μM Calcein-AM。在37℃下孵育30 min后，用倒置熒光顯微鏡(NIB900)在綠色熒光下觀察細胞的形態(tài)，并攝像。

3 結(jié)果與討論

3.1 ITO 電極上P(VDF-Tr FE)薄膜的制備

采用旋涂法在ITO 平面電極上制備P(VDFTr FE)薄膜，通過調(diào)節(jié)P(VDF-Tr FE)溶液濃度(質(zhì)量分數(shù))和旋涂層數(shù)來探究不同制備條件下薄膜的表面形貌、厚度和電化學特性，通過優(yōu)選得到致密絕緣且厚度足夠小的P(VDF-Tr FE)薄膜。

3.1.1 薄膜的表面形貌 圖3是在不同溶液濃度和旋涂層數(shù)條件下制備的P(VDF-Tr FE)薄膜的SEM照片。當溶液濃度為3%，旋涂1 層時，P(VDFTr FE)在基板上仍大范圍空缺并未成膜；隨著旋涂層數(shù)的增加，空缺逐漸被填補；但即使增加至5層，表面仍存在著大量的不規(guī)則孔洞而難以成膜。當溶液濃度為5%，旋涂1層時，孔洞與P(VDF-Tr FE)面積相當；隨著旋涂層數(shù)的增加，孔洞面積逐漸減小，形狀趨于圓形，P(VDF-Tr FE)逐漸成膜；旋涂5層時薄膜基本致密。同樣的，當溶液濃度為7%、旋涂至3層時微孔消失，薄膜基本致密；溶液濃度為9%的樣品旋涂1層即無明顯孔洞而顯示致密。P(VDF-Tr FE)薄膜中的晶須也均隨著孔洞的減少而逐漸增多加長。

由此可見，旋涂法制備P(VDF-Tr FE)薄膜的合適成膜濃度在3%以上。當溶液濃度相同時，薄膜的孔洞數(shù)量和面積會隨著旋涂層數(shù)的增加而減少；當旋涂層數(shù)相同時，溶液濃度增加會明顯改善薄膜的孔隙率，因此溶液濃度的提高和旋涂層數(shù)的疊加均是消除微孔、提高薄膜致密度的有效手段。

3.1.2 薄膜的厚度 圖4是不同溶液濃度和旋涂層數(shù)條件下制備的P(VDF-Tr FE)薄膜的厚度圖。薄膜的厚度隨溶液濃度和旋涂層數(shù)的增加而增加，但它們對薄膜厚度的貢獻明顯不同。溶液濃度對于薄膜厚度的大小起主要決定作用，而旋涂層數(shù)則僅使薄膜厚度產(chǎn)生小范圍波動，旋涂層數(shù)對厚度的影響程度也隨著濃度的增加而加大。這是由于當濃度較小時，薄膜孔洞較多，旋涂時溶液會優(yōu)先去填補空缺處，所以層數(shù)的增加對厚度的影響較?。划敐舛容^大時，薄膜趨于致密，旋涂層數(shù)的增加自然就促進了厚度的增長。

圖3 不同濃度和旋涂層數(shù)制備的P(VDF-Tr FE)薄膜的表面形貌照片F(xiàn)ig.3 Surface morphologies of P(VDF-Tr FE)films prepared with different concentrations and spin coating layers

圖4 不同濃度和旋涂層數(shù)條件下制備的P(VDF-Tr FE)薄膜的厚度Fig.4 Thickness of P(VDF-Tr FE)films prepared with different concentrations and spin coating layers

值得注意的是，由旋涂法制得的P(VDF-Tr FE)薄膜的厚度大多都不超過1μm。因此，旋涂法可以獲得納米級薄膜，通過對溶液濃度和旋涂層數(shù)的控制可實現(xiàn)對薄膜厚度“粗+細”的雙重調(diào)控。

3.1.3 覆有薄膜的ITO 電極的電化學響應(yīng)分析 如圖5所示，對覆有不同工藝條件下制備的P(VDFTr FE)薄膜的ITO 電極，施加不同電壓的雙脈沖信號，積分得到相應(yīng)電壓下周期內(nèi)通過的電荷量?？梢钥吹?，與未覆膜的ITO 電極相比，所有覆膜的ITO 電極上通過的電荷量均明顯減少。當溶液濃度為3%時，旋涂層數(shù)即使增加至5層也明顯有電荷通過；當濃度為5%時，旋涂層數(shù)增加至5層時通過的電荷量驟然減少，預計6層可達完全絕緣；當濃度為7%和9%時，旋涂層數(shù)增加至3層時已基本無電荷通過，達到絕緣。

從圖5可見，平面微電極上的P(VDF-Tr FE)薄膜確實起到了一定的電流阻擋作用，其效果可由制備工藝調(diào)節(jié)，提高溶液濃度和增加旋涂層數(shù)都能有效增強薄膜的絕緣能力。然而，P(VDF-Tr FE)薄膜的絕緣能力并不與薄膜的厚度直接相關(guān)，其中可實現(xiàn)完全絕緣的薄膜的最小厚度為470 nm。

綜合考察薄膜的致密度、厚度和絕緣性三者的關(guān)聯(lián)性，由溶液濃度7%、旋涂3 層制備的P(VDFTr FE)薄膜即能均勻致密地覆蓋整個ITO 基板，并可消除因電極圖案化造成的對材料不均勻性的影響；該薄膜絕緣性好，可以完全阻擋電刺激時產(chǎn)生的微電流和可能存在的電化學產(chǎn)物；而且它在致密絕緣薄膜中厚度最小，僅為470 nm，不會過多阻隔電刺激時兩極間產(chǎn)生的電場。因此選取470 nm 薄膜作為本研究后續(xù)實驗的樣品。

3.2 電極電場作用時薄膜表面的電場測試

給P(VDF-Tr FE)薄膜下面的ITO 電極施加一定的電信號，以在薄膜表面處產(chǎn)生電場。通過SKPM 分別測量正極、玻璃、負極的平均表面電勢，計算出不同脈沖電壓下相鄰電極之間的平均電勢差，結(jié)果見圖6所示。250、500、1000和1500 m V 的刺激電壓下薄膜表面處相鄰電極間的電勢差分別為87、205、453 和677 m V，證明電刺激時ITO電極上的P(VDF-Tr FE)薄膜表面確實有電場存在，且電場強度受刺激電壓調(diào)控。

3.3 覆有薄膜的電極對MSCs生長行為的電刺激影響

將樣品置于自制的電刺激裝置中，滅菌后在上面接種MSCs，粘附24 h后，每天施加持續(xù)時間為1 h的雙脈沖電信號，探究不同強度的電場刺激對MSCs的增殖和成骨分化行為的影響。

圖5 不同濃度和旋涂層數(shù)條件下制備的P(VDF-Tr FE)薄膜的電荷-電壓曲線Fig.5 Charge-Voltage curves of P(VDF-TrFE)films prepared with different concentrations and spin coating layers

圖6 電刺激下ITO 正負電極在薄膜表面處的電壓差Fig.6 Voltage difference of ITO positive and negative electrodes at the film surface under electrical stimulation

如圖7A 所示，隨著培養(yǎng)時間從1天增加至3天，細胞數(shù)量明顯增多，說明P(VDF-Tr FE)薄膜具有良好的生物相容性。在細胞培養(yǎng)3天時，經(jīng)電場刺激的細胞均比未刺激的增殖得多，且隨著刺激電壓的增加，MSCs的增殖數(shù)量呈先升高后下降的趨勢，在電壓為250 m V 時的細胞增殖效果最好。圖7C 是相應(yīng)時間的細胞染色圖，可以直觀地看到，與未刺激組相比，250 m V刺激的MSCs顯示出更大的鋪展面積和更多的細胞數(shù)量。隨著培養(yǎng)時間延長至7天，如圖7B 所示，MSCs的ALP活性也呈現(xiàn)相同的類拋物線趨勢，在電壓為250 m V 時達到了最高值。

圖7 電場刺激對MSCs的生長行為的影響 (A)細胞增殖；(B)細胞ALP活性；(C)活細胞染色圖。Fig.7 Effects of electric field stimulation on the growth behaviors of MSCs(A)Proliferation；(B)ALP activity；(C)Cell staining images

綜上所述，電場刺激有利于MSCs的增殖和成骨分化。其中，250 m V 的刺激電壓是促進MSCs增殖和成骨分化能力的最佳刺激條件。

4 結(jié) 論

采用旋涂法在ITO 平面微電極上制備了P(VDF-Tr FE)納米級薄膜，通過改變P(VDF-Tr FE)溶液濃度和旋涂層數(shù)來調(diào)控薄膜的致密度、厚度和絕緣能力，其中致密且絕緣的P(VDF-Tr FE)薄膜的最小厚度為470 nm。該薄膜可以有效地隔絕電刺激時電極上的微電流和可能存在的電化學產(chǎn)物，并消除因電極圖案化造成的材料不均勻性的影響。電刺激能使ITO 上的薄膜表面處產(chǎn)生電場，電場強度受刺激電壓調(diào)控。初步驗證電場刺激能夠促進MSCs的增殖和成骨分化，最佳刺激電壓為250 m V。