腺性膀胱炎差異表達(dá)基因生物信息學(xué)分析及關(guān)鍵基因篩選

胡超，段靈星，梁挺，陳光，魯雄兵

1南昌大學(xué)，南昌330000；2南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院

腺性膀胱炎（CG）是膀胱黏膜的一種增生化生性病變，發(fā)病率為0.1%～1.9%［1-2］。近年來隨著泌尿外科腔鏡技術(shù)的發(fā)展和普及，CG患病率有增加的趨勢［3］。CG缺乏特征性的臨床表現(xiàn)，一般表現(xiàn)為膀胱刺激癥狀、鏡下甚至肉眼血尿，若病變侵犯輸尿管開口，可能出現(xiàn)腰部酸脹等不適［4］。CG的發(fā)病機(jī)制仍不甚清楚，有研究認(rèn)為是移行上皮在慢性刺激因素作用下化生為囊腔，腔內(nèi)柱狀上皮形成進(jìn)而導(dǎo)致病變的發(fā)生［5］。既往有學(xué)者針對部分相關(guān)基因進(jìn)行研究，挖掘其在CG中的作用及潛在機(jī)制，為CG潛在的生物標(biāo)志物和治療靶標(biāo)提供了一定思路［6］。我們綜合以往的報道發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)有研究不足以全面的闡明CG的形成，有關(guān)CG的發(fā)生發(fā)展機(jī)制需要進(jìn)一步探索。受到高通量測序技術(shù)（HTS）與DNA芯片技術(shù)水平大幅提升的影響，基于轉(zhuǎn)錄組、基因組、蛋白質(zhì)組和代謝組等不同層次對疾病進(jìn)行研究已成為全世界學(xué)者的共識。本研究通過對美國國立生物技術(shù)信息中心（NCBI）公共數(shù)據(jù)平臺中的表達(dá)譜芯片原始數(shù)據(jù)進(jìn)行挖掘，獲取CG的差異表達(dá)基因，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并篩選出CG關(guān)鍵基因，旨在為深入揭示CG的分子機(jī)制和治療靶點提供研究方向和理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 芯片數(shù)據(jù)來源介紹 從NCBI公共數(shù)據(jù)平臺基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫（GEO，http：/www.ncbinlm.nih.gov/geo）下載CG相關(guān)基因芯片數(shù) 據(jù) 集GSE11783（https：//www.ncbinlm.nihgov/geo/query/acc.cgiacc=GSE11783）。該數(shù)據(jù)集基于GPL570平臺采用［HG-U133 Plus 2］Human Genome U133 Plus 2.0 Ar?ray陣列芯片（美國Affymetrix公司）檢測的16例人膀胱組織獲得，包括10例CG病變膀胱組織樣本（GSM298205、GSM298206、GSM298207、GSM298208、GSM298209、GSM298210、GSM298211、GSM298213、GSM298214、GSM402541），6例正常膀胱組織樣本（GSM298203、GSM298204、GSM298212、GSM298215、GSM298216、GSM298217）。

1.2 CG差異表達(dá)基因篩選 下載CG相關(guān)基因芯片數(shù)據(jù)集GSE11783后，運用GEO2R在線分析工具（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/acc=GSE11783）進(jìn)行差異表達(dá)基因篩選，篩選條件為P＜0.05，其中l(wèi)og2FC≥1.0為上調(diào)、log2FC＜-1.0為下調(diào)（FC：CG病例組在熒光信號強(qiáng)度與正常膀胱組織相比的差異倍數(shù)），得出CG相關(guān)差異表達(dá)基因。

1.3 CG差異表達(dá)基因在CG和正常膀胱組織中的表達(dá)觀察 采用R語言limma包繪制CG相關(guān)差異表達(dá)基因熱圖和火山圖，觀察差異表達(dá)基因在CG和正常膀胱組織中的表達(dá)情況。

1.4 CG差異表達(dá)基因生物學(xué)功能、信號調(diào)節(jié)通路分析 借助生物信息學(xué)資源數(shù)據(jù)庫DAVID6.8，采用R語言“enrichplot”以及“ggplot2”，對CG相關(guān)差異表達(dá)基因開展GO分析和KEGG通路富集分析（通過Fisher確切概率法對P值進(jìn)行計算，若P＜0.05，代表“顯著富集”），對差異表達(dá)基因進(jìn)行功能注釋，并分析其中涉及的相關(guān)通路。

1.5 CG差異表達(dá)基因調(diào)控蛋白互作網(wǎng)構(gòu)建及關(guān)鍵基因篩選https：//string-db.org/是目前廣泛用于構(gòu)建蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)的數(shù)據(jù)庫。我們將篩選所得CG相關(guān)差異表達(dá)基因?qū)氲絊TRING11.0數(shù)據(jù)庫中分析，并設(shè)置可信度為0.7，獲得差異表達(dá)基因之間的相互作用關(guān)系。在STRING數(shù)據(jù)庫中獲得差異表達(dá)基因之間的相互作用關(guān)系后，將數(shù)據(jù)下載，然后通過Cytoscape（Version 3.6.1）軟件的“CytoHubba”插件對差異表達(dá)基因編碼蛋白的相互作用進(jìn)行可視化展示，得到PPI網(wǎng)絡(luò)中關(guān)聯(lián)程度最密集的區(qū)域，即本研究篩選到的CG差異表達(dá)關(guān)鍵基因。

2 結(jié)果

2.1 CG膀胱組織中差異表達(dá)基因 通過對芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，以P＜0.05為標(biāo)準(zhǔn)，在CG膀胱組織中我們篩選出154個基因為差異表達(dá)基因，其中發(fā)生上調(diào)的基因有74個，發(fā)生下調(diào)的基因有80個。

2.2 CG差異表達(dá)基因在CG和正常膀胱組織中的表達(dá)情況CG相關(guān)差異表達(dá)基因熱圖和火山圖顯示，差異表達(dá)基因的總體表達(dá)模式與正常膀胱組織存在很大差異，其中CD80、CLEC7A、FCHSD2等74個差異基因在CG中高表達(dá)，在正常膀胱組織中低表達(dá)；CADM2、ZADH2、RFWD2等80個差異基因在CG中低表達(dá)，而在正常膀胱組織中高表達(dá)。

2.3 CG差異表達(dá)基因的生物學(xué)功能、信號調(diào)控通路 獲得CG膀胱組織中差異表達(dá)基因后，采用GO分析和KEGG分析研究CG相關(guān)差異表達(dá)基因中信號通路激活情況。GO分析結(jié)果顯示，CG相關(guān)差異表達(dá)基因主要涉及T細(xì)胞活化與免疫應(yīng)答、淋巴細(xì)胞活化與免疫應(yīng)答、細(xì)胞殺傷調(diào)控、γ-干擾素生成的正調(diào)節(jié)、細(xì)胞殺傷正調(diào)節(jié)、輔助性T細(xì)胞分化正調(diào)控、輔助性T細(xì)胞免疫應(yīng)答調(diào)控、輔助性T17細(xì)胞分化等生物學(xué)功能。P值取0.05時，KEGG通路無顯著富集結(jié)果，調(diào)整Pvalue≤0.336 786，結(jié)果顯示CG相關(guān)差異表達(dá)基因在NOD樣受體信號通路、自身免疫性甲狀腺病變、細(xì)胞因子—細(xì)胞因子受體相互作用、Rap1信號途徑、輔助性T17細(xì)胞分化、（轉(zhuǎn)錄激活因子）JAK-STAT信號途徑、（自然殺傷）NK細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性等信號通路上顯著富集。

2.4 CG差異表達(dá)基因調(diào)控蛋白互作網(wǎng)構(gòu)建結(jié)果及關(guān)鍵基因 通過STRING數(shù)據(jù)庫，我們獲得了一份包含節(jié)點146個、邊70條的PPI互作網(wǎng)絡(luò)（圖1），其中，節(jié)點表示蛋白，邊表示蛋白之間的相互聯(lián)系，節(jié)點度值表示與某節(jié)點相連邊的數(shù)量，節(jié)點度值排序前2位的基因為CD80和CLEC7A。然后，將互作數(shù)據(jù)在Cytoscape軟件中進(jìn)行可視化和關(guān)鍵基因確認(rèn)并展示出來，結(jié)果顯示關(guān)鍵基因分別為CD80和CLEC7A，且兩者之間存在較強(qiáng)的相互作用關(guān)系，可能是CG發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵基因，為進(jìn)一步探索CG的發(fā)病機(jī)制、疾病診斷和治療靶點提供了基礎(chǔ)。

圖1 CG差異表達(dá)基因編碼蛋白的PPI網(wǎng)絡(luò)

3 討論

CG屬于膀胱黏膜的一類異常增生性病變，其存在高復(fù)發(fā)表現(xiàn)，病情達(dá)一定程度會對患者正常生活產(chǎn)生影響［7］。CG臨床表現(xiàn)并無特異性，確診主要依賴于病理學(xué)檢查，鏡檢除見上皮細(xì)胞巢，腺體和小囊腫外，在固有膜內(nèi)尚存在不同程度的漿細(xì)胞浸潤［8］。目前，大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為CG的發(fā)生發(fā)展是一個漸進(jìn)的過程，可能與結(jié)石、炎癥等慢性刺激有關(guān)，深入挖掘與探明CG病機(jī)，對于早期診治該病發(fā)揮著關(guān)鍵作用［9］。本研究應(yīng)用生物信息學(xué)方法，對CG基因芯片GSE11783數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，篩選出CG相關(guān)差異表達(dá)基因，并采用GO分析、KEGG分析了差異表達(dá)基因富集的信號通路，接著通過PPI互作網(wǎng)絡(luò)分析了CG差異表達(dá)關(guān)鍵基因。

本研究顯示，在篩選出的差異表達(dá)基因中上調(diào)的基因有74個、下調(diào)的基因有80個，經(jīng)GO分析發(fā)現(xiàn)這些基因主要參與T細(xì)胞活化及免疫應(yīng)答、淋巴細(xì)胞活化及免疫應(yīng)答、細(xì)胞殺傷調(diào)節(jié)等生物學(xué)行為，來誘導(dǎo)CG的發(fā)生發(fā)展。經(jīng)KEGG通路富集分析可知，差異表達(dá)基因顯著富集于NOD樣受體信號途徑、自身免疫性甲狀腺病變、細(xì)胞因子及其受體互作、JAK-STAT信號途徑等。增生的上皮組織腺體化形成囊腔，腔內(nèi)柱狀上皮形成是CG的基本病理特征［10］。ACOSTA等發(fā)現(xiàn)，臨床少見的高危型CG如腸腺瘤樣CG，可能具有潛在的致癌基因變異，可將其視為癌前病變［11］。已有研究證實，P27蛋白、rasP21基因表達(dá)、TNF-α、IFN-γ、IL-2等對于CG的形成發(fā)揮著關(guān)鍵性影響，且淋巴細(xì)胞活化及免疫應(yīng)答、JAK-STAT信號通路、表皮生長因子（TGF）-α同生長因子受體（EGFR）相互作用等信號途徑均與CG的形成相關(guān)［12-19］，與本文研究結(jié)果一致。以上研究表明，CG相關(guān)差異表達(dá)基因參與了病變組織增殖、分化以及免疫調(diào)節(jié)等重要的生物學(xué)過程，其中差異表達(dá)關(guān)鍵基因可能發(fā)揮了十分重要的作用。

CG相關(guān)差異表達(dá)基因編碼蛋白PPI互作網(wǎng)絡(luò)共包含節(jié)點蛋白146個、邊70條，其中的關(guān)鍵基因為CLEC7A、CD80。CLEC7A為一類Ⅱ型膜受體糖蛋白，此蛋白的存在區(qū)域以單核/巨噬細(xì)胞（m?）、中性粒細(xì)胞（NEUT）、樹突狀細(xì)胞（DC）為主［20］。有研究證實，當(dāng)受到外部刺激，或壞死時，m?誘導(dǎo)的C型凝集素（Mincle）可磷酸化其下游的脾酪氨酸激酶（Syk），對NF-κB途徑的活化施以促進(jìn)作用，所得促炎介質(zhì)產(chǎn)物，參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）疾?。ㄖT如腦外傷、缺血性卒中等）中炎癥活動的出現(xiàn)［21］。此外劉倩等發(fā)現(xiàn)，UC患者腸道上皮細(xì)胞可能通過C型凝集素樣受體Dectin-1的表達(dá)，可對腸道內(nèi)異常表達(dá)的霉菌進(jìn)行有效辨識，由此使下游NF-κB信號途徑活化，同時使上皮黏膜盡快分泌IL-23p19等炎癥介質(zhì)，加重腸道炎癥反應(yīng)［22］。CD80也被稱為B7或B7-1，是重要的共刺激分子，在DC、激活態(tài)B細(xì)胞與T細(xì)胞、外周血單核細(xì)胞、m?等內(nèi)的存在形式一般為單體。有研究發(fā)現(xiàn)，DC通過異常表達(dá)CD80、CD86及相關(guān)細(xì)胞因子，使得Th1細(xì)胞分化減少、Th2細(xì)胞活化增多并活性增強(qiáng)，導(dǎo)致變應(yīng)性哮喘患兒的氣道炎癥更為嚴(yán)重［23］。鼻息肉屬于一類炎癥性病變，此病的發(fā)生同諸多不同因素相關(guān)，已有研究提出DC在鼻息肉產(chǎn)生方面起到關(guān)鍵性影響，在DC表面分布的CD80與CD86結(jié)合自身受體后，可導(dǎo)致T細(xì)胞異常增生分化，從而產(chǎn)生Th1/Th2紊亂后果，在很大程度上影響了鼻息肉的免疫病理結(jié)果［24］。本研究發(fā)現(xiàn)，CLEC7A基因主要富集于T細(xì)胞活化（GO：0042110），而CD80的富集以Th細(xì)胞分化正調(diào)控為主，就生物學(xué)活性而言，其同樣富集于T細(xì)胞活化（GO：0045624）。先前實驗證實，CG女性患者中，數(shù)量可觀的T細(xì)胞分布于膀胱黏膜下，此細(xì)胞浸潤狀況顯著相關(guān)于臨床病理分期［16］。進(jìn)而可知，此項研究明確的差異表達(dá)基因在可靠性方面有所保障，但尚缺乏基礎(chǔ)研究方面的證據(jù)支持。

總之，CG樣本中相關(guān)差異表達(dá)基因有154個，主要參與T細(xì)胞活化及免疫應(yīng)答、淋巴細(xì)胞活化及免疫應(yīng)答、NOD樣受體、細(xì)胞因子—細(xì)胞因子相互作用等信號通路；CLEC7A與CD80為蛋白網(wǎng)絡(luò)作用的關(guān)鍵基因，可能是CG發(fā)生發(fā)展的潛在靶點。