食品中雞源性成分標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法的比較性研究

王瑩 尚亞寧 鄒寒艷 張伶俐

摘 要：為比較食品中雞源性成分的標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法，本試驗(yàn)對(duì)3種標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)的引物計(jì)、方法及靈敏度進(jìn)行比較。結(jié)果顯示，實(shí)時(shí)熒光PCR法引物特異性好、方法簡(jiǎn)便、靈敏度高。因此得出結(jié)論，兩種實(shí)時(shí)熒光PCR法均可作為雞源性成分檢測(cè)的補(bǔ)充方法。

關(guān)鍵詞：肉制品? 實(shí)時(shí)熒光PCR? 雞源性成分

肉類是人體重要的營(yíng)養(yǎng)來(lái)源，與人們的生活息息相關(guān)，肉制品的質(zhì)量安全已成為備受關(guān)注的熱門話題。目前，肉制品市場(chǎng)仍然存在“以次充好、摻雜使假”的現(xiàn)象，如不法企業(yè)用大量相對(duì)廉價(jià)的雞肉、鴨肉摻雜少量的牛羊脂肪、骨粉等，然后通過(guò)各種深加工手段來(lái)冒充牛羊肉以牟取高額利益，這不僅侵害了消費(fèi)者的權(quán)益，更會(huì)直接影響消費(fèi)者的健康。隨著國(guó)家食品安全監(jiān)管體系的完善，僅靠感官評(píng)價(jià)來(lái)鑒別肉類真?zhèn)蔚膫鹘y(tǒng)形式已不能滿足對(duì)肉制品摻假的監(jiān)控需求。

為滿足市場(chǎng)監(jiān)管和消費(fèi)者的需要，對(duì)食品中動(dòng)物源性成分進(jìn)行鑒定已成為越來(lái)越多研究者關(guān)注的熱點(diǎn)[1]。目前，我國(guó)建立了一系列基于PCR技術(shù)的動(dòng)物源性成分檢測(cè)的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)[2-3]，但是有關(guān)畜禽肉中雞源性成分檢測(cè)的研究報(bào)道較少[4]?，F(xiàn)行的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《動(dòng)物源性產(chǎn)品中雞源性成分PCR檢測(cè)方法》（SN/T 2978-2011）[5]中采用傳統(tǒng)PCR后電泳染色的方法，其靈敏度較低，需要電泳和測(cè)序，操作復(fù)雜，且電泳所用的核酸染料會(huì)對(duì)環(huán)境造成污染。因?yàn)閷?shí)時(shí)熒光PCR在靈敏度、準(zhǔn)確度、便捷性方面均高于普通PCR，所以本研究主要針對(duì)兩種檢測(cè)雞源性成分的實(shí)時(shí)熒光PCR法與現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行比較，旨在為后續(xù)雞源性成分的檢驗(yàn)工作提供補(bǔ)充檢驗(yàn)方法，并為監(jiān)管部門提供更有力的技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料

新鮮雞肉，購(gòu)自重慶市本地超市;DNA提取試劑盒：TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0，實(shí)時(shí)熒光PCR DNA檢測(cè)試劑盒：TaKaRa Premix Ex Taq? （Probe qPCR），瓊脂糖，DNA Marker，均購(gòu)自TaKaRa公司;2×Power Taq PCR Master Mix，購(gòu)自百泰克公司。

1.1.2 儀器

Tprofessional PCR儀，德國(guó)Biometra公司;Lightcycler 480 II熒光定量PCR儀，瑞士Roche公司;NANO DROP ONE微量核酸分析儀，Thermo公司;Tanon-4500SF凝膠成像系統(tǒng)，上海天能公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 DNA提取

將新鮮雞肉攪碎至肉糜狀，參照試劑盒說(shuō)明書提取DNA，然后用微量核酸分析儀測(cè)定濃度，并于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 PCR擴(kuò)增

引物與探針由華大基因合成，方法1為SN/T 2978-2011，方法2為SZDB/Z 267-2017[6]，方法3為SB/T 10923-2012[7]，3種方法的PCR反應(yīng)體系、擴(kuò)增程序及引物探針序列信息詳見(jiàn)表1。

1.2.3 3種方法靈敏度的比較

將雞肉的DNA濃度分別稀釋至200、100、10、1ng/μL及100、10、1、0.1pg/μL這8個(gè)梯度，并用3種方法進(jìn)行試驗(yàn)。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品基因組DNA提取

新鮮雞肉未經(jīng)過(guò)深加工，故富含大量且完整的DNA，易于提取。按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，提取雞肉DNA濃度為325.8ng/μL，A260/280為1.89，DNA純度高、質(zhì)量較好，可以滿足后續(xù)PCR檢測(cè)需求。

2.2 3種方法的引物比對(duì)結(jié)果

將3種方法的引物在NCBI進(jìn)行比對(duì)分析，3種引物的模板來(lái)源均為雞線粒體，但不位于同一個(gè)基因;3種模板序列的同源性為45.48%，參見(jiàn)圖1。

2.3 3種方法PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.3.1 普通PCR

按照方法1進(jìn)行PCR擴(kuò)增，未能擴(kuò)增出單一DNA條帶，將引物濃度擴(kuò)大10倍、100倍和1000倍，結(jié)果在將引物濃度擴(kuò)大1000倍，即引物濃度為10μmol/L時(shí)能擴(kuò)增出陽(yáng)性條帶。對(duì)陽(yáng)性條帶進(jìn)行測(cè)序，其片段大小正確，且與雞線粒體DNA相對(duì)應(yīng)片段的序列同源性為100%，結(jié)果見(jiàn)圖2中A和D。

2.3.2 熒光定量PCR

運(yùn)用方法2和方法3進(jìn)行擴(kuò)增，陰性對(duì)照和空白對(duì)照均未出現(xiàn)擴(kuò)增曲線。方法2的陽(yáng)性對(duì)照和樣品有典型的擴(kuò)增曲線，循環(huán)數(shù)（Ct值）分別為12.735和16.78;方法3的陽(yáng)性對(duì)照和樣品有典型的擴(kuò)增曲線，循環(huán)數(shù)（Ct值）分別為12.225和16.69，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖2中B和C。

2.4 3種方法靈敏度的比較

方法1為普通PCR法，在DNA濃度為10ng/μL時(shí)可以擴(kuò)增出陽(yáng)性條帶，該方法的靈敏度為10ng/μL。方法2和方法3為熒光定量PCR，方法2在DNA濃度為1pg/μL時(shí)，Ct值為36.64，當(dāng)Ct值大于35時(shí)，重復(fù)實(shí)驗(yàn)有可能會(huì)出現(xiàn)陰性結(jié)果，故該方法的靈敏度應(yīng)為10pg/μL;方法3在DNA濃度為0.1pg/μL時(shí)，Ct值為36.91，故方法3的靈敏度應(yīng)為1pg/μL。由此可見(jiàn)，熒光定量PCR的靈敏度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于普通PCR，結(jié)果見(jiàn)圖3。

3 結(jié)束語(yǔ)

近年來(lái)，以物種DNA為鑒定基礎(chǔ)的PCR技術(shù)已經(jīng)被廣泛用于動(dòng)物源性成分的鑒別[8-10]，而高質(zhì)量、高純度及結(jié)構(gòu)完整的基因組DNA是影響PCR擴(kuò)增的重要因素，故快速、穩(wěn)定、優(yōu)質(zhì)的DNA提取方法將是PCR擴(kuò)增成功的關(guān)鍵。目前，國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)并使用動(dòng)物肌肉組織DNA的提取方法有很多，其中較常使用的包括SDS法、異硫氰酸胍法[11]、試劑盒法[12]，以及一些以SDS法為基礎(chǔ)的改良方法[13]。根據(jù)劉娜等對(duì)于動(dòng)物肌肉組織DNA提取方法的比較，發(fā)現(xiàn)試劑盒法操作簡(jiǎn)單、快速、安全，提取DNA的純度、濃度及穩(wěn)定性均優(yōu)于其他方法[14]，所獲得的核酸樣本可以在低溫條件下儲(chǔ)存以便復(fù)核，且各實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)差異較小，故本試驗(yàn)采用試劑盒法提取DNA。

因?yàn)榫€粒體DNA是高等動(dòng)物唯一的核外遺傳物質(zhì)，所以本研究中3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法均采用雞線粒體DNA作為靶基因設(shè)計(jì)特異性引物。線粒體DNA主要以編碼序列構(gòu)成，基因組序列具有高度物種特異性，種內(nèi)的異質(zhì)基因較少[15]，且拷貝數(shù)較多，在食品加工過(guò)程中未完全降解，而動(dòng)物組織細(xì)胞中均含有大量的線粒體[16]。因此，動(dòng)物線粒體DNA是一個(gè)較為理想的可用于動(dòng)物源性成分鑒別的良好靶基因[17-19]。

PCR技術(shù)的發(fā)展為動(dòng)物源性成分的鑒別提供了有效途徑，實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)憑借其特異性好、檢測(cè)周期短、靈敏度高等優(yōu)勢(shì)，提高了食品中動(dòng)物源性成分鑒別的準(zhǔn)確性，應(yīng)用前景廣闊。目前，檢測(cè)豬、牛、羊、馬、驢等動(dòng)物源性成分的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)均采用實(shí)時(shí)熒光PCR法?，F(xiàn)行檢測(cè)雞源性成分的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)為普通PCR法，方法中提供的引物濃度不能達(dá)到檢測(cè)需求。此外，普通PCR還具有較大的局限性，如對(duì)檢測(cè)樣品的形態(tài)要求較高，若樣品為深加工食品或血制品，則其中所含DNA可能無(wú)法滿足檢測(cè)需求而更易出現(xiàn)假陰性結(jié)果[20]，且該方法需要測(cè)序，過(guò)程較為繁瑣，耗時(shí)較長(zhǎng)。因此，研究建立快速、高效、準(zhǔn)確的雞源性成分的檢測(cè)方法尤為重要。本研究通過(guò)比較3種標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法，結(jié)果表明，實(shí)時(shí)熒光PCR法較普通PCR法更加簡(jiǎn)便快速，可以應(yīng)用于日常食品中雞源性成分的檢測(cè)，幫助監(jiān)管部門提高對(duì)肉制品的管控力度，保障人民的食品安全，促進(jìn)肉類產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展。

參考文獻(xiàn)：

[1] 李晶，楊成.5種常見(jiàn)加工肉制品的DNA 提取方法比較以及豬源性成分檢測(cè)[J].食品工程，2019，（2）：56-60.

[2] 《飼料中禽源性成分檢測(cè)方法 實(shí)時(shí)熒光 PCR方法》（SN/T 2727-2010）[S].

[3] 《食品、化妝品和飼料中牛羊豬源性成分檢測(cè)方法 實(shí)時(shí)PCR法》（ GB/T 2051-2008）[S].

[4] 唐修君，樊艷鳳，賈曉旭，等.熒光 PCR 法檢測(cè)畜禽肉中的雞源性成分[J].現(xiàn)代食品科技，2018，34（7）230-234.204.

[5] 《動(dòng)物源性產(chǎn)品中雞源性成分PCR檢測(cè)方法》（SN/T 2978-2011）[S].

[6] 《肉食品中雞源性成分實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法》（SZDB/Z 267-2017）[S].

[7] 《肉及肉制品中動(dòng)物源性成分的測(cè)定實(shí)時(shí)熒光PCR法》（SB/T 10923-2012）[S].

[8] 周正，呂二盼，周巍，等.動(dòng)物源性食品鴨血、豬血DNA 提取方法研究及雙重PCR檢測(cè)[J].食品工業(yè)，2012（33）：161-166.

[9] 鐘偉軍，陳金頂.PCR檢測(cè)飼料中牛源組織成分的研究[J].華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，27（3）：33-36.

[10] 汪永信，安虹，程堅(jiān)，等.雙重實(shí)時(shí)熒光PCR法檢測(cè)食品和飼料中的雞源性成分[J].生物技術(shù)通報(bào)，2012（1）：134-138.

[11] 徐偉麗，杜明，李啟，等.動(dòng)物肌肉組織基因組DNA兩種提方法的比較[J].食品工業(yè)科技，2011，32（12）：81-84.

[12] 楊利麗，劉紅英，楊和軍，等.一種改進(jìn)的異硫氰酸胍法結(jié)合硅膠膜離心吸附柱提取孕婦外周血微量胎兒RNA的方法[J].中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào)，2012（2）：177-181.

[13] 高丹丹，陳燕，王迎華，等.動(dòng)物肉制品基因組DNA的提取和純化[J].食品科技，2007（8）：42-44.

[14] 劉娜，趙新，陳銳，等.動(dòng)物肌肉組織DNA的提取方法及實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)[J].食品工業(yè)科技，2016，37，（18）：74-80.

[15] Momcilovic D， Rasooly A. Detection and analysis of animal materials in food and feed. Journal of Food Protection，2000， 63： 1602-1609.

[16] Tartaglia M， Saulle E， Pestalozza S， Morelli L， Antonucci G， Battaglia P A. Detection of bovine mitochondrial DNA in ruminant feeds： amolecular approach to test for the presence of bovine-derived materials. Journal of Food Protection， 1998， 61： 513-518.

[17] BALLIN N Z， VOGENSEN F K， KARLSSON A H. Species determination： can we detect and quantify meat adulteration [J]. Meat Science， 2009， 83（2）： 165-174.

[18] 何瑋玲，張馳，楊靜，等.食品中4種肉類成分多重PCR的快速鑒別方法[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，45（9）：1873-1880.

[19] 張晶鑫，樊艷鳳，唐修君，等.基于線粒體DNA 16S rRNA基因鑒別畜禽肉中鴨源性成分研究[J].中國(guó)家禽，2016，38（17）：41-44.

[20] 徐慧，馬慧娟.動(dòng)物源性食品鴨血中鴨成分普通PCR檢測(cè)方法探究[J].食品安全導(dǎo)刊，2018（03）：60-61.

作者簡(jiǎn)介：王瑩（1990.10-），女，漢族，籍貫山東，碩士研究生;研究方向：食品藥品檢測(cè);工作單位：重慶市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院。