M1型巨噬細(xì)胞非靶向脂質(zhì)組學(xué)分析*

張?zhí)鹛?，?xiàng)楚涵，夏 勇△，馬禮坤，張步春，△

（1徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院心內(nèi)科，江蘇徐州 221000；2中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)附屬第一醫(yī)院心內(nèi)科，安徽合肥 230001）

動脈粥樣硬化是一種慢性炎癥性疾病，巨噬細(xì)胞在其發(fā)病的各個(gè)階段發(fā)揮十分關(guān)鍵的作用。巨噬細(xì)胞按照其表型和分泌的細(xì)胞因子可分為兩大類，即M1 型巨噬細(xì)胞（經(jīng)典活化型，促進(jìn)動脈粥樣硬化的進(jìn)展）和M2型巨噬細(xì)胞（替代活化型，延緩動脈粥樣硬化的發(fā)展進(jìn)程）［1］。盡管學(xué)術(shù)界已經(jīng)認(rèn)識到巨噬細(xì)胞極化狀態(tài)與動脈粥樣硬化的緊密關(guān)系，但其調(diào)控機(jī)制一直不清楚，其原因是巨噬細(xì)胞極化的信號調(diào)控是一個(gè)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)體系。雖然既往已有研究顯示脂質(zhì)代謝物參與調(diào)控巨噬細(xì)胞亞型的功能［2-4］，然而，在這些研究中所使用的細(xì)胞系和細(xì)胞處理方式不同，所得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也不完全一致。因此，有必要運(yùn)用脂質(zhì)組學(xué)技術(shù)進(jìn)一步篩選M1 型巨噬細(xì)胞極化過程中特異性脂質(zhì)含量變化。

本研究應(yīng)用非靶向脂質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究體外環(huán)境下脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）/干擾素γ（inter?feron-γ，IFN-γ）作用于RAW264.7 巨噬細(xì)胞后，其分泌的脂質(zhì)代謝物含量的變化。通過差異表達(dá)脂質(zhì)分子代謝通路分析，篩選與M1型巨噬細(xì)胞極化相關(guān)的關(guān)鍵信號通路，為動脈粥樣硬化發(fā)病機(jī)制提供新的研究思路和理論依據(jù)。

材料和方法

1 主要試劑

DMEM 高糖培養(yǎng)基（HyClone）；胎牛血清（WISENT）；LPS（Sigma）；IFN-γ（Peprotech）；兔抗CD86 抗體（Biolegend）；兔抗誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）抗體和兔抗GAPDH 抗體（Affinity）；乙腈、異丙醇和甲醇（Thermo Fisher）。

2 細(xì)胞培養(yǎng)

小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7 購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。細(xì)胞在含10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基、溫度為37 ℃、含5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞融合到70%～80%時(shí)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。使用100 μg/L LPS 和20 μg/L IFN-γ 處理RAW264.7細(xì)胞24 h誘導(dǎo)M1型巨噬細(xì)胞。

3 方法

3.1 Western blot 法檢測蛋白表達(dá) 收集細(xì)胞后裂解細(xì)胞，BCA 蛋白測定試劑盒測定蛋白濃度。蛋白樣品電泳分離后半干轉(zhuǎn)。在室溫下用5%脫脂牛奶封閉NC膜1 h，加入Ⅰ抗在4 ℃冰箱中孵育過夜。第2天加入Ⅱ抗在室溫下孵育1 h。通過增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)顯示條帶。

3.2 流式細(xì)胞術(shù) 將處理后的RAW264.7 細(xì)胞（1×106）收集到EP管中。洗清殘余培養(yǎng)基后加入熒光標(biāo)記的抗體CD86-FITC（Biolegend）在4℃冰箱中孵育30 min，PBS 洗掉游離抗體。最后用100 μL PBS 溶液重懸后，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測。

3.3 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（liquid chromatogra?phy-tandem mass spectrometry，LC-MS）非靶向脂質(zhì)組學(xué)檢測 按每個(gè)樣本中加入200 μL 的PBS、40 μL預(yù)冷的色譜級甲醇和800 μL MTBE 提取脂質(zhì)，每加入一種試劑時(shí)都需渦旋混合，用超聲破碎機(jī)超聲20 min，室溫放置0.5 h，14 000×g、10℃離心15 min，取上層有機(jī)相，氮?dú)獯蹈桑缧栝L期保存，需存放于-80℃冰箱。用Q ExactiveTMplus 質(zhì)譜儀（Thermo Sci?entific）和UHPLC Nexera LC-30A（SHIMADZU）對脂質(zhì)樣品進(jìn)行分析。流動相A 相為乙腈-水（6∶4，v/v）、0.1% 甲酸、0.1 mmol/L 氨甲酸鹽；B 相為乙腈-異丙醇（1∶9，v/v）與0.1%甲酸和0.1 mmol/L 氨基甲酸鹽。液相色譜洗脫梯度為：0～2 min，30% B；2～25 min，30%～100% B，25～35 min，30% B。在整個(gè)分析過程中，自動取樣器保持在10 ℃。ESI 條件為噴霧電壓3.0 kV（正離子模式）和2.5 kV（負(fù)離子模式），毛細(xì)管溫度為350℃，S-Lens 射頻水平為50%（正離子模式）和60%（負(fù)離子模式）。在200～1 800（正離子模式）和250～1 800（負(fù)離子模式）的質(zhì)量-電荷比范圍內(nèi)采集全掃描光譜。采用LipidSearch 進(jìn)行峰識別、峰提取、脂質(zhì)鑒定（二級鑒定）等處理。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用LipidSearch（Thermo Scientific）對原始LCMS 數(shù)據(jù)進(jìn)行峰識別、峰提取、脂質(zhì)鑒定（二級鑒定）等處理。對LipidSearch 提取得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，包括單變量統(tǒng)計(jì)分析、多元變量統(tǒng)計(jì)分析、層次聚類分析和相關(guān)性分析等。單變量統(tǒng)計(jì)分析采用Student’st-test/非參數(shù)檢驗(yàn)和變異倍數(shù)分析。多元變量統(tǒng)計(jì)分析包括無監(jiān)督主成分分析（PCA）分析、有監(jiān)督最小二乘法判別分析（PLS-DA）和正交偏最小二乘法判別分析（OPLS-DA）。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1 LPS/IFN-γ誘導(dǎo)M1型巨噬細(xì)胞極化的鑒定

分別應(yīng)用Western blot 和流式細(xì)胞術(shù)檢測M1 型巨噬細(xì)胞表面標(biāo)記，與對照組相比，LPS/IFN-γ 處理后M1 型巨噬細(xì)胞極化標(biāo)志iNOS 和CD86 表達(dá)升高（P＜0.01），見圖1。上述結(jié)果表明，LPS/IFN-γ能夠使體外培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞表型由M0向M1極化。

2 實(shí)驗(yàn)質(zhì)量控制

將分析得到的QC 樣本基峰色譜圖（base peak chromatogram，BPC）進(jìn)行譜圖重疊比較，可以看出樣本的色譜峰響應(yīng)強(qiáng)度和保留時(shí)間基本重疊，說明實(shí)驗(yàn)重復(fù)性好，見圖2。因此用于本實(shí)驗(yàn)儀器的穩(wěn)定性、實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性、數(shù)據(jù)質(zhì)量的可靠性良好。

3 脂質(zhì)分子的單變量統(tǒng)計(jì)分析

單變量統(tǒng)計(jì)分析可以直觀地展示比較組中脂質(zhì)分子的整體差異表達(dá)倍數(shù)情況，圖3 顯示了對照組細(xì)胞和M1 型巨噬細(xì)胞脂質(zhì)代謝物差異分析比較火山圖。本項(xiàng)目正、負(fù)離子模式共鑒定出的脂質(zhì)分子有1 609 種，涉及35個(gè)脂質(zhì)亞類。

4 脂質(zhì)分子的多變量統(tǒng)計(jì)分析

Figure 1.Markers of M1 macrophages were detected by Western blot（A）and flow cytometry（B）.Mean±SD. n=3.**P＜0.01 vs con?trol group.圖1 Western blot和流式細(xì)胞術(shù)檢測M1型巨噬細(xì)胞的表面標(biāo)記物

Figure 2.Total ion flow chromatogram of QC samples.A：BPC overlapping spectrum of the sample in positive ion mode；B：BPC overlapping spectrum of the sample in negative ion mode.In the figure，the abscissa is the retention time of each chromato?graphic peak，and the ordinate is the intensity value of the peak.圖2 QC樣本總離子流色譜圖檢查

本項(xiàng)目實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示用于觀察組間樣本的總體分布趨勢和組間樣本的差異度PCA 模型R2X 值為0.764，表明模型穩(wěn)定可靠，見圖4A。運(yùn)用PLS-DA建立脂質(zhì)表達(dá)量與樣品類別之間的關(guān)系模型對樣品類別的預(yù)測得分圖，見圖4B，其R2Y＞0.998、Q2＞0.988，表明M1 型巨噬細(xì)胞脂質(zhì)成分與對照細(xì)胞比較有顯著差異。OPLS-DA 分析是PLS-DA 的擴(kuò)展，可以濾除與分類信息無關(guān)的信息，將相關(guān)的信息主要集中在第一個(gè)預(yù)測成分。圖4C 可以看出OPLS-DA模型未過度擬合。PLS-DA 和OPLS-DA 模型的置換檢驗(yàn)圖進(jìn)一步說明模型穩(wěn)健性良好，能區(qū)分兩組樣本，見圖4D、E。

Figure 3.The different lipids between control group and M1 group showed in volcano plot.Note：the X-coordinate represents the differentially expressed multiple value after log2 conversion，the Y-coordinate represents the P value after Log10 conversion，and the points in rose red are lipid molecules that meet the screening crite?ria of differentially expressed multiple. n=6（FC ＞1.5 or FC＜0.67，P＜0.05）.圖3 對照細(xì)胞和M1 型巨噬細(xì)胞組差異脂質(zhì)比較分析的火山圖

5 顯著性差異表達(dá)脂質(zhì)分子的篩選結(jié)果

正、負(fù)離子模式下，以變異倍數(shù)分析（fold change analysis，F(xiàn)C）＞1.5 或＜0.67，變量權(quán)重值（variable im?portance for the projection，VIP）＞1，P＜0.05 作為篩選標(biāo)準(zhǔn)，比較對照細(xì)胞組和M1型巨噬細(xì)胞組樣本脂質(zhì)分子的整體差異表達(dá)倍數(shù)情況。從總共1 609 個(gè)脂質(zhì)中篩選出183 個(gè)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異脂質(zhì)，歸屬為9 個(gè)亞類。其亞類分別為：卵磷脂（phosphatidyl?choline，PC）、磷脂酰乙醇胺（phosphatidylethanol?amine，PE）、磷脂酰甘油（phosphatidylglycerol，PG）、磷脂酰肌醇（phosphatidylinositol，PI）、磷酯酰絲氨酸（phosphatidylserine，PS）、甘油三酯（triglyceride，TG）、甘油二酯（diglyceride，DG）、鞘磷脂（sphingo?myelin，SM）和神經(jīng)酰胺（ceramides，Cer）。與對照組比較，M1 型巨噬細(xì)胞組變異倍數(shù)最大且顯著相關(guān)的主要脂質(zhì)成分是PI、PC、SM和TG，見表1。

Figure 4.Pattern recognition analysis between control group and M1 macrophage group（n=6）.A：principal component analysis（PCA）score；B：partial least squares discrimination analysis（PLS-DA）score；C：orthogonal partial least squares discrimi?nant analysis（OPLS-DA）score；D：PLS-DA model replacement test diagram；E：OPLS-DA model replacement test diagram.圖4 對照細(xì)胞和M1型巨噬細(xì)胞組間的模式識別分析

6 顯著性差異脂質(zhì)分子的相關(guān)性分析

顯著性差異脂質(zhì)分子（VIP＞1，P＜0.05）之間的密切程度通過相關(guān)性分析可以進(jìn)一步了解生物狀態(tài)變化過程中脂質(zhì)分子、亞類之間的相互關(guān)系。文中和弦圖列出了M1 型巨噬細(xì)胞極化過程中相關(guān)性系數(shù)|r|＞0.5 且P＜0.05 的差異脂質(zhì)分子的相關(guān)性分析結(jié)果；該圖內(nèi)圈連接線的起點(diǎn)表示差異脂質(zhì)分子，外圈上的弧線表示脂質(zhì)亞類；彩色線條表示亞類內(nèi)部脂質(zhì)分子的相關(guān)性，深灰色線條表示亞類與亞類之間的脂質(zhì)分子相關(guān)，見圖5。從圖中可以看出屬于同一代謝途徑中的代謝物存在高度相關(guān)性，如存在于甘油磷脂通路上的PC、PE、PI 和PS 相關(guān)性較強(qiáng)。當(dāng)代謝通路中的某一物質(zhì)發(fā)生變化時(shí)，同一代謝途徑的其他代謝物也會出現(xiàn)相應(yīng)的改變。

表1 對照細(xì)胞和M1型巨噬細(xì)胞組差異脂質(zhì)成分分析Table 1.Analysis of different lipid components between the control group and the M1 macrophage group

7 差異脂質(zhì)分子代謝通路分析

為了篩選M1 型巨噬細(xì)胞極化過程中差異表達(dá)脂質(zhì)分子的代謝通路，本研究基于前期篩選出的183個(gè)差異表達(dá)脂質(zhì)分子利用MetaboAnalyst 平臺結(jié)合KEGG 數(shù)據(jù)庫開展脂質(zhì)分子代謝通路分析，如圖6 所示，本研究中差異表達(dá)的脂質(zhì)分子與甘油磷脂代謝通路相關(guān)，甘油磷脂代謝通路中有PE、PC 和PS 所在的3個(gè)位置被映射。

討論

脂質(zhì)是組成生物體各種細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的主要成分，脂質(zhì)也是重要的信號分子，早年證據(jù)表明，脂質(zhì)成分變化與癌癥、脂肪肝和動脈粥樣硬化等疾病成因果關(guān)系［5］。近年來脂質(zhì)代謝與炎癥反應(yīng)之間的密切關(guān)系也日益受到關(guān)注，二者相互促進(jìn)，炎癥可導(dǎo)致脂質(zhì)代謝紊亂，而脂質(zhì)代謝失衡也可誘發(fā)炎癥反應(yīng)［6］。鑒于脂質(zhì)分子結(jié)構(gòu)與動脈粥樣硬化的關(guān)系，探索其與疾病相關(guān)的生物學(xué)功能將有望成為干預(yù)動脈粥樣硬化治療的新靶點(diǎn)。

脂質(zhì)組學(xué)是一種能夠高效準(zhǔn)確獲取生物體脂質(zhì)組成與表達(dá)變化的高通量檢測方法。通過脂質(zhì)組學(xué)分析，可以高效地研究脂類家族、脂質(zhì)分子在各種生物過程中的改變與功能，進(jìn)而闡明相關(guān)的生物活動過程與機(jī)制［7］。目前脂質(zhì)組學(xué)主要分為非靶向和靶向分析兩類。其中，非靶向分析模式能夠?qū)崿F(xiàn)對樣本中的各種類型脂質(zhì)進(jìn)行無偏向地系統(tǒng)性解析［8］。本項(xiàng)目采用基于UPLC-LTQ-Orbitrap 質(zhì)譜系統(tǒng)的非靶向脂質(zhì)組學(xué)分析平臺，并結(jié)合LipidSearch 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，發(fā)現(xiàn)M1 型巨噬細(xì)胞活化過程中磷脂、鞘脂和甘油脂表達(dá)量差異明顯。前期有報(bào)道使用靶向質(zhì)譜技術(shù)分別檢測小鼠RAW264.7 巨噬細(xì)胞和人來源的THP-1 巨噬細(xì)胞的分析結(jié)果表明，M1 巨噬細(xì)胞活化過程中PC、PG、PI、PS 和SM 等含量同對照組相比明顯升高［3］，與本研究甘油磷脂分子差異表達(dá)的結(jié)果基本一致。

Figure 5.Correlation analysis results of different lipids between control group and M1-type macrophage group.The chord diagram shows the lipid molecular pairs with cor?relation coefficient |r|＞0.5 and P＜0.05，the starting point of the inner ring connection line represents the dif?ferential lipid molecules，and the arc on the outer ring represents the lipid subclasses.The colored lines indi?cate the correlation of lipid molecules within subclass?es，the lines are of the same color as the subclasses，and the dark gray lines indicate the correlation of lipid molecules between subclasses and subclasses.圖5 對照組和M1 型巨噬細(xì)胞組間差異脂質(zhì)的相關(guān)性分析結(jié)果

磷脂是生物膜的主要成分，分為甘油磷脂與鞘磷脂兩大類，分別由甘油和鞘氨醇構(gòu)成。既往研究報(bào)道磷脂具有促進(jìn)脂肪代謝、防治脂肪肝，降低血清膽固醇、抗動脈粥樣硬化的作用［9］。本研究結(jié)果顯示，PC 類差異物中PC（18：0e/18：1）、PC（16：0/24：1）、PC（36：1e）、PC（42：2）和PC（40：2）等含量明顯上調(diào)。而PE 類差異物中PE（18：0p/20：1）、PE（18：1p/20：2）和PE（38：2e）含量明顯上調(diào)；PE（18：1/22：6）含量明顯下調(diào)。PI 類PI（18：0/18：1）含量較正常組上調(diào)，PI（18：0/20：3）和PI（18：1/20：3）含量下調(diào)。上述結(jié)果提示炎癥導(dǎo)致的M1 型巨噬細(xì)胞極化可以使磷脂代謝發(fā)生紊亂。

Zhang 等［3］采用超臨界流體色譜和離子淌度質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析了從人外周血提取的單核源巨噬細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)膜磷脂改變導(dǎo)致的血栓素A2 是M1 型巨噬細(xì)胞極化的一個(gè)特異性標(biāo)記物［3］。來自歐洲的人群研究顯示血清磷脂含量是預(yù)測糖尿病患者發(fā)生心腦血管事件的監(jiān)測指標(biāo)［10］。人體血清非靶向脂質(zhì)組學(xué)分析研究也進(jìn)一步證實(shí)了磷脂代謝紊亂與亞臨床冠心病相關(guān)［11］。

Figure 6.Based on the characteristic metabolites and KEGG database select the major metabolic pathways.圖6 基于特征性代謝物和KEGG數(shù)據(jù)庫篩選出的發(fā)生變化的主要代謝通路

甘油酯通常是指由甘油和脂肪酸（含飽和和不飽和脂肪酸）經(jīng)酯化所生成的酯類。甘油酯是血脂的成分之一，扮演貯存與輸送的角色，大部分存在于乳糜微粒及極低密度脂蛋白內(nèi)。甘油酯和膽固醇都是造成動脈粥樣硬化的危險(xiǎn)因子［12］.。本研究脂質(zhì)組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，M1 型巨噬細(xì)胞組升高較明顯的成分是TG（16∶0/14∶0/16∶0）、TG（18∶0/18∶1/18∶1）、TG（18∶0/18∶0/18∶1）和TG（18∶0/18∶0/20∶2），這與文獻(xiàn)報(bào)道脂質(zhì)代謝重編程被認(rèn)為是巨噬細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換的物質(zhì)基礎(chǔ)相一致［13］。

鞘脂水解產(chǎn)物為神經(jīng)酰胺和磷酸膽堿，鞘脂及其代謝產(chǎn)物不僅是構(gòu)成細(xì)胞膜的重要結(jié)構(gòu)分子，而且參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長、分化、衰老和細(xì)胞程序性死亡等許多重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)［14］。Abuawad 等［4］基于液相色譜質(zhì)譜方法測定了GM-CSF、LPS/IFN-γ 誘導(dǎo)下的THP-1 巨噬細(xì)胞極化的代謝譜，通過與代謝數(shù)據(jù)庫的比較，明確了巨噬細(xì)胞不同的極化方向具有不同的代謝特征，其中M1型巨噬細(xì)胞極化時(shí)鞘脂和嘧啶代謝具有顯著的改變。SM 作為鞘脂類一種成分，其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑可能在致血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡、引起泡沫細(xì)胞形成和平滑肌細(xì)胞增殖等動脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用［15］。本研究結(jié)果也顯示，對照細(xì)胞SM 含量較M1型巨噬細(xì)胞降低，提示M1型巨噬細(xì)胞活化與鞘磷脂代謝有關(guān)。

本研究基于LC-MS 技術(shù)結(jié)合多元變量數(shù)據(jù)分析方法在M1 型巨噬細(xì)胞極化過程中共鑒定出183 個(gè)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異脂質(zhì)分子，其中顯著相關(guān)的主要脂質(zhì)成分是PI、PC、SM 和TG。代謝通路分析顯示差異脂質(zhì)分子與與甘油磷脂代謝通路相關(guān)。