加味黃芪建中湯通過調(diào)節(jié)miR-516a-5p治療血小板減少癥*

楊 陽，胡美薇，傅麗娟，成 志，鄭兵榮，陳春梅，胡蓮波

（浙江中醫(yī)藥大學附屬第二醫(yī)院，浙江杭州 310005）

原發(fā)性免疫性血小板減少癥（immune thrombo?cytopenia，ITP）是一種血液系統(tǒng)常見的獲得性自身免疫性疾病，既往也稱為特發(fā)性血小板減少性紫癜（idiopathic thrombocytopenic purpura，ITP），主要發(fā)病機制為患者對自身血小板抗原的免疫失耐受，產(chǎn)生體液免疫和細胞免疫介導的血小板過度破壞與血小板生成受抑，導致血小板減少，臨床上主要表現(xiàn)為出血，包括皮膚黏膜出血、內(nèi)臟出血和顱內(nèi)出血等［1］。近年來有研究表明，除了抗體介導血小板破壞的ITP經(jīng)典發(fā)病機制外，細胞免疫失調(diào)也參與ITP 的發(fā)病，其中CD4+T 細胞在ITP 的病理過程中發(fā)揮重要的作用［2-4］。Treg 細胞的減少導致Th17/Treg 失衡，引起的免疫調(diào)節(jié)功能紊亂可參與ITP 的發(fā)?。?-7］。因此，調(diào)節(jié)CD4+T 細胞向Treg 細胞分化可能成為治療ITP 的一個有效措施。

微小RNA（microRNA，miRNA，miR）是一類由內(nèi)源基因編碼的高度保守非編碼單鏈RNA，大小約為18～25 個核苷酸，其主要通過誘發(fā)mRNA 降解或抑制蛋白合成的方式負調(diào)控靶基因，在疾病的發(fā)生發(fā)展過程中起多種調(diào)節(jié)作用［8-9］。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA可通過靶向目的基因調(diào)節(jié)機體免疫細胞狀態(tài)，對固有免疫和適應性免疫發(fā)揮著重要作用，且參與了自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展［10-13］。加味黃芪建中湯（modified Huangqi-Jianzhong decoction）由黃芪、桂枝、白芍、大棗、生姜、飴糖、炙甘草、菟絲子和枸杞子等藥組成，出自《金匱要略·血痹虛勞病脈證并治》。筆者前期總結(jié)發(fā)現(xiàn)對于脾腎陽虛型血證，運用加味黃芪建中湯可溫補脾腎、養(yǎng)血止血，取得較好療效［14］。本研究通過對ITP 患者和健康人群CD4+T 細胞的miR-516a-5p 表達水平進行檢測，并分析ITP 患者miR-516a-5p 表達與血小板數(shù)量之間的相關性；收集地塞米松和加味黃芪建中湯綜合治療患者的CD4+T 細胞，檢測miR-516a-5p、吲哚胺2，3-雙加氧酶IDO 和哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）的蛋白水平及Treg細胞的占比，進一步探究加味黃芪建中湯在治療ITP 過程中通過調(diào)控miR-516a-5p 調(diào)節(jié)免疫細胞的可能機制，為ITP的治療提供新的依據(jù)。

材料和方法

1 臨床資料的收集

1.1 診斷標準 西醫(yī)ITP診斷標準：參考《成人原發(fā)免疫性血小板減少癥診斷與治療中國專家共識（2016年版）》。中醫(yī)診斷標準：中醫(yī)證候辨證為脾腎陽虛型，參照《中藥新藥臨床研究指導原則》和《中醫(yī)診斷學》確定的脾腎陽虛型診斷標準。

1.2 納入標準（1）血小板計數(shù)＜30×109/L；（2）至少2次血常規(guī)檢查示血小板計數(shù)減少，血細胞形態(tài)無異常；（3）脾臟不增大；（4）骨髓檢查：巨核細胞數(shù)增多或正常，有成熟障礙；（5）排除其他繼發(fā)性血小板減少癥；（6）具備主癥2項和次癥2項，參考舌脈；（7）治療前至少兩周未接受過大劑量糖皮質(zhì)激素沖擊治療的患者；（8）知情同意自愿加入本項目的研究者。

1.3 排除標準（1）其他疾病繼發(fā)的血小板減少患者；（2）有重要臟器嚴重損傷者；（3）精神性疾病或妊娠及哺乳期婦女；（4）嚴重出血，如顱內(nèi)出血者；（5）過敏體質(zhì)或已知對受試藥物（單味）過敏者；（6）不合作者，如精神病患者，依從性差，且不愿服用中藥者。

1.4 剔除標準（1）治療期間出現(xiàn)嚴重不良反應的患者；（2）治療期間發(fā)現(xiàn)其他血液系統(tǒng)疾病的患者；（3）治療期間出現(xiàn)嚴重并發(fā)癥危及生命而必須終止治療的患者；（4）患者依從性差，不按醫(yī)囑用藥，臨床療效無法評估者；（5）各種原因致使臨床資料不全，無法統(tǒng)計者。

1.5 一般資料 收集2017 年6 月～2018 年6 月于我院確診的ITP 患者32 例，未治療前收集外周血。按照隨機分組后入組治療：15例為地塞米松（dexameth?asone，DXMS）治療組，17 例為地塞米松與加味黃芪建中湯綜合治療（DXMS+decoction）組，在接受治療2周后復查采集外周血標本；以同期健康體檢者15 例為對照組，排除血小板數(shù)量異常及功能異常等疾病，各組對象在年齡和性別構成上差異無統(tǒng)計學顯著性。本研究經(jīng)本院倫理委員會批準，所有受檢者均知情同意。本研究通過浙江中醫(yī)藥大學附屬第二醫(yī)院倫理委員會審查批準。

2 主要試劑及儀器

Ficoll-Paque PLUS 淋巴細胞分離液（GE Health?care，17-1440-02）；CD4 細胞分選磁珠（Miltenyi Bio?tec，130-045-101；Trizol Reagent（Thermo Fisher Scien?tific，15596018）；逆轉(zhuǎn)錄PCR 試劑盒（Clontech，638315）；SYBR 熒光定量PCR 試劑盒（TaKaRa，RR420A）；FITC-CD4 流式抗體（357404）、Alexa Flu?or?647-FOXP3 流式抗體（320114）和PE-Cy7-CD25流式抗體（302612，BioLegend）；抗IDO 抗體（8630）、抗mTOR 抗體（2983）、抗p-mTOR 抗體（5536）和抗GAPDH 抗體（5174，CST）。Sysmex XE-5000 全自動血細胞分析儀及原裝配套試劑（Sysmex）；實時熒光定量PCR 儀（Applied Biosystems）；冷凍臺式離心機和超微量分光光度計（Thermo）；Western blot 全套系統(tǒng)（Bio-Rad）；流式細胞儀（BD）；倒置顯微鏡（Leica）。

3 方法

3.1 分組和藥物治療 DXMS組：根據(jù)《成人原發(fā)免疫性血小板減少癥診斷與治療中國專家共識（2016年版）》一線治療，使用地塞米松靜脈滴注每天40 mg，連用4 d（地塞米松磷酸鈉注射液由天津金耀集團湖北天藥藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，規(guī)格5 g/L）；DXMS+Decoction 組：在地塞米松治療基礎上給予加味黃芪建中湯加減治療：黃芪60 g、菟絲子30 g、枸杞子15 g、仙鶴草30 g、桂枝12 g、白芍24 g、大棗30 g、生姜9 g、飴糖60 g和炙甘草12 g（中藥材均來源于本院藥房），中藥方劑囑患者日一劑，水煎服，每次200 mL，每日2 次；或選用中藥顆粒劑，每次1 劑，沸水沖至每次150 mL，每日2次。

3.2 血標本的采集及處理 采集所有ITP患者和健康體檢者靜脈血3 mL 于EDTA 抗凝的真空采血管中，并分為2 份。取1 份，應用Sysmex XE-5000 全自動血細胞分析儀檢測血常規(guī)，記錄血小板計數(shù)；另1份全血使用Ficoll 分離液400×g離心30 min，吸取中間外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）細胞層。

3.3 CD4+T 細胞的分選 采用PBSs 清洗PBMCs，4℃條件下進行CD4 磁珠旋轉(zhuǎn)孵育15 min，磁力架分選后洗脫的即為CD4+T 細胞，備用于RNA 提取與流式細胞術檢測。

3.4 總RNA 的提取與RT-qPCR 檢測 利用Trizol法提取CD4+T 細胞總RNA，超微量分光光度計檢測RNA 的濃度及純度，A260/A280在1.8～2.0 為符合miR?NA 的RT-qPCR 檢測要求。根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，將各例總RNA 樣本逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，反應程序為37℃60 min、85℃5 min，-20℃保存?zhèn)溆谩PCR 反應體系為：2×SYBR Green MIX 混合液10 μL，上、下游引物各0.4 μL，cDNA 2 μL，DEPC 處理水7.2 μL。PCR反應程序為：預變性95℃30 s；變性95℃10 s，退火/延伸60℃30 s，共40 個循環(huán)。溶解曲線采用儀器默認程序。每個標本設置3 個復孔，PCR 反應以U6為內(nèi)參照，以2-ΔΔCt法計算miRNA 的相對表達量。miR-516a-5p 的上游引物序列為5′-CTCAACTGGT?GTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGGAAAGTGC-3′，下游引物序列為5′-ACACTCCAGCTGGGTTCTC?GAGGAAAGAAGC-3′；U6 的上游引物序列為5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物序列為5′-AACGCTTCACGAATT TGCGT-3′。

3.5 Western blot 檢測 取磁珠分選獲得的CD4+T細胞，加入RIPA 裂解液，靜置、離心、取上清，以BCA法測蛋白濃度，加上樣緩沖液，煮沸5 min 變性后進行SDS-PAGE；電泳后300 mA 恒流轉(zhuǎn)至PVDF 膜，室溫下用脫脂奶粉封閉2 h，洗膜3 次，加入Ⅰ抗（稀釋比例：目的蛋白1∶1 000，GAPDH 1∶5 000），4℃冰箱孵育過夜，洗膜3次，加Ⅱ抗（稀釋比例為1∶5 000）孵育1 h，洗膜3次，ECL化學發(fā)光后暗室膠片顯影。

3.6 流式細胞術檢測 取PBMCs細胞懸液，吹打混勻后取20 μL 置于流式管內(nèi)，分別用FITC 標記的CD4 抗體、APC 標記的FOXP3 抗體和PE-Cy7 標記的CD25 抗體標記細胞，應用BD FACS Canto Ⅱ流式細胞儀檢測CD4+T 細胞和Treg 細胞占比，結(jié)果導入FlowJo軟件進行整理。

4 統(tǒng)計學處理

應用SPSS 22.0 軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（mean±SD）表示。兩組間比較：符合正態(tài)分布采用t檢驗，非正態(tài)分布采用Mann-Whitney 檢驗。多組間比較采用單因素方差分析。ITP 患者miRNA 表達量與血小板計數(shù)的相關性采用Pearson相關法分析，作圖使用GraphPad Prism 7 軟件，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié)果

1 miR-516a-5p在ITP患者中的表達

收集健康人群和ITP 患者外周血，提取PBMCs后經(jīng)磁珠分選獲得CD4+T 細胞，見圖1A。利用RTqPCR 進行miR-516a-5p 表達量的檢測，與健康人群組相比，ITP 患者組的miR-516a-5p 表達顯著增加（P＜0.01），見圖1B。

Figure 1.The expression of miR-516a-5p in CD4+ T cells of ITP group and normal group.A：sorting ratio of CD4 positive cells in PBMCs；B：relative miR-516a-5p expression in ITP group and normal group.Mean±SD.**P＜0.01 vs normal group.圖1 miR-516a-5p在ITP患者組和健康人群組CD4+T細胞中的表達

2 miR-516a-5p表達水平與血小板計數(shù)的關系

應用GraphPad Prism 7 軟件對ITP 患者的miR-516a-5p 相對表達量與外周血血小板計數(shù)水平進行相關性分析，結(jié)果顯示呈負相關，差異有統(tǒng)計學意義（r=-0.657 5，P＜0.01），見圖2。

Figure 2.The correlation between platelet（PLT）count and miR-516a-5p expression.Mean±SD. n=32.圖2 miR-516a-5p 相對表達量與外周血血小板計數(shù)的相關性分析

3 加味黃芪建中湯治療對miR-516a-5p 的表達量和血小板數(shù)量的影響

與地塞米松治療組比較，地塞米松與加味黃芪建中湯綜合治療組的miR-516a-5p 相對表達量顯著下調(diào)（P＜0.05），見圖3A。與治療前比較，兩組治療后血小板數(shù)量均升高（P＜0.01）；兩組治療后比較，地塞米松與加味黃芪建中湯綜合治療組較地塞米松治療組血小板數(shù)量更高（P＜0.01），見圖3B。

4 IDO/mTOR 蛋白變化的比較及Treg 細胞占比的比較

采用流式細胞術分別檢測CD4+T細胞及Treg細胞比例，結(jié)果顯示，與健康人群組比較，ITP患者治療前CD4+T 細胞和Treg 細胞的占比顯著下調(diào)（P＜0.05或P＜0.01）；與治療前ITP 組比較，地塞米松組和地塞米松與加味黃芪建中湯綜合治療組CD4+T細胞和Treg 細胞比例均顯著上調(diào)（P＜0.05 或P＜0.01）；與地塞米松組比較，地塞米松與加味黃芪建中湯綜合治療組上調(diào)更顯著（P＜0.05），見圖4A、B。Western blot結(jié)果顯示，與ITP治療前組比較，ITP各治療組CD4+T細胞的IDO 表達明顯上調(diào)，而mTOR 的磷酸化程度顯著下調(diào)，其中地塞米松與加味黃芪建中湯綜合治療組變化更為顯著（P＜0.05），見圖4C、D。

討論

Figure 3.Effect of modified Huangqi-Jianzhong decoction on the expression of miR-516a-5p（A）and platelet count（B）.Mean±SD.**P＜0.01 vs ITP group；#P＜0.05 vs DXMS group；△△P＜0.01 vs before treatment；▲▲P＜0.01 vs after treatment in DXMS group.圖3 加味黃芪建中湯對miR-516a-5p相對表達量和血小板數(shù)量的影響

Figure 4.Effect of modified Huangqi-Jianzhong decoction on immune cells and IDO/mTOR signaling pathway.A：the images of flow cytometry for analyzing Treg propotion in each group after treatment；B：the quantitative analysis of A；C：the results of Western blot for detecting the protein levels of IDO，mTOR and p-mTOR.Mean±SD. n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs normal group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs ITP group；&P＜0.05 vs DXMS group.圖4 加味黃芪建中湯通過調(diào)節(jié)miR-516a-5p表達對免疫細胞和IDO/mTOR信號通路的影響

目前，ITP 的發(fā)病機制尚未完全清楚。傳統(tǒng)觀點認為體液免疫異常導致血小板過度破壞及巨核細胞的生成減少和成熟障礙導致血小板數(shù)量銳減，從而導致ITP的發(fā)?。?5］。近年來越來越多的研究表明，細胞免疫異常也在ITP 的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用，其中CD4+T 細胞在ITP 的病理過程中發(fā)揮重要的作用［16-19］。CD4+T細胞可分化為不同的Th細胞亞群，主要有Th1 細胞、Th2 細胞、Th17 細胞和Treg 細胞（調(diào)節(jié)性T 細胞）［20］。Th1 細胞發(fā)揮細胞免疫的效應，而Th2 細胞可輔助B 細胞活化，產(chǎn)生漿細胞及抗體，發(fā)揮體液免疫的作用。Liu等［21］的研究發(fā)現(xiàn)ITP患者的Th1/Th2 比例上調(diào)，同時Th1 細胞因子譜升高。多項研究已證實，ITP 患者存在Th1/Th2 細胞偏移呈Th1 型，進而介導一系列免疫反應導致免疫調(diào)節(jié)紊亂，促進ITP 的發(fā)?。?2-24］。同時，有證據(jù)表明Th17 細胞和Treg 細胞是介導ITP 發(fā)病機理的重要T 細胞亞型。有研究發(fā)現(xiàn)，在ITP 患者中Th17 細胞和細胞因子白細胞介素17（interleukin-17，IL-17）增加［25-26］。另外，在ITP患者中發(fā)現(xiàn)Treg細胞的數(shù)量減少和活性受損［27-28］。Th17 細胞刺激多種細胞促進機體免疫防御，Treg 細胞通過分泌免疫抑制因子來抑制自身反應性T 細胞、B 細胞的增殖而發(fā)揮免疫抑制作用。Treg 細胞的減少導致Th17/Treg 失衡，機體免疫抑制功能減弱，自身免疫異常激活［29］。盡管越來越多的研究發(fā)現(xiàn)Th17/Treg 在許多自身免疫性疾?。ò↖TP）中失衡，但其分子機制尚未完全明確。

miRNA 是一類調(diào)控性小RNA，已被證明在在眾多疾病中表達異常，可能參與了免疫性疾病的發(fā)生、發(fā)展。研究發(fā)現(xiàn)，ITP 患者外周血細胞miRNA 表達譜具有顯著差異。此外，Lu 等［30］證明系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者T 細胞中miR-516a-5p 的表達存在異常，提示miR-516a-5p 可能參與了系統(tǒng)性紅斑狼瘡的發(fā)生與發(fā)展。有報道顯示，miR-133b、miR-370 和miR-516a等通過mTOR 和NF-κB 信號通路調(diào)控胎盤的發(fā)育［31］。本研究發(fā)現(xiàn)，ITP 組的miR-516a-5p 表達水平較健康組上調(diào)，且與血小板計數(shù)呈顯著負相關。通常情況下，血小板計數(shù)越低表明ITP病情越嚴重。可見，miR-516a-5p可能參與了ITP的發(fā)展，其表達水平一定程度上和疾病的嚴重程度相關。

本研究分別收集地塞米松治療ITP 患者和地塞米松與加味黃芪建中湯綜合治療ITP患者的血樣，發(fā)現(xiàn)綜合治療組比地塞米松組的miR-516a-5p 表達量更低，且血小板數(shù)量恢復更多，提示加味黃芪建中湯可更好的抑制miR-516a-5p 表達，促進血小板增多。現(xiàn)代醫(yī)學研究表明加味黃芪建中湯中的重要組成，如黃芪、白芍、甘草和菟絲子等，均為良好的免疫調(diào)節(jié)劑，黃芪中的有效成分黃芪甲苷可通過下調(diào)Th17 細胞的表達，上調(diào)Treg細胞的表達水平，使Th17/Treg細胞保持平衡［32］；此外，流式細胞術檢測表明，未治療的ITP 患者血樣中CD4+T 細胞較健康組更少，且Treg 細胞比例更低；經(jīng)各組治療后，CD4+T 細胞和Treg 細胞均有不同程度的上調(diào)，其中，加味黃芪建中湯綜合治療組上調(diào)更為顯著。通過Western blot 檢測IDO、mTOR 及磷酸化mTOR 的蛋白量，發(fā)現(xiàn)加味黃芪建中湯可促進CD4+T 細胞中IDO 的表達上調(diào)和mTOR 通路磷酸化的抑制，提示加味黃芪建中湯通過抑制miR-516a-5p調(diào)控IDO/mTOR通路調(diào)節(jié)免疫細胞。

綜上所述，ITP患者T細胞中miR-516a-5p的表達量與健康人群之間存在顯著差異，且與血小板計數(shù)存在明顯負相關性，說明miR-516a-5p 參與了ITP 的發(fā)生與發(fā)展。通過流式細胞術分析和分子生物學實驗證明，加味黃芪建中湯的治療可有效逆轉(zhuǎn)ITP患者的CD4+T 細胞數(shù)量和Treg 細胞比例。本研究闡明了加味黃芪建中湯治療中對免疫細胞調(diào)節(jié)的分子機制，為臨床ITP患者的中醫(yī)藥臨床治療提供新的理論依據(jù)。