基于冷凍電子顯微術(shù)的陽離子通道結(jié)構(gòu)與功能研究進展*

蔣璐璐，高 巨

（1中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院麻醉科，湖南長沙 410011；2江蘇省蘇北人民醫(yī)院麻醉科，江蘇揚州 225001）

陽離子通道通過疏水性脂質(zhì)生物膜介導(dǎo)陽離子（Na+、K+、Ca2+、Mg2+等）的流動，從而調(diào)節(jié)神經(jīng)元、肌肉細(xì)胞等可興奮細(xì)胞及淋巴細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等非可興奮細(xì)胞的膜電位變化、Ca2+信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及其他各種細(xì)胞生物學(xué)過程［1］。根據(jù)國際基礎(chǔ)與臨床藥理學(xué)聯(lián)合會（International Union of Basic &Clinical Pharmacolo?gy，IUPHAR）藥理學(xué)指南，人類基因組包含145 個電壓門控通道［2］、55 個配體門控通道［3］和27 個其他類型通道［4］，如連接蛋白、Piezo、鈣庫操縱性鈣通道等，負(fù)責(zé)陽離子跨膜運輸。當(dāng)編碼陽離子通道的基因或相關(guān)支架蛋白的基因發(fā)生突變時，會引起相關(guān)的離子通道病，如囊性纖維化［5］、長QT 間期綜合征［6］、癲癇［7］等。這些通道在發(fā)揮其特定生理功能的同時，也成為治療不同疾病的藥物作用靶點。本文就近年來有關(guān)陽離子通道的最新研究進行綜述，以更深入地了解離子通道的門控機制。

1 陽離子通道結(jié)構(gòu)研究的新進展

近年來，隨著冷凍電子顯微術(shù)（cryo-electron mi?croscopy，Cryo-EM）的發(fā)展，成像硬件的改進，顯微鏡圖像處理能力增強，大量離子通道的三維結(jié)構(gòu)得以重建。由于X 射線晶體衍射或核磁共振波譜分析等傳統(tǒng)方法，難以獲得G 蛋白偶聯(lián)受體和離子通道等膜蛋白高分辨率結(jié)構(gòu)，因此，Cryo-EM 越來越多地用于獲取膜蛋白分子的原子級分辨率結(jié)構(gòu)［8］。Doyle等［9］于1998 年首次闡明細(xì)菌K+通道KcsA 的結(jié)構(gòu)。他們又于2016 年描繪出電壓門控型K+通道Eag1（KV10.1）的結(jié)構(gòu)，揭示出一種新的電壓依賴性調(diào)節(jié)機制［10］。此后，又有研究者運用Cryo-EM研究了多個離子通道的結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系，如hERG［11］、KCNQ1［12］、超極化激活的環(huán)核苷酸門控通道1（hyperpolariza?tion-activated cyclic nucleotide-gated channel 1，HCN1）［13］、Slack（Slo2.2）［14］、Kir6.2［15］、KCa1.1［16-17］和KCa3.1（SK4）［18］，為理解不同類型離子通道的門控機制提供了新的見解。目前基于Cryo-EM 技術(shù)已解析多個陽離子通道的高分辨率結(jié)構(gòu)，見圖1。

Figure 1.Cation channels whose high-resolution structures have been resolved based on Cryo-EM.圖1 基于冷凍電鏡技術(shù)解析其高分辨率結(jié)構(gòu)的陽離子通道

1.1 HCN HCN 是一類非選擇性陽離子通道，同時允許Na+和K+通過，在心臟起搏和中樞神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用。該家族4 個成員均為電壓門控型，且受內(nèi)源性環(huán)磷酸腺苷（cyclic adenosine monophos?phate，cAMP）的調(diào)節(jié)。Lee［13］在3.5 ? 分辨率下解析了HCN1 的結(jié)構(gòu)，并闡釋其Na+/K+通透比為4∶1。他還觀察到HCN1 結(jié)構(gòu)中S4 螺旋可延伸至胞質(zhì)內(nèi)，穩(wěn)定通道關(guān)閉狀態(tài)。此結(jié)構(gòu)揭示了HCN 門控機制中電壓依賴性的反極性，即當(dāng)膜發(fā)生超極化時，由于S4螺旋向下位移破壞其穩(wěn)定作用，從而開放通道。而cAMP 的結(jié)合也可引起通道內(nèi)螺旋的旋轉(zhuǎn)，從而使通道處于開放狀態(tài)。

1.2 鈣激活鉀通道和鈉激活鉀通道 鈣激活鉀通道KCa3.1（SK4）廣泛表達(dá)于免疫系統(tǒng)，可與鈣調(diào)蛋白結(jié)合形成復(fù)合物。MacKinnon 及其研究團隊分別在3.4 ?和3.5 ?分辨率下獲得該通道關(guān)閉與激活狀態(tài)構(gòu)象。他們發(fā)現(xiàn)，當(dāng)環(huán)境中沒有鈣時，鈣調(diào)蛋白C 端半段結(jié)構(gòu)（C-lobe）可結(jié)合于通道鈣調(diào)蛋白結(jié)合域C端。另外，盡管目前仍不清楚鈣調(diào)蛋白N 端半段結(jié)構(gòu)（N-lobe）的具體作用，但當(dāng)KCa3.1 處于激活狀態(tài)時，N-lobe 擺動至通道另一亞基S4-S5 linker，并將其下拉，導(dǎo)致S6 向外移動，從而擴大通道開放孔徑，這可能是影響KCa通道門控機制的關(guān)鍵所在，同時也可能成為潛在的藥物靶點［18］。長期以來，離子通道結(jié)構(gòu)的對稱性一直存在爭議，而KCa3.1 結(jié)構(gòu)表明KCa通道為對稱的四聚體結(jié)構(gòu)，而非先前提出的二聚體對稱結(jié)構(gòu)。此外，Hite 等［19］同樣運用Cryo-EM 技術(shù)，通過滴定Na+濃度，在鏡下觀察到鈉激活鉀通道Slack（Slo2.2）的多種構(gòu)象變化。Slack 主要表達(dá)于神經(jīng)元內(nèi)，可被胞內(nèi)高濃度Na+激活。結(jié)合前期關(guān)于Slack結(jié)構(gòu)的研究，Hite［14］設(shè)置了5 種不同濃度Na+梯度進行滴定，電鏡成像結(jié)果顯示Slack 關(guān)閉狀態(tài)存在多種構(gòu)象，而僅有一種開放狀態(tài)構(gòu)象，且呈Na+濃度梯度依賴性，這表明該配體門控通道的開放是高度協(xié)調(diào)、類似開關(guān)的過程。

1.3 瞬時受體電位（transient receptor potential，TRP）通道家族 TRP通道是一類重要的非選擇性陽離子通道，可允許Na+、Ca2+和Mg2+通過，是體內(nèi)多種生理過程的感受器。目前，已有多種TRP 通道的結(jié)構(gòu)得以解析，見圖2。（1）Singh 等［20］不僅獲取了小鼠瞬時受體電位V 型通道3（transient receptor potential vanilloid 3，TRPV3）關(guān)閉狀態(tài)的結(jié)構(gòu)，同時給予激動劑2-氨基乙氧基-二苯基硼酸（2-aminoethoxydiphenyl borate，2-APB）使通道開放，并闡明了其激活狀態(tài)結(jié)構(gòu)。2-APB 可結(jié)合于通道3個不同的變構(gòu)位點，當(dāng)通道開放時，胞外孔及胞內(nèi)段均發(fā)生構(gòu)象變化。TRPV3 過度活化是皮炎發(fā)生瘙癢與疼痛的重要機制，深入了解其結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系有望為此疾病提供新的治療靶點。（2）瞬時受體電位M 型通道8（transient receptor potential melastatin 8，TRPM8）是人體內(nèi)重要的冷感應(yīng)蛋白。Yin 等［21］在4.1? 分辨率下獲得其高清結(jié)構(gòu)時發(fā)現(xiàn)，該通道不僅與其他TRP 通道具有相同的同源四聚體結(jié)構(gòu)，且N 端結(jié)構(gòu)域具有獨特的折疊模式。同時，該通道可與薄荷醇結(jié)合，不同于其他配體結(jié)合位置，此結(jié)合位點位于電壓傳感器樣結(jié)構(gòu)域內(nèi)。（3）TRP通道家族中另一重要成員經(jīng)典型瞬時受體電位通道3（transient receptor potential canoni?cal 3，TRPC3）是一種Ca2+通道，其編碼基因突變可導(dǎo)致人類罹患神經(jīng)退行性疾病和心血管疾病［22］。Cryo-EM圖像分析顯示，人源TRPC3擁有與其他TRP通道相似的跨膜結(jié)構(gòu)域，其胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域（cytoplasmic domain，CPD）可穩(wěn)定通道結(jié)構(gòu)，并參與通道門控調(diào)節(jié)。Sierra-Valdez 等［23］對TRPC3 結(jié)構(gòu)的闡明有助于我們理解TRP 通道的門控機制，研究人員觀察到TRPC3 的CPD 中水平螺旋可與跨膜結(jié)構(gòu)域偶聯(lián)，當(dāng)水平螺旋轉(zhuǎn)變?yōu)榫砬菪鴷r，可促進通道構(gòu)象改變，進而影響通道門控狀態(tài)。

Figure 2.Three-dimensional cryo-electron microscopic reconstruction and structure of TRPV3，TRPM8 and TRPC3 viewed from the extracellular side（left）and the membrane plane（right）［20-21，23］.圖2 冷凍電鏡下TRPV3、TRPM8和TRPC3離子通道結(jié)構(gòu)

常染色體顯性遺傳性多囊腎?。╝utosomal domi?nant polycystic kidney disease，ADPKD）是慢性腎病的重要誘因之一，其致病基因為Pkd1和Pkd2，分別編碼膜蛋白PKD1 和PKD2。PKD1 是典型的電壓門控型離子通道，不同于目前已知的電壓依賴性離子通道折疊蛋白，它可與PKD2結(jié)合形成具有域交換的非典型TRP 通道。Su 等［24］首次報道了PKD1 和PKD2 復(fù)合物近原子級分辨率（3.6 ?）的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)。該研究顯示，盡管PKD1 和PKD2 蛋白C 端沒有卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域，二者仍能以1∶3 的比例形成獨特的復(fù)合物。此外，研究人員還發(fā)現(xiàn)，PKD1 的S6 片段可從中間分裂，胞外段S6a形成類似于典型的孔螺旋結(jié)構(gòu)，而胞內(nèi)段則呈現(xiàn)無規(guī)則卷曲；且S6 跨膜螺旋上存在3 個帶有正電荷的氨基酸殘基，當(dāng)其伸入通道中心孔時，可使通道處于非導(dǎo)電狀態(tài)。

1.4 機械敏感性Piezo1通道 Piezo1是近年發(fā)現(xiàn)的一種新型機械敏感性離子通道，由Piezo1基因編碼而成。研究發(fā)現(xiàn)，Piezo1表達(dá)于神經(jīng)系統(tǒng)、血管內(nèi)皮、膀胱、肺組織等，在神經(jīng)軸突生長、血壓調(diào)節(jié)、膀胱內(nèi)壓力感知及肺損傷中發(fā)揮重要的機械轉(zhuǎn)導(dǎo)作用［25］。早期對Piezo1低分辨率結(jié)構(gòu)的研究顯示，Piezo1是具有38 個跨膜結(jié)構(gòu)域的膜蛋白，以中央帽為中心，周圍呈三葉螺旋槳樣結(jié)構(gòu)。外葉作為壓力感受器可感知周圍環(huán)境壓力的變化，并調(diào)控通道中央孔陽離子的運輸［26］。Zhao 等［27］最近分析了約3×106個粒子的結(jié)構(gòu)后，得到了Piezo1 的高清結(jié)構(gòu)（3.97 ?）。該結(jié)構(gòu)顯示通道胞內(nèi)段中心存在一個90 ? 的橫梁，橫梁通過杠桿樣運動，將跨膜螺旋與中心孔聯(lián)結(jié)起來。此結(jié)構(gòu)是Piezo1 感知機械力后激活的基礎(chǔ)：外葉感知機械力后發(fā)生卷曲，橫梁發(fā)生杠桿樣運動，使中心孔發(fā)生構(gòu)象改變，進而允許Ca2+通過。Piezo1 結(jié)構(gòu)的闡明及其獨特的門控機制不同于目前已知的其他離子通道，為我們理解離子通道結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系提供了新的視角與見解，見圖3［28］。

Figure 3.Cryo-electron microscopic structure of mouse Piezo1［28］.The dimensions of the trimeric structure，the height of the cap and the length of the beam are indicated.圖3 冷凍電鏡下小鼠Piezo1的結(jié)構(gòu)

1.5 上皮鈉通道（epithelial sodium channel，ENaC）近年Noreng 等［29］解析了ENaC 的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)。ENaC 負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)體內(nèi)水鈉平衡，多數(shù)鈉通道均是電壓門控型，通常由帶有4 個重復(fù)結(jié)構(gòu)域的大α 亞基組成，而ENaC 則為異源三聚體結(jié)構(gòu)，且其中包含一個蛋白酶敏感結(jié)構(gòu)域，參與調(diào)控通道門控狀態(tài)［30］。ENaC 由α、β和γ亞基組成，3種亞基按照1∶1∶1的比例以逆時針方向排列，亞基之間存在蛋白酶敏感的抑制性結(jié)構(gòu)域。此結(jié)構(gòu)的發(fā)現(xiàn)不僅明確了ENaC 的化學(xué)組成及排列方式，同時有助于揭示通道失活的相關(guān)機制。

1.6 雙孔通道家族（two-pore channels，TPCs）TPCs是一類具有2個孔的離子通道。其中TPC1是選擇性Na+通道，表達(dá)于細(xì)胞內(nèi)體（一種膜包裹的酸性、不含溶酶體酶的囊泡結(jié)構(gòu)，分為初級內(nèi)體和次級內(nèi)體；初級內(nèi)體通常位于細(xì)胞質(zhì)的外側(cè)，次級內(nèi)體常位于細(xì)胞質(zhì)的內(nèi)側(cè)，靠近細(xì)胞核），對于調(diào)節(jié)嗜酸性細(xì)胞器（如線粒體、溶酶體等）的生理功能具有重要作用。She 等［31］發(fā)現(xiàn)，不同于雙孔鉀通道（two-pore potas?sium channel，K2P），TPC1 是由2 個6 次跨膜亞基（six-transmembrane，6-TM）組成的同源二聚體，其N端和C端均位于膜胞質(zhì)面。TPC1不僅具有電壓依賴性，同時也可通過一個6-TM 中的磷脂酰肌醇3，5-二磷酸與另一個6-TM 相結(jié)合以感應(yīng)電壓變化，進而激活通道。

1.7 其他陽離子通道 除了上述陽離子通道，新近有2 個電壓門控型鈉通道［NaV，即人源NaV1.4-β1 復(fù)合物（3.2 ?）［32］和昆蟲NaVPaS（2.8 ?，與河豚毒素結(jié)合時為2.6 ?）［33］］的結(jié)構(gòu)被闡明，不僅為動物毒素調(diào)控離子通道的機制提供了理論依據(jù)，同時將有助于推動新型動物毒素相關(guān)藥物的研發(fā)。Cuello 等［34］通過運用傳統(tǒng)的X 射線晶體衍射技術(shù)及一組巧妙交聯(lián)的通道突變體揭示了KcsA 通道的門控特性。KcsA通道存在3 種狀態(tài)，即關(guān)閉、開放和C 型失活（慢失活），越來越多的電壓依賴型鉀通道被發(fā)現(xiàn)存在C 型失活狀態(tài)，其機制較為復(fù)雜，目前主要認(rèn)為是由于通道外口阻滯及通道K+離子選擇器對K+的通透能力降低所致，該通道高清結(jié)構(gòu)（2 ?）的解析為了解通道選擇性通過膜如何隨門控狀態(tài)的變化而變化提供了新的結(jié)構(gòu)依據(jù)。

2 陽離子通道生理學(xué)和病理生理學(xué)研究新進展

陽離子通道允許Na+、K+、Ca2+等陽離子進出細(xì)胞膜以調(diào)節(jié)膜電位，主要分為電壓門控型和配體門控型兩大類。近年來，隨著研究的不斷深入，研究者們陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了其他調(diào)控機制的離子通道，如機械敏感性離子通道Piezo，在血壓調(diào)節(jié)和肺牽張反射中發(fā)揮重要作用［35］。此外，人們也越來越關(guān)注一些功能性通道亞基，及細(xì)胞器（如線粒體）陽離子通道的生物學(xué)功能。

2.1 機械敏感性Piezo 通道 機械轉(zhuǎn)導(dǎo)是將壓力、牽引力、剪切力等機械刺激信號轉(zhuǎn)化為電信號或生物化學(xué)信號，并最終引起細(xì)胞生理反應(yīng)的過程，在動植物進化過程中呈高度保守。盡管人們早已認(rèn)識到機械轉(zhuǎn)導(dǎo)在多種生理過程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用，如植物根莖的形成［36］，原生動物纖毛擺動方向［37］及哺乳動物聽覺、觸覺、痛覺的感知［38］等，直到2010 年Coste 等［39］才首次提出Piezo1 和Piezo2 是真正意義上的機械敏感性陽離子通道。自此，Piezo 獨特的結(jié)構(gòu)不僅為我們提供了新的門控機制，同時有助于我們對體內(nèi)多種生理過程的理解。其中，血壓調(diào)節(jié)是一種重要的由機械敏感性離子通道介導(dǎo)的機械力轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。我們知道，運動時由于氧耗增加，組織器官需要更多的含氧血流灌注。此時，血管收縮、血壓升高以實現(xiàn)血流分布最佳化，然而血流變化究竟如何引起這種血管反應(yīng)，目前尚未清楚。Piezo1在血管內(nèi)皮中表達(dá)豐富，Rode 等［40］條件性敲除內(nèi)皮Piezo1后發(fā)現(xiàn)，該通道是調(diào)節(jié)血流變化與血管收縮中不可或缺的環(huán)節(jié)。血流改變引起的機械力激活內(nèi)皮和血管平滑肌細(xì)胞上的Piezo1，細(xì)胞發(fā)生去極化，Ca2+內(nèi)流，細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度升高從而引起血管收縮。動脈粥樣硬化是腦卒中和心梗的危險因素之一，好發(fā)于動脈血流受阻的區(qū)域。有趣的是，不同血流狀態(tài)可引發(fā)內(nèi)皮細(xì)胞Piezo1 不同的級聯(lián)反應(yīng)。例如，層流和湍流均可活化機械敏感型離子通道Piezo1，嘌呤受體P2Y7 和Gq/G11 介導(dǎo)的信號通路。然而，研究表明，只有湍流會導(dǎo)致Piezo1及Gq/G11介導(dǎo)的整聯(lián)蛋白活化［41］。繼而，其下游核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）的激活又是調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮炎癥的關(guān)鍵因子，在動脈粥樣硬化等血管疾病中發(fā)揮血流特異性調(diào)節(jié)作用。此外，機械轉(zhuǎn)導(dǎo)在呼吸系統(tǒng)中同樣起著至關(guān)重要的作用，其功能障礙可導(dǎo)致圍產(chǎn)期死亡和成人睡眠呼吸暫停。研究表明，Piezo2表達(dá)于氣道感覺神經(jīng)元，是呼吸相關(guān)牽張信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的主要感受器。Nonomura 等［42］觀察到，全基因敲除Piezo2及條件性敲除氣道感覺神經(jīng)元Piezo2，均可導(dǎo)致小鼠出現(xiàn)呼吸窘迫，甚至死亡。相反，光激活迷走神經(jīng)元Piezo2 通道則會引起成年小鼠呼吸暫停，提示Piezo2 是介導(dǎo)多種氣道感覺神經(jīng)元機械轉(zhuǎn)導(dǎo)的牽張感受器。

2.2 沉默通道（亞基）研究者們通常采用膜片鉗等電生理技術(shù)測量流經(jīng)離子通道的電流，從而進行相關(guān)離子通道的研究。然而，并非所有的離子通道孔道形成亞基均具有離子通透功能，因此往往忽略了非導(dǎo)電通道或沉默通道。大多數(shù)沉默通道與其經(jīng)典的離子通道分子伴侶具有高度的結(jié)構(gòu)及序列同源性，且當(dāng)與大分子復(fù)合物相互作用時，可精細(xì)調(diào)節(jié)其結(jié)合分子伴侶的生物物理門控特性。電壓門控型鉀離子通道（voltage-gated potassium channels，Kv）是一類受膜電壓調(diào)節(jié)的鉀通道大家族。功能性Kv 通道由4個具有離子通透能力的α亞基形成孔道，允許鉀離子通過。然而，構(gòu)成Kv5、Kv6、Kv8和Kv9通道的α亞基不具有離子通透功能，被稱為沉默亞基，其形成的離子通道也無法產(chǎn)生電流［43-44］。KV8.2 通道是一種非導(dǎo)電通道，最近人們發(fā)現(xiàn)KV8.2 突變的人類攜帶者視力損傷嚴(yán)重，主要涉及KV8.2 與調(diào)節(jié)視桿、視錐細(xì)胞興奮性的KV2.1 通道之間相互作用的改變［45］。

2.3 細(xì)胞器陽離子通道 目前，陽離子通道在細(xì)胞器中的重要性也得到越來越多地認(rèn)可。線粒體是細(xì)胞的主要代謝與供能場所。長期以來，線粒體K+（mitoK）通道在保護心肌細(xì)胞方面發(fā)揮重要作用，其中KNa1.2（Slick，Slo2.1）是與心臟保護相關(guān)的mitoK通道之一。Smith 等［46］運用單通道膜片鉗技術(shù)，在野生型小鼠中發(fā)現(xiàn)了6 個與KNa1.2 生物物理特性相似的離子通道，但在KNa1.2基因敲除（knockout，KO）小鼠中卻未有類似發(fā)現(xiàn)。他們進一步證明，KNa通道激活劑硫雙二氯酚可使野生型小鼠心肌細(xì)胞線粒體呼吸鏈與氧化磷酸化解偶聯(lián)，同時KO 小鼠體脂升高，其心臟對能量需求反應(yīng)能力下降，提示KNa1.2 通道參與調(diào)節(jié)能量消耗和脂肪代謝。周期性麻痹主要表現(xiàn)為反復(fù)發(fā)作的骨骼肌弛緩性癱瘓，由電壓門控鈉通道NaV1.4 或電壓門控鈣通道CaV1.1 中電壓感受結(jié)構(gòu)域S4 片段點突變引起。這些突變作用于S4 片段中的精氨酸殘基（R1、R2 或R3），影響其門控作用，從而允許陽離子通過。Jiang 等［47］將細(xì)菌NaVAb通道進行相應(yīng)位點突變，通過X 射線晶體衍射技術(shù)解析其高清結(jié)構(gòu)（2.7 ?），不僅觀察到突變導(dǎo)致的陽離子滲漏現(xiàn)象，并確定了可能的藥物結(jié)合靶點，將有助于治療低血鉀和正常血鉀型周期性麻痹。

3 結(jié)語

近年來，Cryo-EM的發(fā)展與應(yīng)用使人們認(rèn)識了多種陽離子通道原子級結(jié)構(gòu)，同時也加深了我們對離子通道結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系的了解。盡管有學(xué)者指出Cryo-EM的應(yīng)用條件不符合實際生理條件，但我們相信，隨著Cryro-EM 的日益成熟，電壓門控、配體門控及其他機械敏感性陽離子通道完整的門控機制終將得以闡明。此外，離子通道功能處于動態(tài)變化中，若想全面掌握其門控和離子選擇性機制，還需借助分子動力學(xué)模型實現(xiàn)。同時，除了闡明離子通道的結(jié)構(gòu)，基于其結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系進行的相關(guān)藥物研發(fā)仍然存在許多未知的難題，這些都需要我們持續(xù)不斷地深入研究。