miR-23b通過靶基因Cxcl12調(diào)控腎性高血壓*

李 響，于閃閃，胡艷玲，王天賀，李洪志，趙冰海，邱德來，王會(huì)巖

（1延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)與病理生理學(xué)教研室，吉林延吉 133002；2吉林醫(yī)藥學(xué)院，吉林吉林 132013；3北華大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，吉林吉林 132013）

腎性高血壓是一種常見的繼發(fā)性高血壓，腎臟實(shí)質(zhì)性病變和腎動(dòng)脈病變是引起腎性高血壓的主要原因。腎性高血壓占成年人高血壓的5%，占未成年人高血壓的60%，腎功能不全的患者發(fā)生高血壓占58%～86%［1］。腎臟病變導(dǎo)致高血壓的發(fā)生，而高血壓的發(fā)生又對(duì)腎臟再次損害，二者相互促進(jìn)使疾病不斷發(fā)生發(fā)展，這種惡性循環(huán)對(duì)高血壓的治療造成了極大的困難［2］。綜上所述，腎性高血壓嚴(yán)重地威脅人類的身體健康，因此，如何快速有效的提高腎臟功能、降低血壓是防治腎性高血壓的關(guān)鍵。

微小RNA（microRNA，miRNA，miR）是一類長度約為21～23 個(gè)核苷酸的非編碼的調(diào)控小RNA，它們通過與mRNA 結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因表達(dá)［3］。大量研究表明，一個(gè)miRNA 可與多個(gè)靶基因結(jié)合，而同一個(gè)靶基因又可受多個(gè)miRNA 調(diào)控，這些靶基因都可以發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子、轉(zhuǎn)錄蛋白、分泌因子及受體等生物學(xué)功能［4］。miRNA 在生物進(jìn)化過程中高度保守，在細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞分化、脂類代謝、激素分泌及在腫瘤等多種疾病的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要角色［5］。近年來越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，miRNA 參與冠狀動(dòng)脈粥樣硬化心臟病、高血壓、心肌肥厚和心律失常等心臟疾病的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制［6］，在心血管系統(tǒng)疾病及微血管病變中具有重要作用［7］。miRNA 主要功能為降解、穩(wěn)定、促進(jìn)靶基因表達(dá)，我們?cè)诮鼛啄陮?duì)miRNA 生物功能研究中發(fā)現(xiàn)，給予野生型小鼠特異性miR-23b 抑制劑可導(dǎo)致腎臟纖維化［8］，但這種腎臟纖維化來源于何種類型的腎臟疾病并不清楚，因?yàn)槟I臟纖維化是大多數(shù)腎臟疾病的終末病理變現(xiàn)，為了更加深入定位miR-23b 在腎臟疾病中的功能，我們利用CRISPRCas9 技術(shù)在小鼠體內(nèi)敲除miR-23b進(jìn)而研究其作用。本研究通過基因敲除小鼠和臨床腎臟病理活檢樣本，討論miR-23b 在腎性高血壓中的調(diào)控作用，為研究腎性高血壓的發(fā)生機(jī)制與臨床診斷提供研究基礎(chǔ)。

材料和方法

1 臨床樣本采集

本研究所有臨床樣本收集于吉林市中心醫(yī)院及北華大學(xué)附屬醫(yī)院，包括腎病綜合征患者腎活檢，健康人群腎活檢。臨床樣本在低溫條件下30 min 之內(nèi)送到實(shí)驗(yàn)室且-80℃保存。

2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組

選取8 周齡雄性C57BL/6（野生型，wild-type，WT）小鼠購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號(hào)為SCXK（京）2016-0006；miR-23b基因敲除（miR-23bgene knockout，miR-23b KO）小鼠由北華大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院趙冰海教授饋贈(zèng)。小鼠體重均在24～26 g，在IVC 級(jí)動(dòng)物房飼養(yǎng)，光照與黑暗12 h 自動(dòng)轉(zhuǎn)換，溫度24～25℃，濕度55%，飲食攝水自由，所用飼料和墊料均購自北京科奧協(xié)力飼料有限公司。實(shí)驗(yàn)分為WT 小鼠和miR-23b KO 小鼠共2 組，每組6 只。尿液樣品用小鼠代謝籠收集24 h尿液。小鼠血清樣本采用眼球取血至抗凝管，4 000 r/min 離心10 min，取上清低溫保存。小鼠斷頸處死，獲取腎臟，取1/2皮質(zhì)部分保存4%多聚甲醛溶液用于石蠟包埋，剩余的腎臟組織冰凍液氮保存。

3 方法

3.1 腎臟組織切片和形態(tài)學(xué)觀察

3.1.1 HE 染色 將切片置于62℃烘箱中2 h，二甲苯脫蠟10 min，100%乙醇5 min，90%乙醇5 min，80%乙醇5 min，75%乙醇5 min，蒸餾水5 min，60℃預(yù)熱的蘇木素2 min，流水沖洗20 s，促藍(lán)返藍(lán)（0.5%鹽酸乙醇）40 s，流水沖洗20 s，1%伊紅溶液1 min，流水沖洗20 s，乙醇梯度脫水，二甲苯透化2 min，中性樹膠封片，鏡下觀察拍照。

3.1.2 高碘酸-希夫（periodic acid-Schiff，PAS）染色 按照PAS Stain Kit（Abcam）說明書操作。

3.1.3 免疫組化染色 將切片置于62℃烘箱中2 h，二甲苯脫蠟10 min，100%乙醇5 min，90%乙醇5 min，80%乙醇5 min，75%乙醇5 min，蒸餾水5 min，0.25%TritonX-100（Sigma）透化10 min，2%牛血清白蛋白37℃封閉1 h，Ⅰ抗4℃過夜，PBS 洗3 遍，每次5 min，Ⅱ抗37℃孵育1 h，PBS 洗5 min×3 遍，DAB 顯色10 min，PBS 洗3 遍，乙醇梯度脫水，二甲苯透化2 min，中性樹膠封片，鏡下觀察拍照。

3.2 ELISA 實(shí)驗(yàn) 以腎素（renin）為例，取6 μL 血清與50 μL coating buffer（Abcam）混勻，4℃包被過夜，PBST 洗3 遍，2%牛血清白蛋白37℃封閉1 h，Ⅰ抗37℃孵育1 h，PBST 洗4 遍，Ⅱ抗37℃孵育30 min，PBST洗4遍，ECL顯色，酶標(biāo)儀化學(xué)發(fā)光檢測。

3.3 RT-qPCR 檢測RNA 表達(dá) 用Trizol RNA 提取試劑盒（Invitrogen）提取小鼠腎臟RNA，NanoDrop 測濃度。以提取的RNA 作為模板，用Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit（Roche）對(duì)RNA 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，PCR 體系為1 μg RNA；Anchored-Oligo（DT）18 Primer 1 μL；Random Hexamer Primer 2 μL；PCRgrade Water 至13 μL。反應(yīng)條件為：60℃10 min，立即冰上靜止10 min。5×buffer 5 μL；protector RNase inhibitor 0.5 μL；Deoxynucleotide Mix 2 μL；Tran?scriptor Reverse Transcriptase 0.5 μL；總體積20 μL。反應(yīng)條件為：25℃10 min、50℃60 min，將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)基因?qū)?yīng)的引物，qPCR 反應(yīng)體系為2×SYBR Green Mas?ter Mix 10 μL、Forward primer 0.8 μL、Reverse primer 0.8 μL、cDNA template 2 μL、RNase-free H2O 至20 μL。反應(yīng)條件為：預(yù)變性95℃5 min；變性90℃30 s，退火60℃30 s，延伸72℃30 s，45 個(gè)循環(huán)，再延伸72℃5 min。鼠源內(nèi)參照GAPDH 的正向引物序列為5'-ATGACATCAAGAAGGTGGTGAAG-3'，反向引物序列為5'-TCCTTGGAGGCCATGTAGG-3'；鼠源Cx?cl12基因正向引物序列為5'-TGCATCAGTGACGG?TAAACCA-3'，反向引物序列5'-CACAGTTTGGAGT?GTTGAGGAT-3'。人源內(nèi)參照GAPDH 的正向引物序列為5'-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3'，反向引物序列為5'-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3'；人源Cxcl12基因的正向引物序列為5'-ATTCTCAA?CACTCCAAACTGTGC-3'，反向引物序列為5'-ACTT?TAGCTTCGGGTCAATGC-3'。

3.4 雙螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) 根據(jù)NCBI 數(shù)據(jù)庫中Cxcl12的序列信息，設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物，正向引物為5'-ATTCTAGTTGTTTAAACGAGCTCCATGCTTCATCT?GACTTCCGCTTCT-3'，反向引物為5'-GCTTGCAT?GCCTGCAGGTCGACTCTAGAATCCCCACTGTG?GCTTCATGGCAAG-3'，PCR 擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳鑒定并純化，經(jīng)酶切將基因Cxcl12序列連接到pmir?GLO Dual-Luciferase miRNA Target Expression Vector（Promega）上，測序提質(zhì)粒，實(shí)驗(yàn)分為GLO 對(duì)照組、GLO-Cxcl12+miR-23b（+）組、GLO-Cxcl12+miR-23b（-）組和GLO-Cxcl12+miRNEG 組，轉(zhuǎn)染到293T 細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染48 h 后，按照Dual-Glo?Luciferase Assay Sys?tem（E2920）說明操作進(jìn)行螢光素酶活性測定。

3.5 腎臟樣本的RNA 測序（RNA sequencing，RNASeq）建庫與生物信息學(xué)分析 本實(shí)驗(yàn)通過Illumina的NEBNext RNA 文庫制備試劑盒說明書制備測序文庫（New England Biolabs）。RNA-Seq 數(shù)據(jù)可在NCBI GEO網(wǎng)站的登錄查詢，登錄號(hào)為PRJNA524723。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

本研究所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)運(yùn)用SPSS 21.0 軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；多組比較采用單因素方差分析（one-wayANOVA），兩組間比較采用Bon?ferroni檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1 從臨床樣本角度檢測miR-23b 表達(dá)與腎病綜合征的關(guān)系

用RT-qPCR 方法，對(duì)收集的臨床腎病綜合征患者和健康人的腎活檢樣本進(jìn)行miR-23b 表達(dá)量的檢測，與健康人群組（739.74±335.20，n=6）相比較，腎病綜合征患者組miR-23b 在腎臟活檢樣本中的表達(dá)量（50.71±47.56，n=6）顯著降低（P＜0.01）。對(duì)腎病綜合征患者的血清肌酐（serum creatinine）、尿酸（uric acid，UA）及24 h 尿蛋白（urine protein）與miR-23b 表達(dá)量進(jìn)行相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，前3 個(gè)指標(biāo)都與miR-23b的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05），見圖1A。

2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物各組織器官miR-23b表達(dá)量檢測

為了確保實(shí)驗(yàn)動(dòng)物基因敲除成功，對(duì)miR-23b KO 小鼠進(jìn)行基因型鑒定，正向引物為5'-TG?GTCCCTAAGGTATTGGTCTCAT-3'，反向引物為5'-TTGTTTCCAAAGAGCCACAAGG-3'，PCR 產(chǎn)物的電泳結(jié)果見圖2。用Bulge-LoopTMmiRNA RT-qPCR Starter Kit（廣州銳博生物技術(shù)有限公司）來檢測miR-23b KO 小鼠和WT 小鼠的各組織器官miR-23b 表達(dá)水平，結(jié)果顯示，與WT 組相比，miR-23b KO 小鼠各組織器官miR-23b 表達(dá)均顯著降低（P＜0.05 或P＜0.01），見表1。

3 miR-23b基因敲除小鼠腎臟結(jié)構(gòu)及功能改變

Figure 1.Relationship between miR-3b expression and renal function.A：the correlation between miR-23b expression level and se?rum creatinine level；B：the correlation between the expression of miR-23b and 24-hour urine protein；C：the correlation between the expression level of miR-23b and serum uric acid（UA）.圖1 miR-23b表達(dá)水平與反映腎臟功能指標(biāo)的關(guān)系

Figure 2.Genetyping of miR-23b mice.M：Marker DL2000；Lane 1―9：miR-23b KO mice（target fragment 267 bp）；Lane 10：WT mice（target fragment 359 bp）.圖2 miR-23b KO小鼠基因型的鑒定

表1 miR-23b KO小鼠中miR-23b的表達(dá)Table 1.The expression of miR-23b in miR-23b KO mice（Mean±SD. n=6）

24 h 尿蛋白測定是早期判定腎臟出現(xiàn)病變的常見手段，我們通過ELISA（Assaypro，Mouse Albumin ELISA Kit）檢測2 組小鼠24 h 尿液中微量白蛋白含量，結(jié)果顯示，與WT 組比較，miR-23b KO 組小鼠尿微量白蛋白顯著升高（P＜0.01），提示miR-23b KO 小鼠腎臟發(fā)生損害，見表2。我們又通過腎臟磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）和彩色多普勒血流成像（color Doppler flow imaging，CDFI）來進(jìn)一步驗(yàn)證。腎臟MRI 顯示，與WT 組相比，腎臟皮質(zhì)變薄而且皮髓質(zhì)交界模糊，測得miR-23b KO 組小鼠的腎皮質(zhì)顯著變?。≒＜0.05），預(yù)示腎臟已經(jīng)發(fā)生病變；CDFI 顯示，與WT 組比較，測得miR-23b KO 小鼠腎臟血管阻力指數(shù)顯著升高（P＜0.01），而腎臟血管阻力指數(shù)的變化是高血壓的一個(gè)重要特征，見圖3及表2。

我們對(duì)2 組小鼠腎臟組織切片進(jìn)行HE 和PAS染色及纖維連接蛋白（fibronectin，F(xiàn)N）免疫組化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-23b KO 小鼠相比WT 小鼠出現(xiàn)腎小球系膜區(qū)擴(kuò)張、腎小球FN 沉積增加和糖原增多等形態(tài)學(xué)改變，進(jìn)一步驗(yàn)證了miR-23b 在腎臟中的重要作用，見圖4。通過ELISA 檢測2 組小鼠血清中腎素和血管緊張素水平，與WT 組比較，miR-23b KO 小鼠腎素和血管緊張素均顯著增高（P＜0.05），見表2。

4 miR-23b 基因敲除小鼠腎臟組織RNA-Seq 基因的變化

對(duì)2 組小鼠進(jìn)行RNA-Seq，發(fā)現(xiàn)非靶基因上調(diào)176 個(gè)，下調(diào)184 個(gè)，靶基因上調(diào)11 個(gè)，下調(diào)9 個(gè)，見表3。miR-23b 靶基因顯著改變有20 個(gè)，非顯著改變有709 個(gè)，非靶基因顯著改變有340 個(gè)，非顯著改變有24 279 個(gè)，見表4。miR-23b KO 小鼠腎臟總體變化基因富集于血流（綠色標(biāo)注），腎臟總體變化基因與TargetScan 數(shù)據(jù)庫中的miR-23b 靶基因有交集，并且這些基因富集于血流，見圖5。

5 miR-23b靶定Cxcl12發(fā)揮生物學(xué)作用

根據(jù)上述生物信息學(xué)分析，Cxcl12（miR-23b 靶基因）是與血流關(guān)系最密切的基因，對(duì)臨床上收集的腎病綜合征病患者和健康人的腎活檢樣本進(jìn)行RTqPCR，與健康人群組相比，腎病綜合征患者Cxcl12基因表達(dá)水平顯著增高（P＜0.01），見圖6A。同時(shí)，對(duì)2 組小鼠腎臟組織進(jìn)行RT-qPCR，與WT 小鼠比較，miR-23b KO 小鼠的Cxcl12基因表達(dá)也發(fā)生顯著增高（P＜0.05），見圖6B。這些研究結(jié)果表明miR-23b的表達(dá)與Cxcl12基因呈負(fù)相關(guān)。

Figure 3.Renal magnetic resonance imaging（MRI）and color Doppler flow imaging（CDFI）.Representative images of MRI and CDFI from miR-23b KO mice and WT mice showed that deletion of miR-23b induced renal hypertension.圖3 腎臟磁共振成像和彩色多普勒血流成像

Figure 4.Representative images of HE staining，periodic acid-Schiff（PAS）staining and immunochemistry for fibronectin（FN）in mouse kidney（×400）.圖4 小鼠腎臟HE、PAS和FN免疫組化染色

表2 miR-23b KO小鼠尿微量白蛋白、血管阻力系數(shù)、腎皮質(zhì)厚度和血清中腎素-血管緊張素的檢測結(jié)果Table 2.Detection of urine microalbumin，vascular resistance coefficient，renal cortex thickness，and the serum levels of renin and angiotensin in the miR-23b KO mice（Mean±SD. n=6）

表3 WT 和miR-23b KO 小鼠腎臟RNA-Seq 后相關(guān)基因的變化Table 3.Changes of related genes in the kidneys of WT and miR-23b KO mice by RNA-Seq（n=6）

表4 WT 和miR-23b KO 小鼠腎臟RNA-Seq 相關(guān)基因與TargetScan數(shù)據(jù)庫對(duì)比Table 4.Comparison of the kidneyrelated gene expression in the WT and miR-23b KO mice detected by RNA-Seq with the results of TargetScan database（n=6）.

為了近一步檢測miR-23b是否調(diào)控Cxcl12基因，我們進(jìn)行體外螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)，與WT 組比較，發(fā)現(xiàn)miR-23b過表達(dá)時(shí)可以顯著抑制Cxcl12螢光素酶活性（P＜0.01），而對(duì)miR-23b KO 和類似物實(shí)驗(yàn)時(shí)沒有發(fā)生抑制，見圖7。這些研究數(shù)據(jù)表明miR-23b通過調(diào)控靶基因Cxcl12發(fā)揮其生物學(xué)作用，進(jìn)而調(diào)控小鼠血壓的變化。

討論

腎性高血壓是腎臟發(fā)生病變引起的高血壓，是慢性腎臟病最常見的并發(fā)癥，隨著腎臟的病變，高血壓的發(fā)病率不斷增加，近而對(duì)腎臟再次造成傷害。對(duì)于腎性高血壓的治療不僅要控制血壓、還要延緩腎臟損傷［2，9］。目前，肥胖、高血脂癥、糖尿病和吸煙等都是腎性高血壓的誘因，由于腎性高血壓的發(fā)生發(fā)展機(jī)制過于復(fù)雜，所以預(yù)防和治療面臨著一定的困難［10］。

Figure 5.KEGG database analysis of RNA-Seq results in the kidney of miR-23b KO mice.A：GO term enrichment analysis for global altered genes from miR-23b KO mice kidney，which showed that heart contraction and blood circulation were en?riched terms；B：GO term enrichment analysis for global changed genes overlapped with miR-23b target database，which showed that significantly altered miR-23b target genes were enriched in blood circulation.圖5 miR-23b KO小鼠腎臟RNA-Seq結(jié)果的KEGG數(shù)據(jù)庫分析

Figure 6.The mRNA expression of Cxcl12 gene in healthy controls，nephrotic syndrome（NS）patients（A），WT mice and miR-23b KO mice（B）.Mean±SD. n=6.*P＜0.05 healthy；##P＜0.01 vs WT.圖6 健康人群與腎病綜合征患者及miR-23b KO 小鼠Cx?cl12基因檢測

Figure 7.Luciferase reporter experiment.Mean±SD. n=6.*P＜0.05，**P＜0.01 vs WT group.圖7 雙螢光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

自從發(fā)現(xiàn)miRNA 以來，越來越多的證據(jù)表明它們?cè)诟鞣N疾病中起著重要作用，包括糖尿病和腎功能不全等［11］。此外，足細(xì)胞特異性敲除Dicer（一種參與miRNAs處理的必需酶）會(huì)導(dǎo)致小鼠的腎小球和腎小管發(fā)生損傷［12-13］。miR-192/216a/217［14］、miR-200a［15］和miR-29a/b/c［16］等參與糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展。另外，miR-23b已被證明是腫瘤和一些炎癥過程中免疫反應(yīng)的重要調(diào)節(jié)因子［17-18］，miR-23b 在免疫炎癥疾病以及腫瘤疾病中的表達(dá)會(huì)降低，可以抑制腫瘤細(xì)胞擴(kuò)散［17，19-20］。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)腎病綜合征患者無論是血清還是腎臟組織中的miR-23b 的表達(dá)水平都顯著降低。在miR-23b基因敲除小鼠上發(fā)現(xiàn)尿蛋白增高、腎小球系膜區(qū)擴(kuò)張、腎小球纖維粘連蛋白沉積增加、腎皮質(zhì)變薄等腎臟組織形態(tài)學(xué)上的改變，以及腎臟血管阻力指數(shù)顯著增高、激活腎素-血管緊張系統(tǒng)發(fā)生高血壓。RNA-Seq 測序發(fā)現(xiàn)腎臟總體變化基因富集于血流方面，腎臟總體變化基因與TargetScan 數(shù)據(jù)庫中miR-23b 靶基因交集的顯著變化富集于血流方面。根據(jù)上述生物信息學(xué)分析，Cxcl12是與血流關(guān)系最密切的基因［21-22］，為了進(jìn)一步闡明miR-23b 調(diào)節(jié)高血壓的機(jī)制，我們采用RTqPCR 方法，發(fā)現(xiàn)臨床腎病綜合征患者的Cxcl12的表達(dá)變化與miR-23b KO 小鼠相同。這些數(shù)據(jù)強(qiáng)烈地提醒我們miR-23b 可調(diào)控Cxcl12基因。我們進(jìn)行體外螢光素酶檢測miR-23b是否調(diào)控靶基因Cxcl12，發(fā)現(xiàn)miR-23b 過表達(dá)時(shí)可以顯著抑制Cxcl12螢光素酶測定。因此，我們更加確定miR-23b 通過調(diào)控靶基因Cxcl12發(fā)揮其生物學(xué)作用。

研究證實(shí)了抑制miR-23b 的表達(dá)可以促進(jìn)Cxcl12的升高，同時(shí)，miR-23b 通過調(diào)節(jié)靶基因Cxcl12影響腎性高血壓。研究表明miR-23b 可能成為治療腎性高血壓的一種有效的治療方法。雖然對(duì)于腎性高血壓的發(fā)生發(fā)展機(jī)制有很多的理論解釋，但是miRNA 在腎性高血壓的確切發(fā)生機(jī)制仍未完全闡明，在腎性高血壓中，影響Cxcl12的表達(dá)會(huì)通過怎樣的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)發(fā)揮作用還需要在以后的研究中進(jìn)一步驗(yàn)證。本文的研究結(jié)果為后續(xù)發(fā)現(xiàn)診斷、治療腎性高血壓的標(biāo)志物提供了有力的理論依據(jù)。