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    口服枸杞多糖對實驗性食管癌大鼠免疫功能影響的研究

    2012-05-30 10:54:28楊書良郝玉栓單鐵英胡素紅
    中國實驗診斷學(xué) 2012年6期
    關(guān)鍵詞:外周血食管機體

    楊書良,郝玉栓*,單鐵英,胡素紅

    (1.河北工程大學(xué)醫(yī)學(xué)院,河北 邯鄲056029;2.邯鋼職工醫(yī)院)

    枸杞多糖(lycium barbarum polysaccharides,LBP)作為枸杞子的主要活性成分已日益得到臨床醫(yī)生的高度重視。研究表明,LBP有增強機體的免疫功能和顯著的抗腫瘤效應(yīng),它能從調(diào)動機體自身的抗病能力出發(fā),在提高機體免疫力的同時殺傷腫瘤細(xì)胞[1];它能促進骨髓有核細(xì)胞數(shù)和粒/巨噬細(xì)胞集落數(shù)量的增加(CFU-GM);它還能誘導(dǎo)體內(nèi)多種細(xì)胞因子的產(chǎn)生,而這些因子均有促進免疫活性細(xì)胞增殖、分化和成熟的作用。所以臨床上普遍認(rèn)為LBP有較強的免疫活性,是有效的免疫增強劑,在細(xì)胞免疫和體液免疫中具有十分重要作用[2]。LBP的抗腫瘤作用是否與機體在腫瘤發(fā)生過程中,免疫效應(yīng)細(xì)胞(如CD4+T,CD8+T)和細(xì)胞因子(如IL-2、IL-10)增減有關(guān),目前報道較少。本研究以NMBA誘導(dǎo)大鼠食管癌為對象,觀察LBP在誘癌過程中對CD4+T、CD8+T細(xì)胞和血清IL-2、IL-10水平的影響,探討其防癌、抗癌作用的免疫學(xué)機制,為進一步開發(fā)免疫增強劑的抗腫瘤藥物提供參考。

    1 材料與方法

    1.1 實驗動物

    5~6周齡清潔級健康雄性F-344大鼠96只,購于上海斯萊克實驗動物中心。

    1.2 試劑與儀器 LBP由華北制藥集團新藥研究開發(fā)中心分離純化,純度>90%。NMBA(Osaka,Japan),純度 >98%。IL-2ELISA 試 劑 盒、IL-10 ELISA試劑盒(ADL)。小鼠抗大鼠CD4-FITC單抗(Caltag)。小鼠抗大鼠CD8-PE單抗(BD)。流式細(xì) 胞 儀 (FACS Vantage,Becton Dickin Son)。SCR20B型低溫高速離心機(日本HITACHI公司)。-80℃超低溫冰箱(SANYO)。雙目光學(xué)顯微鏡、顯微照像機(Olympus)。切片機(Leica)。

    1.3 方法

    1.3.1 動物實驗 大鼠恒溫(22~25℃)、恒濕(40~60%),滅菌飼料飼養(yǎng)。兩周后隨機將大鼠分為對照組、LBP組、NMBA誘癌組和誘癌+LBP組,每組24只。對照組大鼠生理鹽水灌胃5ml/kg/次/日;LBP組大鼠 LBP灌胃5ml/10mg/kg/次/日;NMBA誘癌組大鼠每周3次皮下注射NMBA(0.5 mg/kg/次);誘癌+LBP組大鼠在每周3次皮下注射 NMBA(0.5mg/kg/次)的同時LBP灌胃5ml/10mg/kg/次/日,所有大鼠用藥時間共6周。分別在第6、12和18周時從各組大鼠中取8只麻醉后解剖,取食管進行病理學(xué)觀察;采外周血做CD4+和CD8+T細(xì)胞數(shù),ELISA檢測技術(shù)檢測血清IL-2、IL-10水平。

    1.3.2 病理學(xué)觀察 將大鼠食管縱行剖開平鋪,肉眼觀察食管癌前病變發(fā)生情況,并對發(fā)生瘤體測量大小和計數(shù);取食管黏膜,常規(guī)石蠟包埋、制片,HE染色,在雙盲情況下光鏡觀察。

    1.3.3 外周血CD4+T、CD8+T細(xì)胞檢測 取不同熒光標(biāo)記的單克隆抗體各10μl,分別加入100μl肝素抗凝的全血,室溫下孵育15min,加入紅細(xì)胞裂解液,PBS洗滌2次,用流式細(xì)胞儀檢測。測定5000個細(xì)胞,記錄CD4+T、CD8+T細(xì)胞分別占淋巴細(xì)胞的百分比。

    1.3.4 血清IL-2、IL-10含量檢測 按照說明書測定。

    1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

    所有實驗數(shù)據(jù)用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理,實驗結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x—±s)表示,各組均數(shù)的比較采用單因素方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 一般狀況

    實驗期間各組大鼠體重呈正常生理性增長,各組間平均體重變化差異無統(tǒng)計學(xué)意義,第4周后,誘癌組大鼠出現(xiàn)皮毛蓬松,活動減少,弓背卷縮現(xiàn)象,但體重仍在增長。

    2.2 病理變化

    對照組、LBP組大鼠各時間點肉眼觀察,食管黏膜光滑,色澤正常,未發(fā)現(xiàn)腫瘤生長;誘癌組大鼠食管黏膜出現(xiàn)肉眼可見的多發(fā)或單發(fā)的隆起性病變(最大徑≥1mm為標(biāo)準(zhǔn))。鏡下觀察對照組、LBP組大鼠食管黏膜上皮細(xì)胞無異常表現(xiàn);誘癌組大鼠食管黏膜上皮表現(xiàn)為基底層細(xì)胞大小不一、核漿比例失調(diào)、核染色加深、核膜增厚等上皮內(nèi)瘤變表現(xiàn)(以Ⅲ級為計算標(biāo)準(zhǔn));誘癌+LBP組大鼠食管黏膜上皮細(xì)胞變化明顯減輕(表1)。實驗結(jié)果充分說明NMBA誘發(fā)大鼠食管模型可靠,LBP對食管黏膜癌變的發(fā)生有一定的抑制作用。

    2.3 外周血CD4+T、CD8+T細(xì)胞

    各組測定結(jié)果見表2。

    2.4 血清IL水平

    見表3。

    表1 不同組別大鼠食管腫瘤發(fā)生率和食管黏膜上皮內(nèi)瘤變Ⅲ級發(fā)生率(%,n=8)

    表2 不同組別大鼠外周血CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞(%,n=8,x—±s)

    表3 不同組別大鼠血清IL-2、IL-10水平(pg/ml,n=8,x—±s)

    3 討論

    傳統(tǒng)中草藥以低毒、價廉、有效、易于接受等優(yōu)點在腫瘤防治研究領(lǐng)域越來越受到人們的關(guān)注[3]。枸杞子性平、味甘,具有滋補肝腎、益精明目的功效,LBP是枸杞子經(jīng)脫脂、水提、反復(fù)醇析所得。LBP具有較強的免疫活性,是有效的免疫增強劑,在細(xì)胞免疫和體液免疫中具有十分重要作用[4]。本研究以NMBA誘發(fā)食管癌大鼠為實驗?zāi)P?,探討LBP在其誘癌過程中抗腫瘤作用的免疫學(xué)機制,為開發(fā)以免疫增強劑為主的防治腫瘤藥物提供參考。

    外周血CD4+、CD8+T細(xì)胞數(shù)量的多少及血清細(xì)胞因子水平的高低,可直接反映出機體的免疫狀態(tài),研究發(fā)現(xiàn)腫瘤患者外周血中CD4+、CD8+T細(xì)胞數(shù)量減少,導(dǎo)致機體抗腫瘤免疫反應(yīng)降低,最終發(fā)生腫瘤。LBP作為一種“植物疫苗”進入腸道后,可通過抗原遞呈細(xì)胞上的“MHC-肽”與T細(xì)胞受體(TCR)聚合。CD4或CD8的存在可穩(wěn)定TCR和MHC-肽之間的相互作用可使免疫受體酪氨酸激活基序 (ITAM)發(fā) 生 磷 酸 化 從 而 激 活 T 細(xì) 胞[5-8]。CD4+T細(xì)胞是一群具有調(diào)節(jié)體液和細(xì)胞介導(dǎo)免疫功能的細(xì)胞,他們的分化受許多因素的影響,其中最重要的因素就是細(xì)胞因子。IL-2在機體免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)中處于中心地位,IL-2能促進外周血單核細(xì)胞產(chǎn)生TNF,從而增強抗腫瘤的作用。由于IL-2的含量與機體的免疫功能相關(guān),尤其是與細(xì)胞免疫功能密切相關(guān),因此可將IL-2的產(chǎn)生作為細(xì)胞免疫效應(yīng)的主要指標(biāo)。靜止的自然殺傷細(xì)胞(NK細(xì)胞)表達IL-2受體的β鏈,一種70kDa的中等親和力受體,IL-2可直接將其激活,NK細(xì)胞激活后能釋放γ干擾素(IFNγ)和其他細(xì)胞因子殺傷瘤細(xì)胞[9-11]。所有這些細(xì)胞都能對IL-2產(chǎn)生反應(yīng),獲得非特異細(xì)胞毒功能,這些細(xì)胞統(tǒng)稱為淋巴因子活化的殺傷細(xì)胞(LAK細(xì)胞)。LAK細(xì)胞與NK細(xì)胞相比,它不但能殺傷新鮮的腫瘤細(xì)胞,而且對許多不同譜系的腫瘤細(xì)胞也有殺傷作用。本研究顯示,LBP具有增加外周血CD4+、CD8+T細(xì)胞和增加細(xì)胞因子IL-2的分泌的作用,可形成較強的免疫活性,是有效的免疫增強劑,在細(xì)胞免疫和體液免疫中具有十分重要作用。

    人體腫瘤的發(fā)生發(fā)展與免疫功能的改變有著密切的關(guān)系,由于機體免疫監(jiān)視的缺陷,導(dǎo)致免疫逃逸的發(fā)生,使腫瘤發(fā)生率增高。腫瘤發(fā)生時腫瘤細(xì)胞本身也可分泌IL-10,IL-10通過抑制單核/巨噬細(xì)胞、Th細(xì)胞、CTL細(xì)胞和NK細(xì)胞等來抑制機體對腫瘤的免疫作用,使腫瘤細(xì)胞發(fā)生逃逸現(xiàn)象。在惡性腫瘤病人中血清IL-10大多數(shù)情況下是增高的,且IL-10的高低與腫瘤病人的治療效應(yīng)和病情相關(guān),血清IL-10增高的腫瘤患者在經(jīng)手術(shù)或化療后明顯下降[13-15]。本研究顯示,誘癌組大鼠血清IL-10水平在第6周明顯升高,隨著時間的推移雖然有所下降,但下降并不明顯。誘癌+LBP組大鼠血清中IL-10水平明顯低于誘癌組大鼠,但高于對照組和LBP組。12周前血清IL-10水平顯著下降,12周下降不明顯,與誘癌組各時間點比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義,但與對照組各時間點比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。研究結(jié)果說明NMBA誘癌過程中,大鼠的抗腫瘤免疫狀態(tài)是受抑制的,血清IL-10水平可反映出腫瘤患者抗腫瘤免疫狀態(tài)。

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