胃腸道間質(zhì)瘤中DNMT1、DNMT3a和DNMT3b的表達(dá)及其DNA甲基化

郝利娜 王覓柱 陳玉

[摘要] 目的 檢測胃腸道間質(zhì)瘤（GIST）組織及瘤旁組織中DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1（DNMT1）、DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3a（DNMT3a）和DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3b（DNMT3b）的表達(dá)，并研究整體DNA甲基化。 方法 選取包頭醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院2017年1月至2020年1月內(nèi)鏡下切除的GIST組織30例及瘤旁組織30例，應(yīng)用免疫組化和qRT-PCR方法檢測GIST組織和瘤旁組織中DNMT1、DNMT3a和DNMT3b蛋白和mRNA的表達(dá)情況;應(yīng)用亞硫酸氫鹽限制性酶切分析技術(shù)（COBRA）分析重復(fù)序列LINE-1的甲基化水平。 結(jié)果 GIST中DNMT1 mRNA的表達(dá)與瘤旁組織比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;GIST中的DNMT3a mRNA表達(dá)高于瘤旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）;GIST中的DNMT3b mRNA表達(dá)高于瘤旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。DNMT1蛋白在GIST及瘤旁組織中的陽性率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=1.000）;DNMT3a蛋白在GIST中的陽性率高于瘤旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.045）;DNMT3b蛋白在GIST中的陽性率高于瘤旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.017）。GIST中LINE-1序列的甲基化水平低于瘤旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）;GIST中LINE-1序列的非甲基化水平高于瘤旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.001）。 結(jié)論 DNMT1、DNMT3a和DNMT3b的異常表達(dá)與GIST的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系，具體機(jī)制可能與降低整體甲基化水平有關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 胃腸道間質(zhì)瘤;DNA甲基轉(zhuǎn)移酶;基因表達(dá);免疫組化;甲基化

[中圖分類號] R573? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2021）08-0039-04

Expression and DNA methylation of DNMT1， DNMT3a and DNMT3b in gastrointestinal stromal tumors

HAO Li′na1? ?WANG Mizhu2? ?CHEN Yu3

1.Clinical Medicine， Graduate School， Baotou Medical College， Inner Mongolia University of Science and Technology， Baotou? ?014040， China; 2.Department of Gastroenterology， the Second Affiliated Hospital of Baotou Medical College， Baotou? ?014030， China; 3.General Practice， Inner Mongolia Baogang Hospital， Baotou? ?014010， China

[Abstract] Objective To detect the expression of DNA methyltransferase 1（DNMT1）， DNA methyltransferase 3a （DNMT3a） and DNA methyltransferase 3b （DNMT3b） in gastrointestinal stromal tumor （GIST） tissues and adjacent tissues， and to study the overall DNA methylation. Methods A total of 30 cases of GIST and 30 cases of adjacent tissues were collected， all of which were resected under endoscopy in the Second Affiliated Hospital of Baotou Medical College from January 2017 to January 2020. Immunohistochemistry and qRT-PCR methods were used to detect the expression of DNMT1， DNMT3a and DNMT3b proteins and mRNA in GIST and adjacent tissues; combined bisulfite restrition analysis （COBRA） was used to analyze the methylation level of repetitive sequence LINE-1. Results The expression of DNMT1 mRNA in GIST was not different from that of adjacent tissues， and the difference was not statistically significant（P>0.05）. The expression of DNMT3a mRNA in GIST was higher than that in adjacent tissues， and the difference was statistically significant（P<0.001）; the expression of DNMT3b mRNA in GIST was higher than that of adjacent tissues， and the difference was statistically significant （P<0.001）. There was little difference in the positive rate of DNMT1 protein in GIST and adjacent tissues， and the difference was not statistically significant（P=1.000）; the positive rate of DNMT3a protein in GIST was higher than that in adjacent tissues， and the difference was statistically significant（P=0.045）; the positive rate of DNMT3b protein in GIST was higher than that in adjacent tissues， and the difference was statistically significant （P=0.017）. The methylation level of LINE-1 in GIST was lower than that in the adjacent tissue， and the difference was statistically significant （P<0.001）; the non-methylation level of LINE-1 in GIST was higher than that in adjacent tissues， and the difference was statistically significant （P=0.001）. Conclusion The abnormal expression of DNMT1， DNMT3a and DNMT3b is closely related to the occurrence and development of GIST， and the specific mechanism may be related to the reduction of overall methylation level.

[Key words] Gastrointestinal stromal tumor; DNA methyltransferase; Gene expression; Immunohistochemistry; Methylation

胃腸道間質(zhì)瘤（Gastrointestinal stromal tumors，GIST）在胃腸道腫瘤中最常見，可能來自于Cajal間質(zhì)細(xì)胞（Interstitial cells of cajals，ICCs）或干細(xì)胞前體細(xì)胞。在GIST中，存在異常甲基化的報(bào)道[1]，從消化道上皮增生到形成浸潤病灶的過程中，DNA甲基化扮演了重要的角色。DNA甲基轉(zhuǎn)移酶催化并維持DNA的基本結(jié)構(gòu)和功能[2]，到目前為止，有3種DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNA methyltransferase，DNMT）被發(fā)現(xiàn)[3]，即DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1（DNA methyltransferase 1，DNMT1）、DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3a（DNA methyltransferase 3a，DNMT3a）和DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3b（DNA methyltransferase 3b，DNMT3b），此三者同時(shí)調(diào)節(jié)DNA的甲基化。本研究旨在通過檢測DNA甲基轉(zhuǎn)移酶在GIST和瘤旁組織中的表達(dá)變化，以及整體DNA的甲基化水平，觀察DNA甲基轉(zhuǎn)移酶在GIST發(fā)生發(fā)展中的作用，以期尋找新的消化道腫瘤生物標(biāo)志物。

1 資料與方法

1.1 一般資料

隨機(jī)選取包頭醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院2017年1月至2020年1月內(nèi)鏡下切除的GIST組織30例及瘤旁組織30例，全部病例均經(jīng)病理確診。納入標(biāo)準(zhǔn)：患者未經(jīng)任何抗腫瘤藥物治療或未接受放化療治療;瘤旁組織距離腫瘤切緣>5 cm，且標(biāo)本未經(jīng)任何生物化學(xué)處理。排除標(biāo)準(zhǔn)：患者曾接受相關(guān)治療;瘤旁組織距離腫瘤太近;標(biāo)本經(jīng)過甲醛溶液浸泡。

1.2 方法

1.2.1 試劑? 提取RNA試劑盒（北京中山金橋）;反轉(zhuǎn)錄試劑盒（北京中山金橋）;鼠抗DNMT1單克隆抗體（工作濃度1∶50）、鼠抗DNMT3a單克隆抗體（工作濃度1∶50）、兔抗DNMT3b多克隆抗體（美國Santa Cruz公司，工作濃度1∶100）;DAB顯色試劑盒（北京中杉金橋）;限制性內(nèi)切酶Taq1、Tsp509I（美國Santa Cruz公司）;甲基化試劑盒（美國Santa Cruz公司）。

1.2.2 qRT-PCR法? 使用RNA試劑盒從GIST和瘤旁組織中提取RNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA;采用cDNA作為反應(yīng)的模板，在Real-time PCR儀上進(jìn)行反應(yīng)（表1）。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s，60℃復(fù)性60 s，反應(yīng)40個循環(huán)。所有Real-time PCR數(shù)據(jù)的Ct值通過內(nèi)參基因的Ct值進(jìn)行均一化處理（ΔΔCt=ΔCt-ΔCt β-actin），處理完成后，mRNA的相對平均表達(dá)量值以ΔΔCt值（DDvalue）的形式進(jìn)行計(jì)算，即ΔΔCt=2-ΔCt，并以此定量。

1.2.3 免疫組化法? GIST組織標(biāo)本連續(xù)切片貼附于經(jīng)多聚賴氨酸處理的玻片上，80℃烘烤50 min;光鏡下觀察切片中DNMTl、DNMT3a和DNMT3b蛋白的表達(dá)和分布情況，每張切片選取5個高倍視野（200×）。DNMT1和DNMT3a主要為細(xì)胞核陽性表達(dá)，DNMT3b主要為局灶性核及胞漿陽性表達(dá)，陽性染色均為棕黃色（≤5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分）。著色評分：不著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，褐色為3分。

1.2.4 整體DNA甲基化水平? 采用DNA提取試劑盒提取GIST組織和瘤旁組織中的DNA，DNA引物序列如下：LINE-1-F：5′-CCGTAAGGGGTTAGGGAGTT TTT-3′;LINE-1-R：5′-RTAAAACCCTCRAACCAAATATAA A-3′，以LINE-1作為引物，通過PCR擴(kuò)增此序列。利用偏重亞硫酸氫鹽限制性酶切分析（Combined bisulfite restrition analysis，COBRA）LINE-1序列代表的整體甲基化水平。PCR產(chǎn)物用10UTaq1、Tsp509I消化。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用（x±s）表示，采用t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料用[n（%）]表示，采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 GIST和瘤旁組織中DNMT mRNA的表達(dá)

GIST中DNMT1 mRNA的表達(dá)水平為（0.139±0.074），瘤旁組織的表達(dá)水平為（0.107±0.051），兩組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=1.950，P=0.056）。見圖1A。GIST中DNMT3a mRNA的表達(dá)水平為（0.344±0.165），高于瘤旁組織的（0.147±0.087），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=5.785，P<0.001）。

2.2 GIST和瘤旁組織中DNMT蛋白的表達(dá)

DNMT1蛋白在GIST及瘤旁組織中的陽性率分別為13.3%（4/30）及10.0%（3/30），差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.000，P=1.000）;DNMT3a蛋白在GIST及瘤旁組織中的陽性率分別為40.0%（12/30）及16.7%（5/30），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.022，P=0.045）;DNMT3b蛋白在GISI及瘤旁組織中的陽性率分別為53.3%（16/30）及23.3%（7/30），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=5.711，P=0.017）。

2.3 GIST基因組的甲基化水平

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（收稿日期：2020-08-20）