各基因亞型乳腺癌間基因組拷貝數(shù)變異的比較

王智輝，鐘媚共，陳秋旋，孟子杰，伍婉婷，鄭焱，張鑫

0 引言

乳腺癌是最常見的女性惡性腫瘤，近四十年間，全球乳腺癌發(fā)病率保持上升趨勢，嚴(yán)重威脅著女性健康[1-2]。乳腺癌是生物學(xué)高度異質(zhì)的惡性腫瘤，臨床最為常見且惡性程度較高的是浸潤性乳腺癌，根據(jù)組織形態(tài)進(jìn)一步分為浸潤性導(dǎo)管癌（invasive ductal carcinoma,IDC）和浸潤性小葉癌（invasive lobular carcinoma,ILC）等，并以IDC為臨床的主要病理類型[3]。然而，同樣的病理類型在臨床生物學(xué)特征及治療反應(yīng)性上常常截然不同，這是因?yàn)樘卣骰虻耐蛔兣c異常表達(dá)往往更能反映乳腺癌的治療反應(yīng)及患者預(yù)后[4]，隨著高通量基因檢測技術(shù)的成熟應(yīng)用，乳腺癌基因特征與臨床特征的關(guān)系逐漸清晰，由此建立病理基因分型逐步被臨床所接受并廣泛應(yīng)用。

乳腺癌基因分型的方法有多種，主要通過基因的表達(dá)譜算法和免疫組織化學(xué)判讀等，雖然不同的分型方法在具體樣品的判斷中存在差異，但群體的分類重復(fù)性上基本相似[5]。臨床上公認(rèn)的四個(gè)基因亞型為管腔A型（Luminal A,LumA）、管腔B型（Luminal B,LumB）、人表皮生長因子受體2過表達(dá)型（HER2 overexpression,Her2）和基底細(xì)胞樣型（Basal-like,BasL），其中BasL型基本等同于免疫組織化學(xué)分型中的三陰乳腺癌（triple negative breast carcinoma,TNBC）[6]?，F(xiàn)已知Her2型乳腺癌的特征是人表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2,HER2）的過表達(dá)及下游通路的持續(xù)激活，而其編碼基因ERBB2（erb-B2 receptor tyrosine kinase 2）的擴(kuò)增是HER2蛋白過表達(dá)的主要原因[4]，迄今未見系統(tǒng)性報(bào)道其余三個(gè)基因亞型的基因組拷貝數(shù)變異（copy number variations,CNV）特征，因此，本課題組通過全基因組CNV分析，在癌癥基因組圖譜數(shù)據(jù)庫（The Cancer Genome Atlas,TCGA,https://gdc-portal.nci.nih.gov/）中挖掘出與基因分型相關(guān)的CNV并加以驗(yàn)證。

1 資料與方法

1.1 TCGA乳腺癌的AIMS分型及全基因組CNV分析

下載TCGA中乳腺癌的表達(dá)譜測序數(shù)據(jù)、基因組拷貝信息及對(duì)應(yīng)樣品的臨床信息，數(shù)據(jù)庫的更新下載日期為2020年1月31日。參考本課題組已發(fā)表文獻(xiàn)[5]，在R語言（版本3.2.2）程序平臺(tái)上，使用AIMS程序包（版本1.2.0）對(duì)每個(gè)樣品的表達(dá)譜進(jìn)行基因分型，納入LumA、LumB、Her2和BasL四個(gè)基因亞型及臨床信息詳細(xì)的1 006例乳腺癌病例。參考本課題組已發(fā)表文獻(xiàn)[7]，利用GISTIC 2.0軟件分析腫瘤組織的全基因組拷貝信息，運(yùn)行所得的關(guān)鍵數(shù)據(jù)有：（1）每個(gè)探針標(biāo)記位點(diǎn)的擴(kuò)增或缺失情況，即G評(píng)分（G-score）。G評(píng)分的高低能綜合反映該位點(diǎn)的擴(kuò)增或缺失的深度和頻率；（2）每個(gè)樣品中單個(gè)基因的拷貝數(shù)變異情況，包括深度缺失（Deep deletion）、淺度缺失（Shallow deletion）、二倍體（Diploid）、第三拷貝獲得（Gain）和顯著擴(kuò)增（Amplification）五個(gè)狀況；其中在分析缺失中，將深度缺失及淺度缺失均納入為缺失，而在擴(kuò)增分析中，僅將顯著擴(kuò)增定義為擴(kuò)增，并在R4.0.2軟件中對(duì)各基因在不同基因亞型的拷貝數(shù)分布進(jìn)行卡方檢驗(yàn)（Chi-square test函數(shù)），并采用Benjamin-Hochberg方法（p.adjust函數(shù)）進(jìn)行P值校正，得到Q值。

1.2 患者一般信息

收集整理2017年1月—2019年12月在江門市中心醫(yī)院就診的浸潤性乳腺癌324例，均為原發(fā)灶的手術(shù)或活檢檢查后的剩余標(biāo)本，取樣前均未行任何新輔助治療，保存在該院臨床生物資源庫中。TCGA與江門市中心醫(yī)院乳腺癌患者的一般信息見表1，兩組樣品在性別、年齡、病理類型、臨床分期和基因分型的分布差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。本研究為回顧性研究，已申請(qǐng)并獲批免患者知情同意，且整個(gè)項(xiàng)目經(jīng)江門市中心醫(yī)院倫理委員會(huì)審查并批準(zhǔn)（2020-51號(hào)）。

表1 TCGA及江門市中心醫(yī)院浸潤性乳腺癌患者的基本信息Table 1 General information of invasive breast carcinoma patients in TCGA and Jiangmen Central Hospital

1.3 qPCR檢測石蠟標(biāo)本的基因拷貝數(shù)變異

參考本課題組已發(fā)表文獻(xiàn)[7]，調(diào)取石蠟組織切片，利用GeneRead DNA FFPE Kit按操作說明書提取石蠟切片的DNA；利用Taq-Man Copy Number Assay的熒光定量PCR引物Hs00450668_cn檢測ERBB2基因拷貝數(shù)，引物Hs03853983_cn檢測TFDP1基因拷貝數(shù)，引物Hs06966674_cn檢測MIR148B基因拷貝數(shù)，引物Hs01978234_cn檢測CCND1基因拷貝數(shù)，引物Hs00738157_cn檢測MDM2基因拷貝數(shù)，引物Hs06266734_cn檢測MIR139基因拷貝數(shù)，其中內(nèi)參引物為TaqMan Copy Number Reference Assay RNase P，二倍體參考樣品為健康人血漿白膜層樣品，擴(kuò)增試劑盒為TaqMan Fast Advanced Master Mix，按說明書在CFX96熒光定量PCR儀中檢測。規(guī)定樣品中目標(biāo)基因的相對(duì)拷貝數(shù)檢測值小于0.75為缺失（Deletion），大于1.9為顯著擴(kuò)增（Amplification）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

計(jì)數(shù)資料用頻數(shù)表示，用R4.0.2、Excel 2016及GraphPad Prism7.0軟件處理數(shù)據(jù)，各組間頻數(shù)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)使用卡方檢驗(yàn)（Chi-squared test）或Fisher’s精確檢驗(yàn)（Fisher’s exact test），檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，組間頻數(shù)的兩兩比較使用rcompanion程序包的pairwiseNominalIndependence函數(shù)，并采用函數(shù)內(nèi)默認(rèn)的Benjamin-Hochberg方法進(jìn)行P值校正，得到Q值。

2 結(jié)果

2.1 TCGA中各亞型的擴(kuò)增區(qū)段分析

除BasL型外，另外3種亞型乳腺癌的擴(kuò)增峰較為聚集，且熱點(diǎn)擴(kuò)增峰的G評(píng)分較高，可達(dá)0.8以上。以軟件默認(rèn)的FDR＜0.25為顯著性擴(kuò)增的閾值，可發(fā)現(xiàn)BasL型的特征峰有1q43和13q34，LumB型的特征峰為12q15，Her2型的特征峰為17q12；而11q13.3在Her2型、LumA型及LumB型中擴(kuò)增，在BasL型中無擴(kuò)增，見圖1。

2.2 TCGA中各亞型的缺失區(qū)段分析

相對(duì)于全基因組的擴(kuò)增情況，各亞型缺失區(qū)段缺少明顯的規(guī)律，且G評(píng)分也普遍較低，在0.2左右。6q15在Her2型、LumA型及LumB型中缺失，11q13.4特異性在LumB型中缺失，12q13.13特異性在BasL型中缺失，21q21.1在Her2型和LumB型中缺失，見圖2。

圖1 TCGA中各亞型的擴(kuò)增區(qū)段分析Figure 1 Amplified chromosome regions of each subtype from TCGA

圖2 TCGA中各亞型的缺失區(qū)段分析Figure 2 Deleted chromosome regions of each subtype from TCGA

2.3 TCGA中各拷貝數(shù)變異熱點(diǎn)基因在各亞型間的分布

利用IGV軟件并結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道（見討論部分），確定各區(qū)段的擴(kuò)增或缺失關(guān)鍵基因：1q43為絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶Akt-3（AKT serine/threonine kinase 3,Akt3）、11q13.3為細(xì)胞周期蛋白D1（Cyclin D1,CCND1）、12q15為原癌基因MDM2（MDM2 proto-oncogene,MDM2）、13q34為轉(zhuǎn)錄因子Dp-1（transcription factor Dp-1,TFDP1）、17q12為Erb-B2受體酪氨酸激酶2（Erb-B2 receptor tyrosine kinase 2,ERBB2）、6q15為絲裂原活化蛋白激酶7（mitogen-activated protein kinase kinase kinase 7,MAP3K7）、11q13.4為微小RNA-139（microRNA 139,MIR139）、12q13.13為微小RNA-148B（microRNA 148B,MIR148B）及21q21.1為微小RNA Let-7c（microRNA Let-7c,MIRLET7C）。上述熱點(diǎn)基因的CNV在四種亞型的分布差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），其中，在BasL型中，TFDP1（13q34）的擴(kuò)增和MIR148B（12q13.13）的缺失占比高；在Her2型中，ERBB2（17q12）的擴(kuò)增是最顯著的特征；LumB型中，CCND1（11q13.3）和MDM2（12q15）的擴(kuò)增及MIR139（11q13.4）的缺失占比高；而未見LumA型的特異性CNV熱點(diǎn)基因，見表2。

2.4 ERBB2的拷貝數(shù)變異與Her2型乳腺癌的相關(guān)性

將ERBB2的擴(kuò)增定義為陽性事件，比較發(fā)現(xiàn)，在TCGA中Her2型陽性事件發(fā)生率為55.2%，BasL型和LumA型的陽性率均低于或等于4.4%，而LumB型較高，可達(dá)16.8%；在江門市中心醫(yī)院樣品中，Her2型陽性事件發(fā)生率為86.7%，BasL型和LumA型的陽性率均為0，而LumB型為2.0%，組間分布差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見表3。

2.5 TFDP1/MIR148B的拷貝數(shù)變異與BasL型乳腺癌的相關(guān)性

表2 TCGA中各拷貝數(shù)變異熱點(diǎn)基因在各亞型間的分布Table 2 Distribution of CNV hotspot genes among subtypes from TCGA

表3 ERBB2的拷貝數(shù)變異在各基因亞型間的分布Table 3 Distribution of CNV of ERBB2 among gene subtypes

將TFDP1的擴(kuò)增或MIR148B的缺失定義為陽性事件，分析發(fā)現(xiàn)57.8%的BasL型發(fā)生了TFDP1的擴(kuò)增或MIR148B的缺失，而其他亞型的陽性事件發(fā)生率均低于或等于15.2%，分布差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。江門市中心醫(yī)院樣品中71.4%的BasL型發(fā)生了TFDP1的擴(kuò)增或MIR148B的缺失，而其他亞型的陽性事件發(fā)生率均低于或等于19.5%，組間分布均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見表4。

表4 TFDP1/MIR148B的拷貝數(shù)變異在各基因亞型間的分布Table 4 Distribution of CNV of TFDP1/MIR148B among gene subtypes

2.6 CCND1/MDM2/MIR139的拷貝數(shù)變異與LumB型乳腺癌的相關(guān)性分析

將CCND1或MDM2的擴(kuò)增或MIR139的缺失定義為陽性事件，分析發(fā)現(xiàn)，47.6%的LumB型發(fā)生了CCND1或MDM2的擴(kuò)增或MIR139的缺失，而其他亞型的陽性事件發(fā)生率均低于35%，分布差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。江門市中心醫(yī)院樣品中61.8%的LumB型發(fā)生了CCND1或MDM2的擴(kuò)增或MIR139的缺失，而其他亞型乳腺癌的陽性事件發(fā)生率均低于或等于20.0%，組間分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表5。

表5 CCND1/MDM2/MIR139的拷貝數(shù)變異在各基因亞型間的分布Table 5 Distribution of CNV of CCND1/MDM2/MIR139 among gene subtypes

3 討論

本研究首先利用AIMS分型軟件，將TCGA數(shù)據(jù)庫中的乳腺癌患者按表達(dá)譜進(jìn)行基因分型，再利用GISTIC2.0軟件分別對(duì)BasL型、Her2型、LumA型和LumB型患者的腫瘤組織進(jìn)行全基因組CNV分析，發(fā)現(xiàn)：（1）相對(duì)于其他三種亞型，BasL型的擴(kuò)增峰較為雜亂，表明BasL型乳腺癌的發(fā)生過程中維持基因組穩(wěn)定及參與修復(fù)的功能受損，這與BasL型有高頻率的腫瘤相關(guān)蛋白53（tumor protein 53,TP53）和乳腺癌易感基因1（breast cancer 1,BRCA1）突變相一致[4]；（2）相對(duì)于全基因組的擴(kuò)增情況，各亞型缺失區(qū)段缺少明顯的規(guī)律，且具體缺失區(qū)段的程度和頻率均較低，表明在各亞型中抑癌基因的功能失活只有小部分與缺失相關(guān)，這與同行的研究[8]結(jié)論相似；（3）BasL型中有高比例的13q34擴(kuò)增和12q13.13缺失，Her2型有高比例的17q12擴(kuò)增，LumB型的特征為高比例的12q15擴(kuò)增和11q13.4缺失，而LumA型則無特異性擴(kuò)增或缺失的染色體區(qū)段，這部分發(fā)現(xiàn)值得進(jìn)一步討論。

位于17q12區(qū)段的關(guān)鍵癌基因ERBB2的擴(kuò)增是Her2型乳腺癌的重要分子特征，江門市中心醫(yī)院樣品結(jié)果顯示，ERBB2（17q12）在Her2型乳腺癌中顯著擴(kuò)增，雖然與其他亞型間的分布比例有顯著性差異，但無法做到100%的區(qū)分，其原因主要是：（1）相對(duì)于臨床常用的免疫組織化學(xué)及熒光原位雜交法[9]，本研究采用的qPCR法和TCGA的高通量分析均無法完全排除腫瘤組織中的原位癌、壞死及間質(zhì)成分；（2）各種方法中，對(duì)于臨界值的爭議依然存在，無法完全做到客觀分析。不過，相比于TCGA，江門市中心醫(yī)院樣品的驗(yàn)證過程中，盡可能采用顯微切割的方法，剔除了大部分非目標(biāo)區(qū)域組織，其臨床一致性較高，可以作為TCGA分析結(jié)果的驗(yàn)證支持?jǐn)?shù)據(jù)。

隨后，用TFDP1（13q34）的擴(kuò)增或MIR148B（12q13.13）的缺失定義為BasL型乳腺癌的特征分子事件，通過對(duì)TCGA的分析及江門市中心醫(yī)院樣品的驗(yàn)證，可知該事件在BasL型的陽性率比其他各亞型高3.6～7.3倍，且差異具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明BasL型乳腺癌中有高比例的TFDP1/MIR148B拷貝數(shù)變異。已有研究報(bào)道，BasL型乳腺癌或TNBC存在較高比例的13q34區(qū)段擴(kuò)增[10]，且該區(qū)段的擴(kuò)增能導(dǎo)致TFDP1蛋白水平的上調(diào)，而TFDP1為細(xì)胞周期啟動(dòng)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子家族E2Fs的共激活因子，體外實(shí)驗(yàn)證明，沉默TFDP1能有效抑制生長因子驅(qū)動(dòng)的乳腺癌細(xì)胞增殖[11]，這表明TFDP1很可能參與了BasL型乳腺癌的惡性生物學(xué)行為，是潛在的特異性靶點(diǎn)。同樣，值得我們注意的是，有報(bào)道指出miR-148b具有抑制多種惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移能力，過表達(dá)miR-148b能抑制乳腺癌細(xì)胞浸潤破壞血管內(nèi)皮層，抑制乳腺癌等多種惡性腫瘤的體內(nèi)轉(zhuǎn)移[12-13]，這提示MIR148B的缺失可能與BasL型乳腺癌部分患者的高轉(zhuǎn)移臨床表型相關(guān)，值得進(jìn)一步挖掘其臨床轉(zhuǎn)化價(jià)值。

在四個(gè)分子分型中，LumA型和LumB型的區(qū)分標(biāo)準(zhǔn)還存在一定的爭議，我們利用全基因組CNV分型也未能發(fā)現(xiàn)LumA型中較典型的擴(kuò)增或缺失峰，只觀察到CCND1（11q13.3）和MDM2（12q15）的擴(kuò)增及MIR139（11q13.4）的缺失在LumB型中的比例更高，其中，TCGA的LumA型和LumB型發(fā)生CCND1/MDM2/MIR139拷貝數(shù)變異情況的比例分別是25%和48%，江門市中心醫(yī)院樣品的比例分別是14%和62%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。雖然未見MIR139在乳腺癌組織中缺失的報(bào)道，但已有大量文獻(xiàn)報(bào)道，CCND1和MDM2在LumB型乳腺癌中的顯著擴(kuò)增，其中CCND1的擴(kuò)增是細(xì)胞周期素依賴性激酶4/6（cyclin-dependent kinase 4/6,CDK4/6）抑制劑帕博西尼（Palbociclib）的伴隨診斷用藥指標(biāo)[14]，而MDM2的擴(kuò)增能通過抑制p53蛋白的功能促進(jìn)乳腺癌化療抵抗，是潛在的治療靶點(diǎn)[15]。雖然本研究挖掘到了較新穎的乳腺癌分子分型標(biāo)志物，但具體的臨床價(jià)值還需要進(jìn)一步加以驗(yàn)證。