專用采血管對血漿中循環(huán)游離DNA保存效果的影響*

徐 鵬，段小瑜△，張海梅，原昆鵬

1.威高集團有限公司國家工程實驗室，山東威海 264210;2.山東高創(chuàng)醫(yī)療器械國家研究院有限公司，山東威海 264210;3.山東威高集團醫(yī)用高分子制品股份有限公司，山東威海 264210

循環(huán)游離DNA(cfDNA)是指存在于人體外周血液中、游離于細胞之外的DNA，包括細胞溶解破裂后釋放到血液中的DNA及胎兒細胞和突變細胞釋放到血液中的外源DNA。血液中cfDNA被發(fā)現(xiàn)已經(jīng)超過60年了[1]，然而直到1977年LEON和他的同事在癌癥患者血液中發(fā)現(xiàn)cfDNA水平升高，cfDNA在臨床醫(yī)學中的重要性才被人們所意識到[2]。近幾年由于DNA分離提取、定量檢測及測序等分子生物學技術的發(fā)展，對cfDNA的研究和臨床應用也取得突破，尤其在產(chǎn)前診斷、腫瘤疾病的篩查、治療檢測和預后評估等方面表現(xiàn)出令人振奮的應用潛力。

孕婦血漿中的cfDNA在無創(chuàng)遺傳病產(chǎn)前診斷中發(fā)揮重要作用[3]。研究表明，胎兒和腫瘤細胞來源的cfDNA水平非常低，僅占總cfDNA水平的10%以下[4]，因此cfDNA檢測的準確性和可靠性是其后續(xù)臨床應用的基本保障。在血液標本的體外儲存和運輸過程中，不可避免地伴隨著白細胞基因組DNA的釋放及核酸酶對cfDNA的降解[5]，導致特異的cfDNA片段大小和比例發(fā)生變化，大量母源DNA的釋放會影響胎兒DNA的檢出，尤其會增加與母源DNA序列差異不大的胎兒DNA序列的檢出[6]。臨床檢測cfDNA時，阻止基因組DNA污染的一種處理方式是靜脈采血后立即處理血樣，但這種方式會限制cfDNA作為生物標志物的應用范圍，尤其在缺乏血漿分離和低溫儲藏設備的地區(qū)，而使用cfDNA專用采血管采集血液標本，血液標本經(jīng)常溫保存和長時間運輸后，仍能從血漿中提取得到高質量的cfDNA，這種專用采血管在無創(chuàng)產(chǎn)前診斷和腫瘤防控中顯示出重要作用。不同實驗室對血漿cfDNA片段分布進行測序研究，結果一致表明，cfDNA片段大小主要分布在166 bp[7-8]，cfDNA片段大小成為利用PCR技術進行定量檢測時首要考慮的因素[9]。本文采用人Leptin基因166 bp片段來研究不同保存時間血漿中cfDNA水平變化情況，與EDTA-K2抗凝管對比，探討cfDNA專用采血管對延長血液中cfDNA保存時間的效果。

1 資料與方法

1.1儀器和設備 EDTA-K2抗凝管(E)為威高集團產(chǎn)品，cfDNA專用采血管K及cfDNA專用采血管A為兩個cfDNA保存管品牌。游離DNA提取試劑盒品牌為海貍生物。熒光定量PCR儀品牌為西安天隆Gentier 96 E。

1.2招募志愿者 志愿者來自威高集團職工，年齡25～30歲，健康的男性和女性各10例，入選的志愿者均被告知并簽署知情同意書。

1.3方法

1.3.1血液采集 所有志愿者均空腹進行血液采集，實驗分6個時間點采集每例志愿者的血液標本到一支10 mL的EDTA-K2抗凝管和兩支10 mL cfDNA專用采血管中，采血量達到管壁標簽標示刻度體積，每管采血完畢后立即輕柔倒轉顛倒混勻10次，充分混勻血樣與保護劑，將所有采血管放置于室溫儲存。

1.3.2血漿分離 分別在2 h、4 d、7 d、10 d、14 d、15 d 6個時間點取出所有血液標本，顛倒混勻后于4 ℃ 1 600×g離心10 min，轉移最上層淡黃色血漿層至已標記的2 mL離心管中。4 ℃，1 600×g，將每個2 mL離心管再次離心10 min，用移液器小心吸取血漿層至新的1.5 mL的離心管中，以上兩步轉移操作需注意移液器槍頭不要觸碰到白膜細胞層和暗紅色沉淀。

1.3.3磁珠法抽提cfDNA 取1 mL血漿樣品按照游離DNA提取試劑盒的說明書要求進行cfDNA的提取，對制造商推薦的方案稍加修改，將蛋白酶K 60 ℃處理時間從10 min增加到1 h，使與DNA結合的蛋白質降解,DNA充分游離，以逆轉化學固定的影響。用55 μL預熱緩沖液洗脫cfDNA，并在-80 ℃條件下保存。

1.3.4血漿總cfDNA水平檢測 使用Thermo NanoDrop OneC分光光度計檢測從血漿中提取的總cfDNA水平。

1.3.5實時熒光定量PCR(q-PCR)定量檢測cfDNA水平 采用q-PCR方法，通過已知濃度Leptin基因標準品CT 值與其濃度的對數(shù)繪制標準曲線，準確定量人Leptin基因166 bp片段在不同時間點的水平變化來研究血漿中cfDNA的水平變化趨勢，上游引物和探針的序列來自參考文獻[10]，下游引物使用Primer Premier 5軟件設計的序列。Leptin上游引物：5′-CAGTCTCCTCCAAACAGAAAGTCA-3′，下游引物：5′-CGGAGGTTCTCCAGGTCGTTGGATA-3′；Taqman探針：5′-(FAM)bCGGTTTGGACTTC(MGBNFQ) -3′。

Leptin標準品、引物和探針均由上海生工生物工程股份有限公司合成，標準品倍比稀釋成2×102～2×108copy/mL，引物和探針的終濃度為500 nmol/L。體系中引入UDG酶和熱啟動DNA聚合酶，預防PCR擴增產(chǎn)物的污染，抑制在低溫條件下的非特異性擴增，兩種酶在體系總的量為0.5 U和2.0 U。PCR反應采用20 μL的反應體系，PCR熱循環(huán)條件：50 ℃ 2 min，94 ℃ 10 min，94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s共45個循環(huán)。每個標本設置3個復孔，設置3個無模板對照孔。

2 結 果

2.1血漿總cfDNA水平的檢測結果 血液采集到采血管后，室溫保存2 h、4 d、7 d、10 d、14 d、15 d，采血管中血漿總cfDNA的水平變化呈現(xiàn)出明顯差異(表1)。EDTA-K2抗凝管中總cfDNA水平在室溫存放至4 d時，與2 h總cfDNA水平相比降低，差異有統(tǒng)計學意義(t=45.727，P=0.014)。儲存7～15 d時，與2 h總cfDNA水平相比升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。兩種cfDNA專用采血管中的血漿總cfDNA水平在10 d內(nèi)保持穩(wěn)定，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 不同采血管對血漿總DNA水平保存效果的影響

2.2q-PCR檢測不同保存時間血液標本cfDNA水平 血液標本采集到3種采血管后室溫存放2 h、4 d、7 d、10 d、14 d、15 d，cfDNA水平有差異，結果如圖1。EDTA-K2抗凝管中的血漿cfDNA在4、7、10、14、15 d時，相較于2 h時的水平明顯升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，整個儲存周期cfDNA水平波動式上升。兩種專用采血管中的血漿cfDNA水平在4、7 d時，相較于2 h的水平略微降低，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；在10、14、15 d時的血漿cfDNA水平，相較于2 h 的水平明顯降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

注：E為EDTA-K2抗凝管，K為專用采血管K，A為專用采血管A。

3 討 論

cfDNA作為新的生物標志物，其水平和組分的穩(wěn)定性對后期的臨床檢測至關重要。無創(chuàng)產(chǎn)前診斷、胎兒性別的確定[9]、腫瘤學監(jiān)測及RhD陰性母親的RhD基因型檢測是cfDNA檢測的主要應用領域[10]。有效利用cfDNA靶點作為生物標志物的一個主要技術挑戰(zhàn)是對稀有靶點進行量化，由于cfDNA的水平在血漿中的比例非常低，血漿分離離心力過大，白細胞破裂釋放DNA，都會進一步減少胎兒或者腫瘤來源cfDNA的比例[11-12]，最小化白細胞的破裂和核酸酶的降解是穩(wěn)定保存血液標本中目標cfDNA比例的有效方式。cfDNA專用采血管的應用很大程度上解決了血液保存時間的限制，使得缺乏相應提取和檢測設備的地區(qū)能夠進行異地血樣檢測。

q-PCR是目前定量檢測cfDNA水平的主要方法，檢測機體中廣泛分布且穩(wěn)定出現(xiàn)的靶序列，定量分析cfDNA的水平變化。Leptin基因位于7號染色體上，且存在于所有人體細胞中，通過血漿中Leptin基因的水平變化能夠反映不同采血管對cfDNA保存效果的影響。

本研究對比了EDTA-K2抗凝管與cfDNA專用采血管對于cfDNA保存效果的影響，EDTA-K2抗凝管中cfDNA的水平在第7、10、14、15天明顯升高，表明在血液標本的長期保存過程中不斷有內(nèi)源DNA釋放造成的污染，在第4天，cfDNA水平降低，表明在EDTA-K2抗凝管血液保存前期，核酸酶對cfDNA的降解作用強于內(nèi)源DNA的污染，與之相反的兩種專用采血管中cfDNA水平保持穩(wěn)定，且有逐漸減少的趨勢，證明專用采血管對穩(wěn)定血液標本中cfDNA水平在一定時間內(nèi)有積極的作用，專用采血管能穩(wěn)定有核血細胞，減少內(nèi)源DNA的釋放，抑制核酸酶對cfDNA的降解作用，從而保持總cfDNA水平的穩(wěn)定。

通過q-PCR檢測血漿中提取的cfDNA，EDTA-K2抗凝管中的血漿cfDNA在4、7、10、14、15 d時，相較于2 h時的水平明顯升高，表明cfDNA受到基因組DNA的污染，不同長度片段的分布和比例發(fā)生變化，與已有的研究結果一致[13]。兩種專用保存管中，cfDNA在保存至4 d和7 d時，cfDNA的水平穩(wěn)定，保存至10、14、15 d時，cfDNA的水平明顯降低，表明兩種專用采血管能保持cfDNA水平穩(wěn)定至少7 d，血液有核細胞的破裂和核酸酶對DNA的降解過程被有效抑制，10、14、15 d時，cfDNA水平降低暗示核酸酶對DNA的降解起到了主導作用。

綜上所述，專用采血管能夠抑制基因組DNA釋放到血漿，同時保持最初的cfDNA水平，對血液標本保存過程中cfDNA的穩(wěn)定起到積極的作用，穩(wěn)定有核血細胞，抑制核酸酶的降解活性，對于cfDNA的后續(xù)分析和作為生物標志物準確檢測奠定了基礎。