不同種類飲料對恒牙牙釉質脫礦的體外研究

趙 偉，陳雅琪，魏 霞，駱 凱,3，羅 嵐,3

近年來，隨著物質生活水平的提高，人們對于飲料的需求量日益增多。研究顯示，市售的多種飲料均可造成牙釉質不同程度脫礦，從而導致牙酸蝕癥和齲壞[1-2]。本研究選用4種常見的市售普通飲料處理恒牙牙釉質，并測定牙釉質的鈣、磷溶出情況以及牙釉質表面顯微硬度(surface microhardness，SMH)，比較4種飲料對恒牙牙釉質的酸蝕及脫礦作用的影響。

1 材料與方法

1.1主要儀器和試劑 慢速鋸(IsoMet Low Speed Saw，美國Buehler公司)；臺式pH酸度計(pH211型，意大利HANNA公司)；iMarkTM酶標儀(680型，美國Bio-Rad公司)；紫外可見分光光度計(UV-5200，上海元析儀器有限公司)；甲基丙烯酸樹脂(II型，上海新世紀齒科材料有限公司)；數(shù)字顯微硬度計(HXD-1000TM/LCD，上海光學儀器廠)。實驗飲料(飲料A：碳酸飲料；飲料B：果醋類飲料；飲料C：茶飲料；飲料D：運動飲料)。人工唾液配方參照ISO/TR10271：1993標準，主要成分如下：0.400 g的NaCl，0.400 g的KCl，0.795 g的CaCl2·2H2O，0.780 g的NaH2PO4·2H2O，0.005 g的 Na2S·2H2O，1.000 g尿素以及1 000 mL去離子水。

1.2方法

1.2.1恒牙的收集和保存 選取筆者醫(yī)院門診收治的因正畸治療需要而拔除的恒牙25顆?；颊吣挲g18～25歲，無長期碳酸飲料暴露史、釉質發(fā)育良好、無脫鈣、無磨耗。牙齒排除標準：齲壞、根裂、牙合面有充填修復體、做過根管治療；肉眼觀牙冠顏色及形態(tài)與正常有差異，或有其他缺陷。本研究經醫(yī)院倫理委員會審批通過，患者均簽署知情同意書。

25顆恒牙拔除前均去除色素和菌斑，拔除后去凈牙髓組織，截除牙根后使用慢速鋸將牙冠縱向劈開，共計50個樣本，置于新鮮配置的人工唾液中，于4 ℃冰箱保存，拔牙后2周內用于實驗。

1.2.24種飲料的pH值及鈣、磷、糖濃度檢測 4種飲料各取1 mL，使用pH計檢測pH值；采用Bio-Rad IMARK酶標儀，應用鄰甲酚肽絡合銅法檢測飲料的鈣濃度、磷鉬酸法檢測飲料的磷濃度、葡萄糖氧化鎂法檢測飲料的糖含量，茶多酚含量見飲料成分表。

1.2.34種飲料浸泡后恒牙鈣、磷離子釋放程度檢測 將50個樣本浸泡于人工唾液中，于37 ℃恒溫水浴箱中預處理24 h，之后分5組(n=10)，分別浸泡于4種飲料及人工唾液中(對照組)。采用間斷性浸泡，每次浸泡1 min，取出30 s，再次浸泡，完成5次浸泡后取出，蒸餾水清洗5遍，放回37 ℃人工唾液水浴恒溫箱浸泡24 h，第2天重復以上操作，每天每組試件重復上述飲料浸泡5次，每天浸泡均更換新鮮的飲料，連續(xù)處理7 d。每次浸泡所用的飲料均收集于無菌試管中，混勻后用于測定飲料及人工唾液中鈣、磷含量的變化，連續(xù)測量7 d。

1.2.44種飲料浸泡后牙釉質SMH的測量 分別在實驗前及實驗的第1～7天采用數(shù)字顯微硬度計檢測5組樣本的SMH。使用500 g負荷維氏鋼錐連續(xù)打擊釉質開窗區(qū)表面20 s，使其形成壓痕，測量壓痕的兩對角線長度，輸入計算機自動計算出SMH。所有樣本均在開窗部位的不同點反復測量多次。每個樣本的開窗區(qū)均測量5個點，取測量壓痕規(guī)則的3個點的平均值作為該樣本該次的SMH值(單位為HV)。

1.3統(tǒng)計學處理 采用SPSS 25.0軟件進行統(tǒng)計分析。對不同種類飲料處理后的牙釉質SMH以及鈣、磷溶出值采用重復測量方差分析的統(tǒng)計方法，兩兩比較采用Bonferroni法校正顯著水平，檢驗水準為α=0.05，P<0.05為差別具有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.14種飲料的pH值及鈣、磷、糖濃度 4種飲料及人工唾液的pH值分別為2.93，3.75，6.48,3.79和6.73，所含的鈣、磷、糖檢測結果見表1，其中茶飲料的茶多酚含量為998 mg/L，余未測出茶多酚。

表1 4種飲料的pH值和鈣、磷、糖濃度等的檢測結果

2.24種飲料浸泡后牙釉質鈣、磷溶出量 4種飲料浸泡后，恒牙牙釉質鈣、磷的溶出量見表2和圖1。4種飲料均能導致恒牙牙釉質出現(xiàn)不同程度的脫礦，其中果醋類飲料和運動飲料對牙釉質中鈣、磷的溶出作用最明顯，而茶飲料的溶出作用最不明顯。在不同飲料中持續(xù)試驗7 d后，浸泡液中鈣、磷濃度的變化差別均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。飲料種類和作用天數(shù)兩種因素共同作用導致的鈣、磷濃度變化的差別也具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。4種飲料導致鈣、磷的溶出量與人工唾液對照組比較，變化均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，且同種飲料各時間點的鈣、磷濃度變化差別也有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表2 4種飲料導致恒牙牙釉質鈣、磷溶出量的變化

2.3不同類型飲料浸泡后牙釉質SMH變化 經碳酸飲料、果醋類飲料以及運動飲料連續(xù)浸泡7 d后，恒牙牙釉質的SMH均顯著下降，而茶飲料組的SMH值起初呈平穩(wěn)下降趨勢，之后逐步回升。不同飲料按照試驗設計浸泡7 d，各組牙釉質SMH值間的差別均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，飲料種類和實驗天數(shù)兩種因素共同作用對恒牙牙釉質SMH的降低也均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05，表3，圖1C)。4種飲料處理過的牙釉質SMH均較人工唾液對照組均有所下降，其中碳酸飲料組、果醋類飲料組、運動飲料組與對照組的差別有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，且浸泡的1～7 d與實驗前比較，差別均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表3 4種飲料導致恒牙牙釉質表面顯微硬度的變化

n=10。1組：人工唾液；2組：碳酸飲料；3組：果醋類飲料；4組：茶飲料；5組：運動飲料。A：鈣溶出量；B：磷溶出量；C：牙釉質表面顯微硬度。

3 討 論

在過去的幾十年里，軟飲料的消費量急劇增加，其中兒童和青少年對軟飲料的消費增幅最大。過量飲用含高糖和高酸的軟飲料，都會對牙齒和身體造成不利影響，包括齲齒、超重、肥胖和增加患2型糖尿病的風險[3]。目前一些市售的飲料為了加強口感，常添加一些高酸度的成分，可導致釉質的脫礦。Milosevic等[4]認為，牙齒的酸蝕與飲用飲料有關，頻繁飲用或睡前飲用果汁、碳酸飲料均會增加牙齒酸蝕的嚴重程度。為了評估不同種類飲料對恒牙牙釉質脫礦的影響，本實驗選用因正畸治療需要而拔除的新鮮恒牙，以常見的市售飲料進行浸泡，檢測浸泡前后飲料中鈣、磷含量以及牙釉質SMH的變化。當前，國內外均有學者開展飲料對牙釉質脫礦作用相關影響的研究[5-6]。然而，這些研究多將牙齒或牙片長時間浸泡于同一飲料中，與日常生活情況不符。Maupomé-Carvantes等[7]研究表明，定量研究飲料的實際作用時，實驗條件應盡量接近現(xiàn)實生活，得出的結果才真實可信。Xavier等[8]的研究發(fā)現(xiàn)，酸性碳酸飲料對牙釉質表面的酸蝕作用在接觸5 min內即可發(fā)生。故本研究采用間斷性浸泡的方式，每次浸泡均使用新鮮溶液持續(xù)1 min，間歇30 s，共進行5次。實驗間隙期各組樣本均浸泡于人工唾液中，使實驗條件盡量接近日常飲用飲料的實際狀態(tài)。

牙釉質是人體內組織中最硬且鈣化程度最高的組織。牙釉質的硬度由其所含無機物的晶體決定，釉質中不穩(wěn)定型的磷酸鈣鹽，在酸性環(huán)境下發(fā)生化學反應導致鈣、磷離子釋出[9]。Featherstone等[10]利用定量顯微放射照相技術測定牙釉質礦物質的含量，發(fā)現(xiàn)其與顯微硬度儀測得的硬度值具有顯著的相關關系。本實驗結果表明：4種不同種類的飲料均可對牙釉質造成不同程度的脫礦作用，導致釉質中鈣和磷溶出并降低SMH，且不同飲料間的作用差別具有統(tǒng)計學意義。其中果醋類飲料組的鈣、磷溶出作用最明顯，而茶飲料組的溶出作用不明顯。對4種飲料的pH值檢測結果顯示，果醋類飲料、碳酸飲料、運動飲料的pH值均較低，屬于酸性飲料，低于牙釉質脫礦的臨界值(5.0～5.5)[11]，因此上述飲料均可使恒牙牙釉質中不穩(wěn)定的磷酸鈣鹽發(fā)生化學反應而溶出。實驗結果也證實了果醋類飲料、碳酸飲料和運動飲料中的鈣、磷溶出量較高。結果也顯示碳酸飲料浸泡組牙釉質的鈣、磷溶出量并不是最多，究其原因可能是由于可樂等碳酸飲料鈣、磷含量較高，因此浸泡液中的鈣、磷較快達到飽和狀態(tài)，使其溶出量并不是最多。唾液中高濃度鈣、磷離子過飽和時容易形成結晶，結晶沉積在牙釉質脫礦面上，促進了釉質再礦化。Attin等[12]的研究發(fā)現(xiàn)，在碳酸飲料中添加鈣、磷酸鹽和氟化物可降低碳酸飲料的腐蝕潛力，鈣和磷酸鹽的添加顯示出有益的效果，但并不能完全防止釉質溶解。而向碳酸飲料中添加甘油磷酸鈣能顯著防止釉質SMH的降低和礦物質的損失[13]。

Maupomé等[14]的研究發(fā)現(xiàn)，脫礦1周后牙表面的壓痕即不容易看清，不能準確反映牙釉質礦物質的含量和脫礦程度，因此本研究選擇將恒牙牙釉質塊浸泡于飲料7 d內進行試驗分析，結果顯示，從浸泡前到實驗后第7天，碳酸飲料、果醋類飲料以及運動飲料導致的恒牙牙釉質SMH均值均明顯降低。Li等[15]通過原子力顯微鏡，在納米水平上定量評估了可口可樂等市售飲料在不同時間點所引起的人類牙釉質表面粗糙度(RQ)和彈性模量(E)的變化，結果顯示，在接觸可樂等碳酸飲料的過程中，牙齒的表面逐漸變得粗糙，而且隨著浸泡時間的延長，牙釉質的彈性模量E值下降幅度變大，本研究結果與之一致。而茶飲料浸泡組則在實驗前期呈平穩(wěn)下降趨勢，之后呈現(xiàn)回升的趨勢。究其原因可能因為本實驗測得的茶飲料的pH為6.48，Gul等[16]發(fā)現(xiàn)紅茶浸泡處理的牙菌斑酸堿度均高于牙脫礦臨界值(pH=5.5)，對牙齒的脫礦作用影響較小。茶飲料與其他飲料相比較，富含茶多酚、氟化物和鐵，茶多酚能抑制致齲菌的生長，氟離子能進入羥磷灰石晶體中，形成氟化鈣，增加釉質抵抗飲料的酸蝕，降低釉質溶解度減少脫礦。Soares等[17]發(fā)現(xiàn)，在未經氟化物保護的牙釉質中，牙釉質表面經過各種軟飲料浸泡腐蝕后可檢測到不同程度的凹陷、疏松、表面不規(guī)則和結構破壞，而經過氟處理保護的牙釉質，避免了軟飲料酸蝕后釉質表面粗糙度的增加。

綜上所述，果醋類飲料、運動飲料以及碳酸飲料均可導致牙釉質出現(xiàn)不同程度的脫礦，其中果醋類飲料的脫礦作用最強，其次是運動飲料及碳酸飲料，而茶飲料對牙釉質的脫礦作用相對較輕。建議兒童及青少年應盡量減少酸性飲料的攝入頻率。人體口腔是個復雜的環(huán)境，牙釉質的酸蝕受到多方面影響：菌斑生物膜，唾液的流動，機械沖洗速度，飲料在口腔內接觸的頻率和方式，不同溫度飲料酸蝕作用等，因此影響口腔內牙齒酸蝕化學反應的因素有許多，今后還需進一步進行相應的研究。