白藜蘆醇聯(lián)合順鉑對神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞的作用*

閆苗苗 潘效紅 范艷玲 劉文英 魏光成 耿 楓

（濱州醫(yī)學院藥學院，煙臺 264003）

神經(jīng)膠質(zhì)瘤是一種常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的惡性腫瘤，由于其異質(zhì)性和耐藥性及血腦屏障等因素，多以手術(shù)治療為主，傳統(tǒng)化療藥物的治療效果均不理想[1-4]。一些天然化合物具有抗癌活性,但對腫瘤細胞的作用效果不如化學合成藥物[5-6]。本研究應(yīng)用具有重要生物活性的天然多酚類化合物白藜蘆醇（resveratrol，Res）[7-13]與已經(jīng)在臨床應(yīng)用過的順鉑（cisplatin，DDP）聯(lián)合用藥，作用于體外培養(yǎng)的神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞，比較單獨用藥和聯(lián)合用藥的效果，為臨床用藥提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞株（C6）來源于本實驗室凍存復蘇的細胞。白藜蘆醇和順鉑購自美國Sigma公司，純度＞99%，配成100 mg/mL貯存液，-20℃?zhèn)溆?。細胞增殖檢測試劑盒（Cell Counting Kit，CCK8）、Annexin V-FITC細胞凋亡試劑盒和細胞周期試劑盒均購自南京凱基公司；Bcl-2、Bax、p-Erk1/2抗體購自博士德公司；IP細胞裂解液和預染蛋白分子量標準等其它所有試劑均購自江蘇碧云天。

1.2 細胞培養(yǎng)

大鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞株（C6）在含有10%新生牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞長滿培養(yǎng)瓶的70%～80%，進行消化、傳代、種板。

細胞增殖檢測藥物濃度，白藜蘆醇為0、10 mg/mL 和15 μg/mL；順鉑為0、3.125 μg/mL和6.25 μg/mL；聯(lián)合用藥組，白藜蘆醇+順鉑為（0+0）、（10+3.125）、（15+3.125）、（10+6.25）μg/mL 和（15+6.25）μg/mL。

其余檢測選用的藥物濃度為，對照組、白藜蘆醇為10 μg/mL；順鉑為3.125 μg/mL，白藜蘆醇+順鉑為（10+3.125）μg/mL。

1.3 細胞增殖抑制率檢測

細胞接種于96孔板，每孔2×103個細胞，培養(yǎng)24 h后加入不同濃度的藥物，培養(yǎng)24、48、72 h后，每組分別設(shè)立對照組，每個濃度設(shè)立5個復孔。每孔加入10 μL CCK8的新型細胞增殖及細胞毒性檢測溶液，37℃下繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～4 h。于450 nm 波長處測定每孔的光密度OD值，計算細胞的增殖抑制率（IR）。

IR=（1-實驗孔A／對照孔A）×100%。

1.4 細胞形態(tài)變化

細胞接種于24孔板，每孔2×104個細胞，培養(yǎng)24 h后，加藥作用24 h，棄去培養(yǎng)液，PBS洗2次，每孔加4%的多聚甲醛500 μL室溫固定20 min，吸出固定液，PBS洗1次，每孔加3 μL的吖啶橙染液[14]，搖晃2 min，熒光顯微鏡觀察細胞變化并拍照。

1.5 細胞凋亡檢測

細胞接種于6孔板，每孔2×105個細胞，培養(yǎng)24 h后加入藥物。收集細胞；PBS 洗滌2次后（2 000 r/min離心5 min）；加 入500 μL的binding buffer，5 μL Annexin V-FITC 和5 μL propidium iodide 于細胞懸液中混勻；在1 h內(nèi)，進行流式細胞儀檢測，分析細胞凋亡的百分比。

1.6 細胞周期檢測

細胞接種于6孔板，培養(yǎng)24 h后加入藥物24 h后，收集細胞，PBS 洗滌2次后（2 000 r/min離心5 min），加入75%的乙醇4℃固定過夜，后根據(jù)DNA含量檢測試劑盒（凱基生物公司）的說明書，流式細胞儀檢測細胞周期。

1.7 免疫印跡檢測

細胞刮子收集細胞，4℃，1 500 r/min，離心10 min，棄掉上清，加80 μL RIPA裂解液冰上裂解30～40 min，12 000 r/min離心5 min；取上清液，使用BCA試劑盒進行蛋白濃度的測定，之后加入20 μL 5×上樣緩沖液，95℃煮蛋白，電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，加入特異性一抗，Bcl-2、Bax、p-Erk1/2 和GAPDH，4℃過夜，漂洗孵育后，加ECL 發(fā)光液，化學發(fā)光系統(tǒng)照相分析。

1.8 統(tǒng)計學處理

本研究的實驗結(jié)果按金正均[15]提出的概率和方法計算Q值判斷兩藥的協(xié)同作用[15]。Q=E（A+B）/[EA+（1-EA）×EB]

2 結(jié)果

2.1 白藜蘆醇和順鉑對C6細胞增殖抑制率的影響

結(jié)果顯示（表1），白藜蘆醇和順鉑單獨作用時，隨著時間和濃度的增加，對神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞（C6）的增殖有明顯的抑制作用；兩者聯(lián)合用藥抑瘤作用明顯強于單獨應(yīng)用白藜蘆醇、順鉑時，按照公式推算，Q＞1.15，兩者之間呈相互協(xié)同關(guān)系。

2.2 白藜蘆醇和順鉑對C6細胞形態(tài)的影響

不同濃度的藥物作用神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞24 h后，結(jié)果顯示（圖1）, 白藜蘆醇和順鉑單獨作用時，細胞與對照組比變化不大，而兩者聯(lián)合時細胞的數(shù)量明顯減少，而且細胞核呈現(xiàn)黃綠色的數(shù)量明顯增多,細胞變小變圓，細胞膜有出芽現(xiàn)象。

表1 白藜蘆醇和順鉑對C6細胞增殖抑制率的影響（±s，%）

表1 白藜蘆醇和順鉑對C6細胞增殖抑制率的影響（±s，%）

組別 濃度（μg/mL）24 h 48 h 72 h抑制率 Q值抑制率 Q值抑制率 Q值對照組 0 0.00 ±5.38--0.00 ±4.58--0.00±5.26--白藜蘆醇組 10 23.27±2.84--23.05±5.57--31.55±4.57--15 30.51±3.99--31.81±5.72--41.85±5.37--順鉑組 3.125 13.53±3.05--13.56±2.26--16.53±3.07--6.25 29.97±10.10--26.46±6.26--34.19±10.00--白藜蘆醇和順鉑組 10+3.125 57.08±3.42 1.70 63.78±4.37 1.91 67.33±1.01 1.57 10+6.25 64.69±2.17 1.40 63.30±6.27 1.46 69.74±2.75 1.27 15+3.125 62.16±3.20 1.56 65.03±1.96 1.58 75.17±3.51 1.46 15+6.25 67.88±2.90 1.32 68.97±2.26 1.38 86.92±2.62 1.41

2.3 白藜蘆醇和順鉑對C6細胞凋亡的影響

Annexin V 熒光染色檢測，加入藥物濃度為0、白藜蘆醇10 μg/mL、順鉑3.125 μg/mL、白藜蘆醇+順鉑（10+3.125）μg/mL時，正常細胞率分別為98%、91%、81%、67%；從上述數(shù)據(jù)及圖2 中可以看出，二者聯(lián)合應(yīng)用時，細胞凋亡率高于單獨應(yīng)用，利用統(tǒng)計學分析兩藥合用效果，Q＞1.15，表明兩者之間呈相協(xié)關(guān)系，并且明顯強于單獨用藥（P＜0.05）。

2.4 白藜蘆醇和順鉑對C6細胞周期的影響

對照組、10 μg/mL 白藜蘆醇和3.125 μg/mL 順鉑時，細胞G2期的百分比為11.3%、12.8%、7.9%，S期分別為31.2%、29.3%和31.5%。從這組數(shù)據(jù)顯示白藜蘆醇和順鉑單獨作用于細胞時，對細胞的增殖周期沒有顯著影響；兩者聯(lián)合時，細胞G2期所占的比為0.3%（P＜0.05），S期所占的比為42.9%，提示細胞阻滯在S期，細胞的有絲分裂受到抑制，從而抑制細胞的增殖。

2.5 白藜蘆醇和順鉑對C6細胞Bcl-2、Bax 和p-Erk1/2表達的影響

神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞（C6）在白藜蘆醇、順鉑單獨及聯(lián)合作用24 h后，結(jié)果顯示（圖4），Bax 和Bcl-2的比值在白藜蘆醇和順鉑兩者聯(lián)合應(yīng)用時明顯變大，而且兩者聯(lián)合應(yīng)用與單獨用藥相比差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。p-Erk1/2 光密度比值逐漸下降，蛋白的表達量降低。其中，藥物濃度為白藜蘆醇+順鉑（10+3.125）μg/mL時差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（圖4）。

圖1 神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞（C6）形態(tài)的變化，標尺=200 μm。A：對照組；B：白藜蘆醇10 μg/mL；C：順鉑3.125 μg/mL；D：白藜蘆醇+順鉑（10+3.125）μg/mL.

圖2 白藜蘆醇和順鉑對C6細胞凋亡的影響。A：對照組；B：白藜蘆醇10 μg/mL C：順鉑3.125 μg/mL；D：白藜蘆醇+ 順鉑（10+3.125）μg/mL.

圖3 白藜蘆醇和順鉑對C6細胞周期的影響。A：對照組；B：白藜蘆醇10 μg/mL；C：順鉑3.125 μg/mL；D：白藜蘆醇+順鉑（10+3.125）μg/mL.

圖4 白藜蘆醇和順鉑對C6細胞Bcl-2、Bax 和p-Erk1/2表達的影響

3 討論

白藜蘆醇為天然植物補體，在多種腫瘤中可通過多種途徑在腫瘤各階段抑制腫瘤發(fā)展[16-21]。但有關(guān)白藜蘆醇在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的研究報道甚少，本研究將白藜蘆醇作用于神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞C6后，顯示其在體外可抑制膠質(zhì)瘤細胞的生長。順鉑是臨床常用于治療腫瘤的化療藥物，但其副作用很大。本研究將白藜蘆醇與順鉑聯(lián)合作用于神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞，希望白藜蘆醇協(xié)同順鉑使其在低劑量時能夠增強對癌細胞的作用，由于順鉑劑量的減少，從而減輕其副作用。

本研究主要探討白藜蘆醇能否增強順鉑對神經(jīng)膠質(zhì)瘤C6細胞的增殖抑制作用。CCK8 檢測的細胞增殖抑制率結(jié)果表明白藜蘆醇和順鉑單用藥組可以抑制細胞增殖,并且具有時間和濃度依賴性；聯(lián)合用藥兩者存在協(xié)同作用（Q ≥1.15）。流式細胞儀檢測進一步證實聯(lián)合用藥兩者存在協(xié)同作用。

吖啶橙染色，熒光顯微鏡觀察結(jié)果顯示細胞在聯(lián)合用藥時,細胞的數(shù)量明顯減少，細胞核呈現(xiàn)黃綠色的數(shù)量明顯增多，細胞的體積變小變圓，細胞膜有出芽現(xiàn)象。

細胞周期檢測結(jié)果顯示，當2 者聯(lián)合應(yīng)用時，細胞G2期的比例明顯減少，S期的比例明顯增多。分析細胞可能阻滯在S期，從而抑制細胞的增殖。

經(jīng)白藜蘆醇和順鉑單獨用藥和聯(lián)合用藥處理的C6細胞，與對照組比較，Bax 和Bcl-2的比值在白藜蘆醇和順鉑兩者聯(lián)合應(yīng)用時，可以看出Bax蛋白或蛋白同源二聚體占優(yōu)勢，細胞凋亡被誘導。表明白藜蘆醇和順鉑誘導C6細胞凋亡是通過調(diào)控Bcl-2和Bax 基因表達實現(xiàn)。經(jīng)白藜蘆醇和順鉑聯(lián)合處理的C6細胞，與對照組比較,其p-Erk1/2 基因表達水平降低，差異有統(tǒng)計學意義。因為當Erk1/2 被激活后，表現(xiàn)為磷酸化的活性形式p-Erk1/2，可能是抑制了Ras-Raf-MEK-Erk 信號通路途徑，細胞質(zhì)中的信號不能正常傳遞到細胞核，或是傳遞到細胞核中的信號是錯誤的，結(jié)果影響了正常的核轉(zhuǎn)錄因子與DNA之間的相互作用，抑制細胞增殖。

總之，白藜蘆醇和順鉑能協(xié)同抑制膠質(zhì)瘤細胞株C6的增殖，在分子水平上即通過調(diào)控Bcl-2和Bax 基因表達實現(xiàn)細胞凋亡，又通過Ras-Raf-MEK-Erk 信號通路途徑，抑制細胞的增殖。