腎癌免疫細(xì)胞浸潤(rùn)模式與生存預(yù)后分析*

華金駿，李 興，王 杰△

上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院：1.泌尿外科；2.麻醉科，上海 201210

腎癌是泌尿系統(tǒng)常見的腫瘤，在我國(guó)發(fā)病率呈逐年升高趨勢(shì)，約25%的患者就診時(shí)已經(jīng)出現(xiàn)了轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移后的患者5年生存率不足10%[1]。雖然手術(shù)治療是腎癌的主要治療手段，但約有1/2的患者術(shù)后出現(xiàn)復(fù)發(fā)和預(yù)后不良，療效欠佳，占比最高的腎細(xì)胞癌對(duì)傳統(tǒng)放化療敏感程度也較低，總體而言，目前對(duì)于腎癌仍缺乏有效的針對(duì)性治療方法[2]。腎癌組織周圍存在大量T細(xì)胞、NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等，免疫治療可能成為腎癌治療的有效手段[3]。腫瘤微環(huán)境免疫模式已經(jīng)被列入腫瘤十大特征之一，既能夠預(yù)測(cè)患者生存預(yù)后，還能預(yù)測(cè)患者放化療療效[4]。腫瘤微環(huán)境中免疫細(xì)胞分布模式與患者生存預(yù)后密切相關(guān)，免疫細(xì)胞浸潤(rùn)模式可以作為治療依據(jù)來(lái)提高患者生存率與改善遠(yuǎn)期預(yù)后[5]。目前對(duì)腎癌免疫細(xì)胞浸潤(rùn)及免疫標(biāo)志物的研究較少，尚缺乏精準(zhǔn)篩選腎癌免疫治療標(biāo)志物的方法。常規(guī)免疫組化和流式細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)在評(píng)估免疫細(xì)胞模式上存在一定的局限，單次評(píng)估免疫細(xì)胞效率較低。CIBERSORT是目前生物信息學(xué)研究中新的基于基因表達(dá)大數(shù)據(jù)去卷積的復(fù)雜算法，可以根據(jù)患者的基因表達(dá)數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為免疫細(xì)胞浸潤(rùn)比例[6]。本研究采用生物信息學(xué)的方法，挖掘腫瘤癌癥基因圖譜(TCGA)數(shù)據(jù)庫(kù)，基于CIBERSORT復(fù)雜算法和TCGA腎癌患者樣本數(shù)據(jù)，系統(tǒng)性探討腎癌患者免疫細(xì)胞浸潤(rùn)模式及其與免疫細(xì)胞的相關(guān)性，深入分析腎癌免疫細(xì)胞浸潤(rùn)模式與患者生存預(yù)后、臨床分期的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1獲取數(shù)據(jù) 進(jìn)入在線TCGA網(wǎng)站(https://portal.gdc.cancer.gov/)選擇疾病腎癌，數(shù)據(jù)來(lái)源方式選擇TCGA，然后選擇轉(zhuǎn)錄本數(shù)據(jù)，工作流數(shù)據(jù)選擇矯正過(guò)的FPKM數(shù)據(jù)，下載組織樣本基因表達(dá)數(shù)據(jù)[7]，共1 023例，包含正常組織128例，腎癌組織895例。在TCGA網(wǎng)站腎癌中選擇臨床樣本數(shù)據(jù)，選擇TCGA數(shù)據(jù)來(lái)源，選擇數(shù)據(jù)格式bcr xml，方便后期程序化處理，下載關(guān)于腎癌的臨床數(shù)據(jù)，包括年齡、性別、生存時(shí)間、生存狀態(tài)、腫瘤分期信息，共943例，運(yùn)用Excel對(duì)臨床信息進(jìn)行篩選，剔除數(shù)據(jù)缺失、分期狀態(tài)未知、生存狀態(tài)未知的患者，保留完整數(shù)據(jù)的臨床信息患者，最終獲得526例有效腎癌患者臨床特征信息。

1.2評(píng)估腎癌免疫細(xì)胞浸潤(rùn) 運(yùn)用Excel對(duì)526例腎癌患者臨床信息中的年齡、性別、臨床分期繪制直觀三線表。利用Perl軟件(5.26.1)提取腎癌相關(guān)轉(zhuǎn)錄本中mRNA表達(dá)譜數(shù)據(jù)，生成轉(zhuǎn)錄本mRNA的矩陣文件，并進(jìn)行基因名稱轉(zhuǎn)換標(biāo)準(zhǔn)化注釋[8]。運(yùn)用R軟件調(diào)用CIBERSORT數(shù)據(jù)包(https://cibersort.stanford.edu/)檢查標(biāo)準(zhǔn)化后的矩陣文件中22種腫瘤免疫細(xì)胞浸潤(rùn)情況[9]。這22種免疫細(xì)胞包括M0巨噬細(xì)胞、M1巨噬細(xì)胞、M2巨噬細(xì)胞、濾泡輔助T細(xì)胞等，其中幼稚CD4+T細(xì)胞在全部樣本中水平為0，故針對(duì)性分析其余21種免疫細(xì)胞。運(yùn)用Perl數(shù)據(jù)包，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，最終篩選得到10例正常組織和558例腎癌組織免疫細(xì)胞浸潤(rùn)信息。運(yùn)用Excel分別繪制正常和腎癌組織免疫細(xì)胞占比餅圖。運(yùn)用R軟件包中vioplot 包繪制可視化腎癌組織與正常組織免疫細(xì)胞構(gòu)成比小提琴圖，利用R軟件包中的corroplot包分析免疫細(xì)胞間的相關(guān)性。將免疫細(xì)胞水平矩陣與其對(duì)應(yīng)的TCGA臨床數(shù)據(jù)合并，生成包含臨床數(shù)據(jù)和免疫細(xì)胞浸潤(rùn)信息的TXT文本，運(yùn)用R軟件包中的survival包完成生存分析，以及免疫細(xì)胞浸潤(rùn)與腎癌臨床分期相關(guān)性評(píng)價(jià)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 總生存期定義為從診斷日期開始到死亡日期之間的間隔，應(yīng)用R軟件包批量繪制K-M生存分析曲線，并進(jìn)行假設(shè)檢驗(yàn)(Log-Rank test)分析差異。腎癌分期中兩組樣本的比較采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)，兩組以上樣本的比較則采用Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[10]。

2 結(jié) 果

2.1腎癌患者臨床特征 從TCGA下載腎癌臨床相關(guān)數(shù)據(jù)，剔除不完整的數(shù)據(jù)，得到526例腎癌患者臨床信息，包含年齡、性別、臨床分期信息，見表1。

表1 腎癌患者臨床病理特征

2.2腎癌免疫細(xì)胞浸潤(rùn)分布 從TCGA下載到1 023例免疫細(xì)胞浸潤(rùn)信息，經(jīng)過(guò)篩選后獲得10例正常組織，558例腎癌組織免疫細(xì)胞浸潤(rùn)信息，繪制正常組織和腎癌組織免疫細(xì)胞構(gòu)成比圖及腎癌免疫細(xì)胞相關(guān)性熱圖。結(jié)果顯示，腎癌組織與正常組織相比，M2巨噬細(xì)胞水平較高(P<0.05)；幼稚B細(xì)胞、漿細(xì)胞、未活化的CD4+記憶T細(xì)胞、靜息態(tài)樹突狀細(xì)胞水平較低(P<0.05)。同時(shí)，在腎癌組織中，CD8+T細(xì)胞與濾泡輔助性T細(xì)胞(r=0.59)、γδT細(xì)胞水平呈正相關(guān)(r=0.60)；CD8+T細(xì)胞與M2巨噬細(xì)胞水平(r=-0.55)、未活化的CD4+記憶T細(xì)胞水平(r=-0.62)呈負(fù)相關(guān)。

2.3腎癌浸潤(rùn)性免疫細(xì)胞水平與臨床相關(guān)性評(píng)價(jià)

2.3.1與臨床分期的相關(guān)性 將獲得的臨床分期信息與其對(duì)應(yīng)的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)信息進(jìn)行合并，繪制腎癌浸潤(rùn)性免疫細(xì)胞與臨床分期箱式圖，見圖1。隨著臨床分期的進(jìn)展，未活化的NK細(xì)胞、單核細(xì)胞、未活化的肥大細(xì)胞、未活化的CD4+記憶T細(xì)胞水平逐漸降低，提示這些細(xì)胞抑制腎癌進(jìn)展；M0巨噬細(xì)胞、濾泡輔助性T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、活化的CD4+記憶T細(xì)胞、漿細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞水平隨著腎癌進(jìn)展逐漸遞增，提示這些細(xì)胞促進(jìn)腎癌進(jìn)展。

圖1 腎癌浸潤(rùn)性免疫細(xì)胞水平與臨床分期箱式圖

2.3.2與生存預(yù)后的相關(guān)性 根據(jù)腎癌免疫細(xì)胞構(gòu)成比高和低，結(jié)合假設(shè)檢驗(yàn)(Log-Rank test)計(jì)算其與生存的相關(guān)性，批量繪制腎癌組織免疫細(xì)胞K-M生存曲線，見圖2?？梢园l(fā)現(xiàn)，低水平調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、濾泡輔助性T細(xì)胞的患者5年生存率更高；高水平單核細(xì)胞、靜息態(tài)樹突狀細(xì)胞、未活化的肥大細(xì)胞的患者5年生存率更高。

注：A、B、C、D、E分別代表低水平和高水平調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、濾泡輔助性T細(xì)胞、單核細(xì)胞、靜息態(tài)樹突狀細(xì)胞、未活化的肥大細(xì)胞患者生存率的比較。

3 討 論

目前，相關(guān)學(xué)者對(duì)腫瘤免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的研究和認(rèn)識(shí)逐步提升，發(fā)現(xiàn)某些特定的免疫細(xì)胞亞群在預(yù)測(cè)個(gè)體化特異性治療效果上起著主要作用[11]。通常實(shí)驗(yàn)室采用流式細(xì)胞術(shù)和免疫組化技術(shù)分析腫瘤免疫細(xì)胞，但流程相對(duì)較復(fù)雜，周期較長(zhǎng)。CIBERSORT是斯坦福大學(xué)研究人員寫出的分析包，創(chuàng)新性采用反卷積算法，可以準(zhǔn)確、快速地分析基因表達(dá)數(shù)據(jù)，目前得到廣泛應(yīng)用[12]。本研究基于TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)分析腎癌患者免疫細(xì)胞浸潤(rùn)和臨床相關(guān)信息，對(duì)腎癌免疫細(xì)胞浸潤(rùn)模式進(jìn)行了分析評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)對(duì)比正常組織，腎癌組織M2巨噬細(xì)胞水平較高；幼稚B細(xì)胞、漿細(xì)胞、未活化的CD4+記憶T細(xì)胞、靜息態(tài)樹突狀細(xì)胞水平較低。已有研究表明，M2巨噬細(xì)胞與腫瘤增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[13]，高水平的M2巨噬細(xì)胞是腎乳頭狀癌的核心特征之一，高水平的靜息態(tài)樹突狀細(xì)胞與透明腎細(xì)胞癌的預(yù)后呈正相關(guān)[14]。在腎癌組織中，CD8+T細(xì)胞與濾泡輔助性T細(xì)胞、γδT細(xì)胞水平呈正相關(guān)(P<0.05)；CD8+T細(xì)胞與M2巨噬細(xì)胞、未活化的CD4+記憶T細(xì)胞水平呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，說(shuō)明CD8+T細(xì)胞改變與腎癌免疫微環(huán)境的變化密切相關(guān)，針對(duì)243例腎透明細(xì)胞癌患者的隊(duì)列研究也證實(shí)CD8+T細(xì)胞對(duì)誘導(dǎo)腫瘤免疫和細(xì)胞分布具有重要意義[15]，這提示CD8+T細(xì)胞可能在免疫微環(huán)境平衡調(diào)控中發(fā)揮重要作用。

通過(guò)將腎癌免疫細(xì)胞浸潤(rùn)模式與臨床分期特征結(jié)合分析，發(fā)現(xiàn)隨著腎癌進(jìn)展，未活化的NK細(xì)胞、單核細(xì)胞、未活化的肥大細(xì)胞、未活化的CD4+記憶T細(xì)胞水平逐漸降低；M0巨噬細(xì)胞、濾泡輔助性T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、活化的CD4+記憶T細(xì)胞、漿細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞水平逐漸增加，提示免疫細(xì)胞浸潤(rùn)模式的改變與腎癌的進(jìn)展密切相關(guān)。有研究表明，相對(duì)于腎透明細(xì)胞癌低?；颊撸呶；颊叩臑V泡輔助性T細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、M0巨噬細(xì)胞水平明顯升高[16]。M0巨噬細(xì)胞主要作用是吞噬清除凋亡細(xì)胞及致病物質(zhì)，能夠調(diào)控免疫應(yīng)答，促進(jìn)組織重構(gòu)、纖維化等[17-18]。單核細(xì)胞可以通過(guò)吞噬和產(chǎn)生抗體消滅外來(lái)入侵病原體，隨著腫瘤進(jìn)展，機(jī)體防御系統(tǒng)功能下降，失去對(duì)腫瘤的控制。當(dāng)效應(yīng)T細(xì)胞初次與腫瘤作用后，腫瘤抗原得到清除，T細(xì)胞逐步凋亡，但其中有少量的效應(yīng)T細(xì)胞轉(zhuǎn)為記憶T細(xì)胞，長(zhǎng)期存活發(fā)揮效應(yīng)，在遭遇同種抗原攻擊時(shí)，快速介導(dǎo)發(fā)生效應(yīng)。伴隨腫瘤的進(jìn)展，T細(xì)胞逐步變?yōu)樾?yīng)T細(xì)胞，發(fā)揮腫瘤抗原清除作用，活化的CD4+記憶T細(xì)胞增多。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞、外周淋巴細(xì)胞和局部淋巴結(jié)中占比較高，與包括腎癌在內(nèi)的多種腫瘤進(jìn)展密切相關(guān)，可以增強(qiáng)腫瘤抗原識(shí)別，加速抗原清除[19]。這些免疫細(xì)胞可能參與了腎癌的發(fā)生和進(jìn)展，為腎癌的診斷和轉(zhuǎn)歸提供了參考。

通過(guò)結(jié)合腎癌患者生存狀態(tài)進(jìn)一步分析，發(fā)現(xiàn)低水平調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、濾泡輔助性T細(xì)胞的腎癌患者5年生存率更高，高水平單核細(xì)胞、靜息態(tài)樹突狀細(xì)胞、未活化的肥大細(xì)胞的腎癌患者5年生存率更高。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在維持免疫穩(wěn)態(tài)，介導(dǎo)外周信號(hào)上發(fā)揮重要作用，臨床研究表明，外周血調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的高水平與腎細(xì)胞癌患者的不良生存預(yù)后密切相關(guān)[20]。濾泡輔助性T細(xì)胞是近些年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一群獨(dú)立的CD4+T細(xì)胞亞群，但目前有關(guān)腎癌中濾泡輔助性T細(xì)胞的研究較少，仍有待進(jìn)一步探索[19,21-22]。樹突狀細(xì)胞是最強(qiáng)的專職抗原提呈細(xì)胞，是CD4+和CD8+T初始細(xì)胞的主要激活細(xì)胞，然而腫瘤微環(huán)境中的因素會(huì)減弱樹突狀細(xì)胞的抗原提呈功能，從而限制T細(xì)胞活性，促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)[23]。靜息態(tài)樹突狀細(xì)胞水平與腎癌5年生存率相關(guān)，對(duì)比發(fā)現(xiàn)，其在正常組織中水平較高，在腎癌組織中水平較低，但是正常組織和腫瘤組織中活化的樹突狀細(xì)胞水平均不高，可能是腎癌腫瘤微環(huán)境抑制了樹突狀細(xì)胞的功能，減少抗原提呈，發(fā)生了免疫逃逸。已有學(xué)者研究表明，肥大細(xì)胞能夠加速腎癌細(xì)胞侵襲和遷徙，促進(jìn)腎癌惡化[24]。

目前有關(guān)腎癌組織免疫細(xì)胞浸潤(rùn)模式的研究較少，本文通過(guò)CIBERSORT算法結(jié)合生物信息學(xué)對(duì)腎癌免疫細(xì)胞浸潤(rùn)模式進(jìn)行了系統(tǒng)性分析，腎癌患者發(fā)病年齡整體較高，發(fā)病相對(duì)隱匿，如何早期鑒別腎癌、及時(shí)預(yù)測(cè)腎癌轉(zhuǎn)歸是今后重要的研究方向。相對(duì)正常組織，腎癌組織免疫細(xì)胞構(gòu)成明顯不同，M2巨噬細(xì)胞明顯增多，同時(shí)伴隨腫瘤的惡化，腎癌免疫細(xì)胞浸潤(rùn)模式逐步改變，單核細(xì)胞、NK細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等免疫細(xì)胞的抗原清除能力逐步降低，腫瘤微環(huán)境的免疫抑制逐步提升。臨床上可以將腎癌免疫細(xì)胞浸潤(rùn)模式作為參照，預(yù)測(cè)腎癌患者的生存期及腫瘤進(jìn)展情況，開展腎癌的個(gè)體化免疫治療，改善患者預(yù)后，提高患者生存率，使更多患者獲益。