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    成熟過程對紅曲霉干酪中生物胺的影響及其安全性評估

    2021-04-28 08:52:38劉振民
    關(guān)鍵詞:苯乙胺酪胺發(fā)酵劑

    劉 景,劉振民*

    (乳業(yè)生物技術(shù)國家重點實驗室,上海乳業(yè)生物工程技術(shù)研究中心,光明乳業(yè)股份有限公司乳業(yè)研究院,上海 200436)

    生物胺是一類具有一定生物活性的低分子質(zhì)量含氮化合物的總稱,但人體攝入過量時則會產(chǎn)生頭痛、惡心、血壓波動、呼吸困難等多種過敏性反應(yīng)。天然干酪中的生物胺主要由蛋白質(zhì)水解生成的游離氨基酸為底物、經(jīng)特定的酶脫羧產(chǎn)生[1]。生物胺普遍存在于多種食品中,如水產(chǎn)品、發(fā)酵酒、乳制品、肉類、蔬果等。乳制品中以干酪中生物胺最為典型。干酪中常見生物胺有組胺、酪胺、腐胺、尸胺、色胺、β-苯乙胺、精胺、亞精胺8 種[2]。就組胺來說,干酪中的含量僅次于以魚類為代表的水產(chǎn)品[3]。因此,食品中天然產(chǎn)生的生物胺是食品安全關(guān)注重點之一。

    目前,國際上對食品中的生物胺尚無統(tǒng)一限量標準,各國分別依據(jù)本國的法律法規(guī)制定標準。例如,美國食品藥品監(jiān)督管理局將金槍魚等魚類中組胺的安全閾值設(shè)定為50 mg/kg,而酪胺和苯乙胺的安全閾值則分別為100~800 mg/kg和30 mg/kg[4]。印度規(guī)定生鮮和即食魚產(chǎn)品中組胺可接受限量為100 mg/kg,最大殘留量為200 mg/kg;而干制和發(fā)酵魚制品中上述限量值分別為200 mg/kg和400 mg/kg[5]。我國則在地方標準中規(guī)定發(fā)酵肉制品中組胺含量不高于100 mg/kg[6]。

    霉菌成熟干酪是一類以霉菌作為發(fā)酵劑生產(chǎn)的干酪,目前使用較多的霉菌發(fā)酵劑主要為卡地干酪青霉(Penicillium camemberti)、婁地青霉(Penicillium roqueforti)和白地霉(Geotrichum candidum),常見的霉菌干酪主要有藍紋干酪、卡門貝爾干酪和布里干酪等[7]。紅曲霉是中國傳統(tǒng)食物紅腐乳、紅曲米、紅曲酒等的主要霉菌發(fā)酵原料。紅曲霉作為干酪霉菌發(fā)酵劑不僅風(fēng)味、色澤易于被大多數(shù)國人接受,是霉菌干酪進入大眾消費領(lǐng)域的良好媒介,而且紅曲霉發(fā)酵產(chǎn)物被證實含有多種有益人體的活性物質(zhì),如洛伐他汀、γ-氨基丁酸、麥角固醇等,具有良好的營養(yǎng)附加值。因此,近年來許多研究嘗試使用紅曲霉制作霉菌干酪[8-9]。但這些研究集中于將紅曲霉應(yīng)用于干酪的工藝和制作方法以及紅曲霉對干酪質(zhì)構(gòu)和風(fēng)味產(chǎn)生的影響,對食品安全,尤其是紅曲霉干酪中生物胺的影響研究還很少。

    本研究以生乳為主要原料,在霉菌干酪加工工藝的基礎(chǔ)上,使用紅曲霉作為霉菌發(fā)酵劑,制作紅曲霉干酪,研究紅曲霉干酪成熟過程中,不同的成熟條件對產(chǎn)生的生物胺種類及含量的影響,并在此基礎(chǔ)上開展對紅曲霉干酪中生物胺攝入的初步安全評估。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    生乳取自光明金山牧場。

    乳酸菌發(fā)酵劑YO-MIX 900 科漢森(中國)有限公司;凝乳酶Marzyme 150MG 丹尼斯克(中國)有限公司;紅曲霉菌種(編號GM1809,來源于腐乳)為自行保藏菌株;組胺、色胺、β-苯乙胺、酪胺、尸胺、腐胺、亞精胺、精胺標準品(均為色譜純) 美國Sigma公司;丹磺酰氯、碳酸鈉、碳酸氫鈉、甲醇、丙酮、正庚烷(均為分析純) 國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

    1.2 儀器與設(shè)備

    精密天平 德國Santorius公司;1260高效液相色譜儀、Zorbax Eclipse XDB-C18高效液相色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm) 美國Agilent公司;干酪槽、模具等為自制。

    1.3 方法

    1.3.1 紅曲霉干酪加工工藝

    生牛乳→標準化(蛋白質(zhì)含量3.1 g/100 mL)→巴氏殺菌(72 ℃、20 s)→冷卻(37 ℃)→接種乳酸菌發(fā)酵劑(1 g/100 L)→添加霉菌發(fā)酵液(體積比3%)→發(fā)酵(34 ℃、1.5 h)→加凝乳酶(40 IMCU/L)→切割→攪拌→入模排乳清→18 h后脫模→鹽浸(17 g/100 mL NaCl溶液,2 h)→成熟(10~20 ℃、25 d,相對濕度95%)→包裝→4 ℃存放

    其中,成熟過程需要注意環(huán)境清潔,前72 h內(nèi)每隔24 h翻轉(zhuǎn)通風(fēng),后期2~3 d翻轉(zhuǎn)1 次。在10、14、20 ℃ 3 個不同溫度成熟條件下分別檢測紅曲霉干酪中的生物胺含量,測定時間節(jié)點為0、3、7、14、21、25 d。

    1.3.2 紅曲霉干酪中生物胺的測定

    預(yù)處理及衍生化:取5 g紅曲霉干酪樣品(稱質(zhì)量前整塊攪碎并混合均勻),加入15 mL 0.6 mol/L高氯酸溶液混勻,振蕩30 min后2 000×g離心10min,取上清液;按以上步驟使用高氯酸提取樣品3 次,合并上清液并過濾至容量瓶;用0.6 mol/L高氯酸溶液將濾液定容至50 mL,搖勻取0.5 mL樣液,加入1.5 mL碳酸鹽緩沖液(NaH2PO4·2H2O-Na2HPO4·2H2O,pH 10.0)和2 mL 7.5 g/L丹磺酰氯溶液(溶劑為丙酮),60 ℃反應(yīng)45 min后,40 ℃氮吹除去丙酮溶劑,加入3 mL正庚烷萃取,吸取上清液,氮氣吹干后加入1 mL甲醇完全溶解,經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后待測。

    高效液相色譜測定:參照劉景等[10]的方法,使用高效液相C18反相色譜分離衍生化樣品,衍生化試劑為丹磺酰氯,計算生物胺含量。

    1.3.3 紅曲霉干酪中生物胺的安全評估

    本研究采用非參數(shù)概率評估模型(式(1))評估紅曲霉干酪中生物胺的風(fēng)險[11]。

    式中:y為紅曲霉干酪中生物胺暴露量/(μg/(kg·d));p為生物胺的種類數(shù);x為膳食調(diào)查中干酪的消費量/(g/d);c為紅曲霉干酪中生物胺的檢測值/(mg/kg);m為人群體質(zhì)量/kg。其中,膳食調(diào)查干酪消費量數(shù)據(jù)來自乳制品消費調(diào)查資料[12-14],人群體質(zhì)量數(shù)據(jù)來自中國居民營養(yǎng)與健康調(diào)查系列報告[15-16]。

    分別將x和c作為2 個獨立分布的總體,獲得特定的分布特征和參數(shù),在這2 個總體中進行隨機抽樣并配對相乘,并使用m進行校正,從而獲得y的概率分布。該模型的變異程度使用暴露量分布的特征統(tǒng)計量(如平均值等)和百分位點值表示。

    健康指導(dǎo)值的設(shè)定能為風(fēng)險管理者提供風(fēng)險評估的定量信息,從而做出保護人類健康的決策。根據(jù)健康的劑量-反應(yīng)關(guān)系,攝入50 mg生物胺并不會引起毒性反應(yīng)。當(dāng)攝入75 mg及以上生物胺時,可能導(dǎo)致充血、腹瀉、頭痛等癥狀[17-19]。因此,本研究以安全閾值較低的50 mg作為無毒性參考劑量(reference no toxicological dose,RFNTD)。使用健康指導(dǎo)值安全日攝入量(safe daily intake,SDI),根據(jù)定量風(fēng)險評估結(jié)果給出建議攝入范圍。

    中國人群建議的紅曲霉干酪SDI按式(2)計算。

    式中:c為紅曲霉干酪中生物胺含量/(mg/kg)。

    1.4 數(shù)據(jù)處理

    使用@Risk 7.0軟件(Palisade公司)的Monte-Carlo模擬,在式(1)中2 個獨立分布總體中進行隨機抽樣,并配對運算,得到概率分布。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 成熟時間對紅曲霉干酪中生物胺含量的影響

    圖 1 成熟時間對紅曲霉干酪生物胺含量的影響Fig. 1 Influence of ripening time on biogenic amines contents in Monascus-fermented cheese

    由圖1可知,隨著成熟時間的延長,紅曲霉干酪中生物胺含量的變化存在以下特點:紅曲霉干酪中的生物胺為β-苯乙胺和酪胺,其他生物胺均未檢出,其中酪胺在成熟前期(>3 d)出現(xiàn),β-苯乙胺在成熟后期(>14 d)出現(xiàn),酪胺和β-苯乙胺可能是紅曲霉干酪中的典型生物胺;總生物胺含量隨著成熟時間延長而不斷增加,成熟14 d后,由于β-苯乙胺的出現(xiàn)增加更為快速,14 d的成熟時間可能是紅曲霉干酪生物胺控制的關(guān)鍵節(jié)點。由于苯乙胺的毒性閾值較酪胺更低[17],因此,生產(chǎn)中應(yīng)盡量避免β-苯乙胺的生成,在風(fēng)味、質(zhì)地等滿足質(zhì)量要求的前提下,紅曲霉干酪成熟時間應(yīng)盡量縮短。

    2.2 成熟溫度對紅曲霉干酪中生物胺含量的影響

    表 1 不同成熟條件下紅曲霉干酪中生物胺含量Table 1 Concentrations of biogenic amines in Monascus-fermented cheese under different ripening conditions

    由表1可知:成熟溫度較低(10~14 ℃)時,紅曲霉干酪中的生物胺為β-苯乙胺和酪胺,且這2 種生物胺含量均隨成熟時間的延長而增加,其中酪胺含量高于β-苯乙胺;成熟溫度較高(20 ℃)時,除了β-苯乙胺和酪胺之外,組胺也開始生成,但含量低于前兩者。值得注意的是,當(dāng)成熟溫度上升時,3 種生物胺的增長均較為快速,出現(xiàn)的時間點也提前。其中,酪胺生成較β-苯乙胺和組胺更多、含量增加更為迅速,出現(xiàn)也相對最早(成熟溫度10 ℃,成熟時間>7 d)。

    由于成熟時間會影響干酪風(fēng)味物質(zhì)的形成[18,20],因此在風(fēng)味、質(zhì)地區(qū)別不大的前提下,紅曲霉干酪的成熟時間為14~21 d,有利于避免產(chǎn)生較高含量的生物胺。本研究在全面考察風(fēng)味、質(zhì)地、生物胺等因素后,將紅曲霉干酪的成熟條件定為14 ℃、12~14 d。

    2.3 紅曲霉干酪中生物胺的安全攝入評估

    按以上成熟條件制作9 批紅曲霉干酪,并檢測其中的生物胺含量。使用1.3.3節(jié)方法評估紅曲霉干酪中生物胺在中國人群中的安全性。

    由表2可知,當(dāng)紅曲霉干酪中生物胺的暴露量為49.42 μg/(kg·d)時,97.5%人群具有暴露風(fēng)險;而暴露量升高到94.72μg/(kg·d)時,則99%的人群處于暴露風(fēng)險中。

    表 2 中國人群對紅曲霉干酪中生物胺的暴露評估結(jié)果Table 2 Exposure assessment to biogenic amines in Monascusfermented cheese in Chinese population

    表 3 中國人群對紅曲霉干酪的SDITable 3 SDI of Monascus-fermented cheese in Chinese population

    對中國地區(qū)人群來說,針對經(jīng)由膳食暴露的紅曲霉干酪中生物胺而引發(fā)的食品安全風(fēng)險。由表3可知,為保證99.9%人群的紅曲霉干酪生物胺暴露安全,建議人均紅曲霉干酪攝入量不超過58 g/d。

    3 結(jié) 論

    紅曲霉干酪是一種以中國傳統(tǒng)食品原料紅曲作為霉菌發(fā)酵劑制成的新型干酪。本研究對紅曲霉干酪中生物胺的種類、數(shù)量、在成熟過程中的變化及其安全性評估作了較為系統(tǒng)的研究。

    紅曲霉干酪中生物胺含量隨成熟時間的延長、溫度的增加呈增加趨勢,酪胺、β-苯乙胺和組胺是其中檢出的3 種典型生物胺。β-苯乙胺多出現(xiàn)在成熟后期(>7 d),組胺出現(xiàn)在成熟溫度較高(>14 ℃)的條件下,相比之下,酪胺的含量和增長速率均高于其他2 種生物胺,出現(xiàn)時間也最早。在紅曲霉干酪實際生產(chǎn)中,為減少生物胺的生成同時保證良好風(fēng)味和質(zhì)構(gòu)特性,成熟條件應(yīng)在溫度和時間2 個重要影響因素中選擇適當(dāng)?shù)钠胶恻c。本研究表明,成熟溫度14 ℃、成熟時間12~14 d是紅曲霉干酪較為適宜的成熟條件。

    以紅曲霉干酪生物胺含量檢測數(shù)據(jù)、膳食調(diào)查和人群體質(zhì)量為基礎(chǔ)的紅曲霉干酪生物胺暴露評估結(jié)果表明,中國人群紅曲霉干酪生物胺暴露平均值為8.55 μg/(kg·d),P99百分位值為94.72 μg/(kg·d),以該暴露評估結(jié)果為基礎(chǔ)得到中國人群紅曲霉干酪的健康指導(dǎo)值。為保證99.9%人群的紅曲霉干酪生物胺暴露安全,建議人均紅曲霉干酪攝入量不超過58 g/d。

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