嬰幼兒配方乳粉中甲醛含量測(cè)定及暴露污染評(píng)估

陳同強(qiáng)，荊輝華，彭國(guó)泰，易守福，徐文泱，王亮亮，李凱龍，李 燦，向 禮,*

（1.食品安全監(jiān)測(cè)與預(yù)警湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410111；2.湖南省食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，湖南 長(zhǎng)沙 410000；3.湖南省植物保護(hù)研究所，湖南 長(zhǎng)沙 410125）

甲醛是一種無(wú)色有刺激性氣體，同時(shí)也是一種常見(jiàn)的食品有機(jī)污染物。甲醛的主要危害為對(duì)皮膚黏膜的刺激作用，嚴(yán)重時(shí)可引起呼吸困難、肺水腫等癥狀[1-2]，長(zhǎng)期接觸甚至可能引發(fā)白血病等疾病[3]。近年來(lái)，大量調(diào)查研究顯示諸多食品中檢出甲醛，如水產(chǎn)品、香菇等農(nóng)產(chǎn)品，然而大部分食品中的甲醛并非人為添加或因環(huán)境污染導(dǎo)致，而是在其生長(zhǎng)、貯藏和加工過(guò)程自然產(chǎn)生[4-5]。嬰幼兒配方乳粉作為一類特殊食品，在日常檢驗(yàn)工作中發(fā)現(xiàn)其中甲醛的檢出率處于較高水平，有研究稱可能是嬰幼兒配方乳粉在高溫條件下，加上其中某些營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑的促進(jìn)而生成甲醛[6-7]。乳粉中甲醛的殘留可能會(huì)給嬰幼兒健康帶來(lái)風(fēng)險(xiǎn)，目前因缺乏足夠的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)及膳食數(shù)據(jù)的支持，我國(guó)尚未對(duì)嬰幼兒配方乳粉中甲醛作限量要求。

食品中甲醛存在形式除了游離態(tài)，還有結(jié)合態(tài)，如蛋白質(zhì)易與甲醛結(jié)合形成甲醛-蛋白質(zhì)復(fù)合物，葡萄酒中甲醛常以與SO2結(jié)合的形式存在等。結(jié)合態(tài)的甲醛又分為可逆與不可逆2 種結(jié)合方式。

目前國(guó)內(nèi)外對(duì)于甲醛的檢測(cè)方法較多，大多采用光譜法[8-10]、氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）法[11-13]、高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法[14-17]等這些方法檢出限往往較高且容易受到干擾，HPLC法與GC-MS法雖相對(duì)準(zhǔn)確，但對(duì)前處理要求很高，回收率較低，因此，難以適應(yīng)基質(zhì)本身較為復(fù)雜的嬰幼兒配方乳粉中微量甲醛的測(cè)定。本研究?jī)?yōu)化一種GC法對(duì)嬰幼兒配方乳粉中甲醛進(jìn)行定性及定量測(cè)定，同時(shí)采用GC-MS確證。在不同水溫下沖調(diào)乳粉，分別對(duì)其中的甲醛含量進(jìn)行檢測(cè)，比較不同水溫沖調(diào)對(duì)乳粉中甲醛含量的影響，同時(shí)對(duì)網(wǎng)購(gòu)45 份嬰幼兒配方乳粉的甲醛污染水平進(jìn)行調(diào)查分析與風(fēng)險(xiǎn)暴露評(píng)估，為生產(chǎn)企業(yè)保障產(chǎn)品質(zhì)量安全和政府部門制定嬰幼兒配方乳粉中甲醛的限量提供一定的數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

嬰幼兒配方乳粉45 份（網(wǎng)購(gòu)，國(guó)產(chǎn)品牌20 份，國(guó)外品牌25 份），0～6 月齡、6～12 月齡、12～36 月齡各15 份。

甲醛標(biāo)準(zhǔn)溶液（100 mg/L） 國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心；2,4-二硝基苯肼（分析純）、乙腈（色譜純）、環(huán)己烷（色譜純） 阿拉丁試劑（上海）有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

7890A氣相色譜儀（配備電子捕獲檢測(cè)器（electron capture detector，ECD））、HP-5毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）、7890B-5977B氣相色譜-質(zhì)譜儀、DB-5MS毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm） 美國(guó)Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)液制備

衍生液的配制：稱取適量2,4-二硝基苯肼，用乙腈配制成質(zhì)量濃度為0.5 g/L的溶液，再與磷酸鹽緩沖溶液（pH 5）按體積比1∶1混合即得。

分別移取0.00、0.01、0.02、0.05、0.08、0.10 mL甲醛標(biāo)準(zhǔn)溶液，置于50 mL塑料離心管中，分別加入10.0 mL衍生液，搖勻，于60 ℃水浴中反應(yīng)1 h，取出冷卻后，加入4～5 g硫酸銨固體，混勻，靜置5 min，向標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)液中加入5.0 mL環(huán)己烷，渦旋1 min后，5 000 r/min離心5 min，分層，得到不同甲醛質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)衍生溶液，取上清液，加入5 g無(wú)水硫酸鈉處理，供GC分析。

1.3.2 樣品反應(yīng)液制備

稱取乳粉樣品2.0 g左右于50 mL塑料離心管中，加入10.0 mL衍生液，渦旋混勻，60 ℃水浴振搖1 h，取出后冷卻至室溫，加入4～5 g硫酸銨固體，混勻，靜置5 min，加入5.0 mL環(huán)己烷，渦旋1 min后，5 000 r/min離心5 min，分層，取上清液，加入5 g無(wú)水硫酸鈉處理，供GC及GC-MS分析。

1.3.3 GC條件

進(jìn)樣口溫度250 ℃，流速1.0 mL/min，進(jìn)樣量1 mL，不分流進(jìn)樣；升溫程序：初始溫度40 ℃，以20 ℃/min的速率升溫至240 ℃并保持2 min；ECD檢測(cè)器溫度300 ℃。

1.3.4 GC-MS條件

進(jìn)樣口溫度250 ℃，流速1.0 mL/min，進(jìn)樣量1 mL，不分流進(jìn)樣；升溫程序：初始溫度60 ℃，保持1 min，以20 ℃/min的速率升溫至180 ℃，保持2 min，再以10 ℃/min的速率升溫至280 ℃，保持5 min；離子源溫度230 ℃；電離方式：電子轟擊；確證方式：全掃描與選擇離子監(jiān)測(cè)模式。

1.3.5 不同沖調(diào)溫度對(duì)乳粉中甲醛含量的影響

隨機(jī)選取其中1 份乳粉樣品，按照標(biāo)簽說(shuō)明，稱取樣品30.0 g（約7 平勺），共6 份，每份分別采用30、40、50、60、70、80 ℃的水200 mL進(jìn)行沖調(diào)，密封，待冷卻后，稱取10.0 g，甲醛含量檢測(cè)過(guò)程同1.3.2節(jié)。

1.3.6 甲醛的暴露量計(jì)算

甲醛含量按式（1）計(jì)算。

式中：C為乳粉中甲醛含量/（mg/kg）；m1為從標(biāo)準(zhǔn)工作曲線得到的樣液中甲醛質(zhì)量/μg；m為乳粉質(zhì)量/g。

甲醛暴露量按式（2）計(jì)算。

式中：I為甲醛暴露量/（μg/kg）；C為乳粉中甲醛含量/（mg/kg）；m2為乳粉日攝入量/g；m3為嬰幼兒體質(zhì)量/kg。

不同月齡嬰幼兒體質(zhì)量和嬰幼兒配方乳粉日攝入量參考值如表1所示。

表 1 不同月齡嬰幼兒體質(zhì)量和嬰幼兒配方乳粉日攝入量Table 1 Body mass and daily intake of infant formula in infants of different ages

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理及繪圖采用Excel 2010軟件完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品提取方法選擇

乳粉中甲醛主要為游離態(tài)甲醛和以蛋白質(zhì)-甲醛復(fù)合物形式存在的結(jié)合態(tài)甲醛，內(nèi)源性甲醛主要生成途徑有糖和氨基酸的美拉德反應(yīng)[9]。將乳粉樣品分別經(jīng)常見(jiàn)的水浸法、水蒸氣蒸餾法和衍生液提取法3 種方法提取。

表 2 不同提取方法對(duì)嬰幼兒配方乳粉中甲醛含量測(cè)定結(jié)果的影響Table 2 Effect of different extraction methods on formaldehyde determination in infant formula

由表2可知，水浸法僅能提取到乳粉中游離甲醛，甲醛含量測(cè)定結(jié)果遠(yuǎn)低于其他2 種提取方法，因此不適合乳粉樣品的前處理。水蒸氣蒸餾法和衍生液提取法測(cè)得甲醛含量相近，且均遠(yuǎn)高于水浸法提取甲醛含量，表明該2 種方法均能提取乳粉中游離甲醛和可逆結(jié)合態(tài)甲醛。水蒸氣蒸餾法的檢測(cè)結(jié)果略高于衍生液提取法，原因可能為蒸餾過(guò)程導(dǎo)致乳粉顏色變深，發(fā)生美拉德反應(yīng)，生成了內(nèi)源性甲醛[9]。日常檢驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示乳粉樣品中甲醛含量一般相對(duì)較低，且乳粉屬于復(fù)雜基質(zhì)樣品，如果提取方法不當(dāng)，會(huì)使提取液中的甲醛含量過(guò)低，導(dǎo)致不能檢出或干擾較大，影響檢測(cè)結(jié)果。同時(shí)稱取空白乳粉2.0 g，加入甲醛標(biāo)準(zhǔn)溶液，使得甲醛最終加標(biāo)量為3.0 mg/kg，分別經(jīng)水浸法、水蒸氣蒸餾法和衍生液提取法處理，計(jì)算得到加標(biāo)回收率分別為63.4%、110.4%、96.9%。因此，綜合考慮選擇衍生液提取法提取乳粉樣品中微量甲醛更為合適。

2.2 衍生液與沉淀劑的選擇

比較2,4-二硝基苯肼乙腈溶液-pH 7水溶液（體積比1∶1）、2,4-二硝基苯肼乙腈溶液-pH 5磷酸鹽緩沖液（體積比1∶1）和2,4-二硝基苯肼乙腈溶液-pH 2磷酸鹽緩沖液（體積比1∶1）3 種衍生體系提取乳粉樣品中甲醛的效果。

圖 1 不同衍生體系對(duì)乳粉中甲醛的提取效果（n=3）Fig. 1 Extraction efficiency of formaldehyde from milk powder with different derivatization systems (n = 3)

由圖1可知：pH 7體系的甲醛含量測(cè)定值較低，可見(jiàn)此條件不利于提取樣品中的可逆結(jié)合態(tài)甲醛；pH 2體系的甲醛測(cè)定值較高，但樣品中成分復(fù)雜，可能衍生形成其他醛類物質(zhì)，其甲醛衍生物與甲醛標(biāo)準(zhǔn)品衍生物的GC譜圖不能完全重疊，表明目標(biāo)峰中存在雜質(zhì)峰干擾；pH 5體系與pH 2體系的甲醛測(cè)定值接近，乳粉中蛋白質(zhì)-甲醛復(fù)合物在弱酸性條件下受熱分解釋放出甲醛，衍生劑與甲醛反應(yīng)形成穩(wěn)定的甲醛衍生化物，有利于提取樣品中可逆結(jié)合態(tài)甲醛，因此，選擇2,4-二硝基苯肼乙腈溶液-pH 5磷酸鹽緩沖液（體積比1∶1）作為衍生液。

由于乳粉樣品中蛋白質(zhì)含量較高，對(duì)甲醛的提取效果影響較大，需對(duì)其進(jìn)行凈化處理。選擇三氯乙酸、乙酸鉛和硫酸銨3 種常見(jiàn)的沉淀劑，比較三者沉淀效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：采用三氯乙酸與乙酸鉛作為沉淀劑，試劑空白值較高，干擾檢測(cè)結(jié)果；而硫酸銨則能較好沉淀蛋白質(zhì)和水溶性雜質(zhì)，因此選擇硫酸銨作為沉淀劑。

2.3 衍生溫度的選擇

圖 2 衍生溫度對(duì)甲醛衍生物峰面積的影響（n=3）Fig. 2 Influence of derivatization temperature on peak area of formaldehyde derivative (n = 3)

由圖2可知，衍生溫度40～90 ℃，隨著衍生溫度上升，甲醛衍生物的峰面積逐漸增加，當(dāng)溫度達(dá)到60 ℃時(shí)，繼續(xù)升高溫度，峰面積已趨于穩(wěn)定，即衍生效率達(dá)到最大，因此選擇60 ℃作為甲醛的衍生溫度。

2.4 衍生時(shí)間的選擇

圖 3 衍生時(shí)間對(duì)甲醛衍生物峰面積的影響（n=3）Fig. 3 Effect of derivatization time on peak area of formaldehyde derivative (n = 3)

由圖3可知，采用甲醛衍生物的峰面積表示衍生效率，隨衍生時(shí)間的延長(zhǎng)峰面積隨之增加，60 min后趨于穩(wěn)定。因此，衍生時(shí)間設(shè)定為60 min。

2.6 標(biāo)準(zhǔn)譜圖與線性范圍

圖 4 甲醛標(biāo)準(zhǔn)溶液衍生物GC圖譜Fig. 4 GC chromatogram of derivatized formaldehyde standard solution

由圖4可知，甲醛標(biāo)準(zhǔn)溶液衍生物GC色譜峰形良好，無(wú)雜質(zhì)峰干擾。以標(biāo)準(zhǔn)溶液中甲醛質(zhì)量為橫坐標(biāo)（μg），響應(yīng)峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，在0～10 μg范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，r均大于0.999。

圖 5 甲醛標(biāo)準(zhǔn)溶液衍生物總離子流圖（A）及對(duì)應(yīng)質(zhì)譜圖（B）Fig. 5 Total ion current chromatogram (A) and mass spectrum (B) of derivatized formaldehyde standard solution

由圖5可知，對(duì)于目標(biāo)峰采用GC-MS進(jìn)行確證，采用全掃描模式，扣除背景干擾后，將對(duì)應(yīng)質(zhì)譜圖與NIST譜庫(kù)進(jìn)行匹配，找到甲醛衍生物（甲醛-2,4-二硝基苯腙）出峰位置，匹配度高達(dá)95.4%。

考慮離子豐度及受干擾程度，選擇監(jiān)測(cè)離子m/z為79、122、179、210，如圖6所示。

圖 6 甲醛標(biāo)準(zhǔn)溶液衍生物選擇性離子監(jiān)測(cè)譜圖（A）及對(duì)應(yīng)質(zhì)譜圖（B）Fig. 6 Selected ion monitoring chromatogram (A) and mass spectrum (B)of derivatized formaldehyde standard solution

對(duì)陽(yáng)性乳粉樣品中甲醛進(jìn)行確證，背景扣除后，陽(yáng)性乳粉樣品選擇性離子監(jiān)測(cè)譜圖及對(duì)應(yīng)質(zhì)譜圖如圖7所示。

圖 7 陽(yáng)性乳粉樣品選擇性離子監(jiān)測(cè)譜圖（A）及對(duì)應(yīng)質(zhì)譜圖（B）Fig. 7 Selected ion monitoring chromatogram (A) and mass spectrum (B)of positive milk powder sample

2.7 檢出限與定量限

選擇適宜質(zhì)量濃度的甲醛標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣，觀察其噪音強(qiáng)度，將3 倍信噪比（RS/N）作為檢出限，稀釋甲醛標(biāo)準(zhǔn)溶液，使其在儀器上響應(yīng)強(qiáng)度為3 倍信噪比，計(jì)算得甲醛檢出限為0.1 mg/kg；稀釋甲醛標(biāo)準(zhǔn)溶液，使其在儀器上響應(yīng)強(qiáng)度為10 倍信噪比，以10 倍信噪比（RS/N）作為定量限，計(jì)算得甲醛定量限為0.3 mg/kg。結(jié)果表明，所建立的方法靈敏度較高。

2.8 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)與精密度實(shí)驗(yàn)

圖 8 陰性乳粉樣品GC圖譜Fig. 8 GC chromatogram of negative milk powder sample

圖 9 加標(biāo)（0.3 mg/kg）乳粉樣品GC圖譜Fig. 9 GC chromatogram of spiked milk powder sample (0.3 mg/kg)

分別稱取空白（陰性，不含甲醛）乳粉樣品（實(shí)驗(yàn)室留樣）約2.0 g共18 份，分別加入適量甲醛標(biāo)準(zhǔn)溶液，添加量分別達(dá)到定量限、2 倍定量限、10 倍定量限3 個(gè)添加水平，采用陰性樣品進(jìn)行系統(tǒng)空白背景考察，如圖8～9所示，甲醛出峰位置基本無(wú)干擾。

表 3 甲醛在不同加標(biāo)量下的加標(biāo)回收率（n=6）Table 3 Recoveries of formaldehyde at different spiked concentrations (n= 6)

由表3 可知，不同加標(biāo)水平下平均回收率為88.3%～96.7%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于10%。

2.9 不同沖調(diào)溫度下乳粉中甲醛含量比較

圖 10 不同沖調(diào)溫度下甲醛含量變化Fig. 10 Change in formaldehyde content under different reconstitution temperatures

由圖10可知，將相同質(zhì)量乳粉分別直接按1.3.2節(jié)處理，與經(jīng)40 ℃溫水沖調(diào)后再按1.3.2節(jié)處理測(cè)得乳粉中甲醛含量基本一致。然而，當(dāng)沖調(diào)溫度大于40 ℃，隨著溫度繼續(xù)升高，沖調(diào)后的乳粉樣品中甲醛含量呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，分析可能原因?yàn)殡S著溫度升高，促使美拉德反應(yīng)發(fā)生，產(chǎn)生了新的甲醛。

2.10 網(wǎng)購(gòu)乳粉樣品的甲醛含量檢測(cè)結(jié)果

為模擬實(shí)際攝入過(guò)程，使甲醛污染暴露評(píng)估更科學(xué)合理，對(duì)網(wǎng)購(gòu)的45 份嬰幼兒配方乳粉采用40 ℃溫水進(jìn)行沖調(diào)，溶解混合均勻后對(duì)其中甲醛含量進(jìn)行測(cè)定。

表 4 45 份嬰幼兒配方乳粉（經(jīng)40 ℃溫水沖調(diào)）中甲醛含量測(cè)定結(jié)果（n=3）Table 4 Results of determination of formaldehyde in 45 infant formula samples reconstituted with warm water at 40 ℃ (n= 3)

由表4可知，甲醛檢出率為100%，雖然45 份嬰幼兒配方乳粉樣品總體甲醛含量（0.38～2.72 mg/kg）不高，但仍然可能會(huì)對(duì)以嬰幼兒配方乳粉為主食的嬰幼兒健康帶來(lái)一定風(fēng)險(xiǎn)。

目前國(guó)內(nèi)外針對(duì)甲醛的安全攝入量暫無(wú)明確要求，美國(guó)環(huán)境保護(hù)局建議甲醛每日允許攝入量（allowable daily intake，ADI）為0.2 mg/kg，ADI越大，說(shuō)明該物質(zhì)對(duì)人體健康的危害越小[19]。本研究中甲醛暴露風(fēng)險(xiǎn)暫按0.2 mg/kg來(lái)評(píng)估。由表4可知，12～36 月齡嬰幼兒的甲醛平均暴露水平最高，這可能與其中某些營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑含量有一定相關(guān)性，如硫酸亞鐵、VC等，可促進(jìn)嬰幼兒配方乳粉中內(nèi)源性甲醛的形成[7]。

3 結(jié) 論

采用GC法結(jié)合GC-MS對(duì)嬰幼兒配方乳粉中甲醛含量進(jìn)行測(cè)定與確證，通過(guò)優(yōu)化前處理?xiàng)l件，對(duì)方法的線性范圍、精密度、準(zhǔn)確度、檢出限及定量限等技術(shù)參數(shù)進(jìn)行了評(píng)價(jià)。采用此法檢測(cè)不同沖調(diào)溫度下乳粉樣品中甲醛含量的變化及網(wǎng)購(gòu)45 份嬰幼兒配方乳粉經(jīng)沖調(diào)后的甲醛含量，結(jié)果顯示，該檢測(cè)方法靈敏、準(zhǔn)確且重復(fù)性好。當(dāng)沖調(diào)溫度高于40 ℃，隨著沖調(diào)溫度的升高，甲醛含量逐漸增加，可能原因?yàn)楦邷卮龠M(jìn)了美拉德反應(yīng)生成內(nèi)源性甲醛，因此，沖調(diào)乳粉時(shí)水溫不宜過(guò)高，一般按照產(chǎn)品推薦溫度（40 ℃左右）較合適。對(duì)嬰幼兒配方乳粉中甲醛平均暴露量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，雖與ADI存在一定差距，但對(duì)于將配方乳粉作為主要營(yíng)養(yǎng)攝入且體質(zhì)較敏感的嬰幼兒來(lái)說(shuō)，尤其是12～36 月齡的嬰兒，甲醛攝入帶來(lái)的健康風(fēng)險(xiǎn)仍需引起足夠的重視。關(guān)于影響乳粉中內(nèi)源性甲醛形成的具體因素還有待于進(jìn)一步挖掘與研究。