癲癇小兒認(rèn)知功能與血清蛋白激酶C 表達(dá)水平的相關(guān)性分析

王葆輝 耿麗娟 劉 俊

開封市兒童醫(yī)院，河南 開封475000

癲癇是一種神經(jīng)系統(tǒng)常見病，由已知或未知病因引起，以腦部神經(jīng)元高度同步化，伴自限性異常放電為特征［1-3］。小兒由于神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育不完善，容易因外傷或不明原因而誘發(fā)癲癇。流行病學(xué)資料顯示，我國0～14 歲人群癲癇的患病率約0.345%［4］，癲癇的反復(fù)發(fā)作造成神經(jīng)細(xì)胞受損，長期的癇性放電可引起大腦結(jié)構(gòu)功能以及突觸可塑性的改變，致患者的認(rèn)知、情感、行為等功能異常［5-6］，但目前癲癇的治療效果不盡如人意，易遷延不愈發(fā)展為慢性難治性癲癇，影響患兒終生，故尋找新的可行途徑尤為重要。

蛋白激酶C（protein kinase，PKC）屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族［7］，根據(jù)序列同源性和輔因子可將其分為3個亞組。經(jīng)典的PKC亞組需要結(jié)合鈣和二?；视停―AG）才能激活，并包含同工型PKC α、-βⅠ和-βⅡ（或由同一基因剪接）和-γ［8］。相反，新型PKC 亞組的成員（-δ、-ε、-η和-θ亞型）僅需要DAG 即可激活，而非典型PKC（-ι和-ζ異構(gòu)體）則獨(dú)立于鈣和DAG 激活，但取決于獨(dú)特的基于脂質(zhì)的介質(zhì)和蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用。PKC 在機(jī)體中廣泛分布，可以催化多種蛋白質(zhì)如膜蛋白、酶蛋白等，使底物上的絲氨酸、蘇氨酸殘基磷酸化發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)［9］?；罨腜KC對多種外部或自身剌激導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡均有促進(jìn)作用，海馬神經(jīng)元的凋亡是癲癇后認(rèn)知能力受損的原因之一［10］，突觸后PKC的作用底物神經(jīng)顆粒素（neurogranin，NG）通過鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ（CaMKⅡ）等參與學(xué)習(xí)記憶的構(gòu)建［11］。因此，探尋癲癇后認(rèn)知能力的改變與PKC表達(dá)水平的相關(guān)性對小兒癲癇后認(rèn)知改變具有一定的現(xiàn)實意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2018-01—2019-10 就診于開封市兒童醫(yī)院的10～15 歲癲癇患兒79 例（癲癇組），同時征詢正常發(fā)育同齡兒童40例為對照組。對照組男28 例，女12 例，年齡（11.23±1.45）歲；癲癇組男57例，女22 例，年齡（10.11±1.21）歲。2 組性別（χ2=0.380，P=0.592）、年齡（t=1.137，P=0.227）比較無明顯差異（P＞0.05）。癲癇組患兒的診斷參照小兒癲癇診斷標(biāo)準(zhǔn)［12］，各組兒童納入試驗前均征求家屬意見，并簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并凝血功能障礙者；合并嚴(yán)重感染性疾病者；合并惡性腫瘤者；合并先天性心臟病者；存在麻醉藥物過敏史者；表達(dá)障礙或精神疾病者。

1.2 方法

1.2.1 認(rèn)知功能評估量表（mini-mental state examination，MMSE）測試：2 組兒童均于靜室中30 min 內(nèi)獨(dú)立自主完成量表，從定向力（orientation）、記憶 力（memory）、注 意 力 和 計 算 力（attention &calculate）、回憶能力（recall）以及語言能力（language）5 個維度檢測各組兒童的認(rèn)知功能。若遇不理解量表內(nèi)容兒童，可在不干預(yù)自主答題的前提下予以解釋，量表總分為0～30分。

1.2.2 血清PKC水平測定：抽取2組靜脈血2 mL，使用人蛋白激酶C ELISA 試劑盒（上海西唐生物科技有限公司，F(xiàn)16527），抽取的血液樣本3 000 r/min 離心10 min，汲取上清液，1∶2稀釋（取50 μL，加標(biāo)本稀釋液50 μL），按照說明進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)品配制：加入1 mL蒸餾水于標(biāo)準(zhǔn)品原液中，混勻，使標(biāo)準(zhǔn)品濃度為20 ng/mL。標(biāo)準(zhǔn)管共設(shè)8 管，首先在第1 管中加標(biāo)本稀釋液900 μL，其余管中加入500 μL，而后在第1管中加入配置好的濃度20 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液100 μL，混勻，使用移液器吸出500 μL，移入第2 管中。反復(fù)上述操作進(jìn)行稀釋，至第7 管時從中吸出500 μL 棄去。第8管不加樣作為空白對照。ddH2O 1∶10倍稀釋10×標(biāo)本稀釋液，同時用ddH2O 1∶20 稀釋洗滌液。96 孔抗體包被酶標(biāo)板中每孔各加入標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品100 μL，充分震蕩混勻，置37 ℃溫箱孵育120 min。棄去各孔溶液，加入洗滌液洗板4～6次，反扣于濾紙上控干液體。各孔加入一抗工作液100 μL，充分混勻，置37 ℃溫箱孵育60 min。洗板，每孔加酶標(biāo)二抗工作液100 μL，37 ℃溫育30 min。洗板，各孔加入100 μL底物工作液，37 ℃避光孵育15 min后每孔加入100 μL終止液混勻終止反應(yīng)。30 min內(nèi)將酶標(biāo)板置于酶標(biāo)儀中，在450 nm處檢測吸光值。所有OD值都應(yīng)減除空白值后再行計算。以標(biāo)準(zhǔn)品2 000、1 000、500、250、125、62.5、31.2、0 pg/mL 為橫坐標(biāo)，OD 值為縱坐標(biāo)，畫出標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)樣品OD 值在該曲線圖上查出相應(yīng)PKC含量，再乘以稀釋倍數(shù)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 23.0 統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，行t檢驗，單因素方差分析用于多組間比較，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 認(rèn)知功能評估結(jié)果 2組定向力、注意力和計算力及語言能力比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），癲癇組記憶能力、回憶能力及總評分較對照組均明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01，圖1）。

2.2 血清PKC 檢測結(jié)果 與對照組相比，癲癇組患兒血清PKC 水平明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01，圖2）。

圖1 MMSE檢測結(jié)果Figure 1 Results of the MMSE test

2.3 認(rèn)知評估結(jié)果與PKC 表達(dá)水平的相關(guān)性 相關(guān)性分析顯示，定向力評分結(jié)果與PKC 水平略呈負(fù)相關(guān)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；記憶力評分與PKC水平呈正相關(guān)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.000 1）；注意力和計算能力評分與PKC 水平呈正相關(guān)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.004 4）；回憶能力與PKC 水平呈正相關(guān)，且具有顯著的相關(guān)性（P＜0.000 1）；語言能力與PKC水平呈正相關(guān)，相關(guān)性不顯著；MMSE總評分與PKC 水平呈正相關(guān)，且具有顯著相關(guān)性（P＜0.000 1，圖3）。

圖2 2組血清PKC檢測結(jié)果Figure 2 Serum PKC test results of two groups

3 討論

作為一種慢性中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，癲癇具有突發(fā)性、短暫性、反復(fù)發(fā)作性和刻板性的特點(diǎn)，表現(xiàn)為運(yùn)動、感覺、意識、精神、行為和自主神經(jīng)等不同障礙［13-14］。相關(guān)研究表明，約60%的癲癇患者于兒童時期首次發(fā)病，患病率高達(dá)5.5%，屬于兒童時期最常見的慢性?。?5］。研究表明，與其他慢性?。ㄈ缣悄虿』蛳﹥和啾龋d癇兒童對疾病的了解甚少［16］。最重要的是，癲癇兒童日常生活也受到嚴(yán)重影響，不僅在學(xué)校，而且在愛好、與其他兒童的互動和交友方面也是如此［17-18］。此外，文獻(xiàn)報道癲癇兒童的社交技能比無癲癇的兒童差［19］。因此，有必要特別關(guān)注患有癲癇的兒童和青少年。究其原因，在此時期小兒各系統(tǒng)的發(fā)育均未成熟，神經(jīng)系統(tǒng)尤為明顯。癇性放電容易造成智力、認(rèn)知發(fā)育畸形，且會持續(xù)至成人時期，給患兒帶來終生性的損害［20-21］。

圖3 MMSE評分與PKC水平的相關(guān)性分析 A：定向力與PKC的相關(guān)性；B：記憶力與PKC的相關(guān)性；C：注意力和計算能力與PKC的相關(guān)性；D：回憶能力與PKC的相關(guān)性；E：語言能力與PKC的相關(guān)性；F：總評分與PKC的相關(guān)性Figure 3 Correlation analysis of MMSE scale score and PKC level. A: Correlation between orientation and PKC; B:Correlation between memory and PKC; C: Correlation between attention and computing ability and PKC; D: Correlation between recall ability and PKC;E:Correlation between language ability and PKC;F:Correlation between total score and PKC

顳葉癲癇是最常見的局灶性癲癇，占局灶性癲癇發(fā)作的36%［22-23］。在顳葉癲癇中，大腦的癲癇發(fā)作始于處理情緒和短期記憶的顳葉。既往研究表明，認(rèn)知障礙和記憶力減退是顳葉癲癇的常見共?。?4-26］，但顳葉癲癇相關(guān)認(rèn)知功能障礙的分子機(jī)制仍不清楚［27］。研究表明，轉(zhuǎn)錄因子cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白在記憶形成以及許多神經(jīng)退行性疾病（如阿爾茨海默病、帕金森病和血管性癡呆）的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮關(guān)鍵作用［28-29］。cAMP 反應(yīng)元件結(jié)合蛋白在大腦的神經(jīng)元可塑性和長期記憶形成中的作用已有文獻(xiàn)記載，且其對于空間記憶的形成是不可或缺的［30］。此外，cAMP 反應(yīng)元件結(jié)合蛋白還調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄，包括腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、Arc 和c-fos，介導(dǎo)了短期和長期記憶的形成［31］。氧化損傷產(chǎn)生的ROS產(chǎn)物是炎癥反應(yīng)、小膠質(zhì)細(xì)胞激活和炎性細(xì)胞因子釋放的關(guān)鍵觸發(fā)因素，這些反應(yīng)抑制了神經(jīng)發(fā)生，抑制了腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達(dá)，導(dǎo)致神經(jīng)元可塑性降低和記憶形成［32］。研究表明，氧化應(yīng)激在此過程中可明顯降低線粒體功能、誘導(dǎo)神經(jīng)元死亡而促進(jìn)癲癇發(fā)作，導(dǎo)致認(rèn)知障礙［33］；此外，突觸可塑性的改變與相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的異常表達(dá)會導(dǎo)致因自由基積聚而引起神經(jīng)元受損［34-36］，同時也增加了神經(jīng)元興奮性，從而導(dǎo)致異常放電及認(rèn)知障礙［37-38］。相對于成人癲癇后認(rèn)知障礙，小兒癲癇患者因處于神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育階段而對正常的學(xué)習(xí)記憶能力甚至智力發(fā)育造成不可逆的影響，因此，需要特別關(guān)注小兒癲癇后的認(rèn)知損傷。為了探尋小兒癲癇后認(rèn)知損傷的可能干預(yù)靶點(diǎn)，首先需要了解患兒的認(rèn)知狀態(tài)，綜合考慮小兒的受教育程度特點(diǎn)，本研究采用認(rèn)知狀態(tài)量表對患兒認(rèn)知狀態(tài)進(jìn)行評估。

MMSE量表于1975年為應(yīng)用于阿爾茨海默病而編制，簡單易行，經(jīng)過多年臨床應(yīng)用，已成為最廣泛的認(rèn)知功能評估方法之一［39］。MMSE 量表主要包括記憶力、注意力、定向力及語言能力、回憶能力、計算能力等五方面共計30條目的評估，滿分為30分。國內(nèi)對于腦卒中患者行MMSE 的相關(guān)應(yīng)用表明，其結(jié)果具有良好的信度，總體內(nèi)部一致性（Cronbach’s α系數(shù)）為0.833，可作為認(rèn)知功能快速檢測方法［40］。

蛋白激酶是一類將蛋白固定位點(diǎn)與磷酸根偶聯(lián)以激活蛋白活性的生物酶家族，PKC是其中的一種，為一組由單一肽鏈結(jié)構(gòu)組成的絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶［41］。PKC 廣泛分布于哺乳動物及人類的各組織中，腦中含量尤為豐富［42］。相關(guān)研究表明，PKC參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖分化、神經(jīng)發(fā)生等過程，在突觸可塑性調(diào)節(jié)及學(xué)習(xí)與認(rèn)知行為中起關(guān)鍵作用［43］。研究表明，PKC 家族的同工酶PKC-ε的活化在阿爾茲海默病的發(fā)展中起保護(hù)作用［44］；另外，PKC-γ在大腦中的表達(dá)主要參與調(diào)節(jié)神經(jīng)可塑性，包括長時程增強(qiáng)（long-term potentiation，LTP）和 長 時 程 抑 制（long-term depression，LTP）的調(diào)節(jié)［45］。

本研究表明，癲癇患兒與正?；純合啾龋J(rèn)知能力明顯受損，記憶能力與回憶能力受損尤為明顯，同時癲癇患兒的血清PKC 水平也明顯降低，兩者存在一定的關(guān)聯(lián)性。研究證實，PKC 的兩種非典型亞基PKCι/λ和PKMζ在長時程增強(qiáng)和記憶維持中發(fā)揮不同作用，且PKMζ作用更為顯著［46］，PKMζ可以通過與維持LTP相同的機(jī)制維持長時呈記憶［47］。通過主動位置的回避或放射迷宮的空間調(diào)節(jié)等操作可以誘導(dǎo)海馬PKMζ表達(dá)的持續(xù)增加，并可以持續(xù)1 d～1 個月；另外，向海馬區(qū)注射PKMζ反義寡核苷酸能夠抑制PKMζ的表達(dá)增加，阻止長時呈記憶形成［48］。在抑郁大鼠模型可觀察到空間學(xué)習(xí)記憶功能下降和PKC表達(dá)水平的降低，同時應(yīng)用帕羅西汀治療后可使大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶功能恢復(fù)，PKC 表達(dá)水平也隨之升高［49］。此外，PKC 的激動劑苔蘚抑素-1 可以中斷大鼠腦缺血缺氧所引發(fā)的細(xì)胞凋亡，增加存活細(xì)胞數(shù)量，同時也可誘導(dǎo)海馬CA1 區(qū)的突觸發(fā)生以及增加腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）的表達(dá)。進(jìn)一步的研究表明，PKC 介導(dǎo)的突觸重塑和修復(fù)過程一致，這一現(xiàn)像可以在腦缺血缺氧事件發(fā)生后維持大鼠持久的空間學(xué)習(xí)和記憶保留［50-51］。本研究MMSE 評分與PKC 表達(dá)水平的Pearson 相關(guān)性分析表明，癲癇兒童MMSE 量表的總體評分、記憶能力評分、注意力與計算能力評分及回憶能力評分與PKC 水平具有明顯的相關(guān)性，若以PKC 及其家族衍生物作為小兒癲癇治療新的切入點(diǎn)，或可發(fā)現(xiàn)新的治療靶點(diǎn)。