健康正常無性生活史女性陰道分泌物中微生物組學(xué)分析

吳意，王芳，劉澤濱

女性陰道分泌物中的菌群是一個(gè)較為復(fù)雜的微生態(tài)系統(tǒng)。健康正常女性陰道內(nèi)存在種類繁多的微生物群，它們與宿主之間構(gòu)成相互協(xié)調(diào)、相互制約、相互作用的動(dòng)態(tài)平衡關(guān)系，也是宿主抵御病原菌或條件致病菌的重要屏障之一，與人體健康和疾病的關(guān)系非常密切。女性陰道內(nèi)的微生態(tài)平衡受到體內(nèi)外微環(huán)境變化、藥物作用、宿主的激素水平和機(jī)體免疫調(diào)節(jié)狀態(tài)等諸多因素共同影響，一旦平衡被打破，就容易導(dǎo)致疾病的發(fā)生和發(fā)展。由于陰道內(nèi)的菌群主要為厭氧茵，而且培養(yǎng)條件苛刻，使用傳統(tǒng)細(xì)菌培養(yǎng)和分離鑒定技術(shù)很難全面了解陰道菌群結(jié)構(gòu)，限制了對女性陰道微生物菌群結(jié)構(gòu)多樣性與疾病關(guān)系的進(jìn)一步研究。近年來隨著分子生物學(xué)診斷技術(shù)的飛速發(fā)展，人們對陰道內(nèi)的微生物菌群有了突破性認(rèn)識。本研究分析健康正常無性生活史女性陰道分泌物中菌群結(jié)構(gòu)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 研究對象

隨機(jī)選取2017年1月至2018年12月在深圳市福田區(qū)婦幼保健院婦?？谱骰闄z的健康正常無性生活史女性29例作為研究對象，白帶常規(guī)檢查各項(xiàng)指標(biāo)均正常且無任何臨床婦科癥狀。

1.2 標(biāo)本采集

陰道內(nèi)側(cè)壁上1/3處取分泌物，為防止樣本污染，使用一次性原裝陰道拭子嚴(yán)格無菌操作，采樣時(shí)不能觸碰到陰道外皮膚或陰道拭子管外壁，所有樣本立即-20℃冰箱保存。

1.3 儀器設(shè)備及試劑

主要儀器IIIumina HiSeq 2500基因測序儀購于美國IIIumina公司，5 QL 900型漩渦振蕩器購于海門的其林貝爾，417 R型低溫臺式離心機(jī)購于德國Eppendorf公司，Thermomixer儀器購于德國Eppendorf公司；構(gòu)建文庫用的ITS序列和16S rRNA基因試劑盒購于華大基因有限公司武漢分公司。

1.4 樣本DNA提取

在樣本采集管中加入1 mL無菌生理鹽水充分震蕩，將陰道分泌物洗脫并轉(zhuǎn)移到1.5 mL離心管中12 000 r/min離心10 min，棄去上清液后在沉淀物中加入50 μL DNA提取液，接著放在100℃干浴器中裂解10 min，最后12 000 r/min離心5 min。上清液中樣本DNA模板可保存-20℃冰箱備用。

1.5 文庫構(gòu)建和測序

文庫構(gòu)建及測序參照吳意等[1]文章中的步驟進(jìn)行。

1.6 序列拼接及數(shù)據(jù)處理

序列拼接及數(shù)據(jù)處理同樣參照吳意等[1]文章中的步驟進(jìn)行。使用R軟件和秩和檢驗(yàn)進(jìn)行個(gè)體間顯著性差異分析，P值校正通過R(v3.1.1)包中的p.adjust進(jìn)行，校正方法為“BH”。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用R軟件(v3.1.1) 和秩和檢驗(yàn)進(jìn)行個(gè)體間顯著性差異分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 29份樣本物種注釋分析結(jié)果

樣本16S rRNA基因的OTU通過與Greengene數(shù)據(jù)庫比對分析，分別注釋出12個(gè)門、11個(gè)綱、14個(gè)目、26個(gè)科、36個(gè)屬和19個(gè)種水平物種(圖1～6，見彩插1、2)。樣本ITS序列的OTU通過與Greengene數(shù)據(jù)庫比對分析，分別注釋出1個(gè)門、1個(gè)綱、1個(gè)目、1個(gè)科、1個(gè)屬和2個(gè)種水平物種，其中2個(gè)種水平物種分別為白假絲酵母和近平滑假絲酵母。

2.2 樣本多樣性

單個(gè)樣本Alpha多樣性不同指數(shù)的稀釋曲線結(jié)果顯示測序深度已基本覆蓋到樣品中所有的物種，圖7為樣本分析稀釋曲線(見彩插2)。Alpha多樣性分析中Sobs指數(shù)、Chao指數(shù)、Ace指數(shù)、Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)均顯示不同樣本間物種多樣性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.3 樣本間物種組成聚類分析

樣本間物種組成聚類分析結(jié)果顯示29份健康正常無性生活史女性陰道分泌物中菌群結(jié)構(gòu)整體比較相似，差異較小，見下頁圖8。

2.4 樣本間多樣性分析

樣本間Beta多樣性分析結(jié)果顯示29份健康正常無性生活史女性陰道分泌物菌群結(jié)構(gòu)大多數(shù)比較相似，少數(shù)存在部分差異，見圖9(見彩插2)。

2.5 物種熱圖分析

Heatmap聚類分析顯示29份陰道分泌物樣本在屬水平物種組成及豐度比較相似，屬水平3個(gè)主要物種分別為乳桿菌屬、小類桿菌屬和普氏菌屬，見圖10(見彩插2)。

注:樣本越靠近,枝長越短,說明兩個(gè)樣本的物種組成越相似。圖8 29份陰道分泌物樣本聚類分析圖(按Description分組,weighted_unifrac)

3 討論

陰道內(nèi)菌群結(jié)構(gòu)是女性重要的微生態(tài)體系之一，健康女性陰道內(nèi)存在一定數(shù)量和種類的常居菌群，主要由原核細(xì)胞型、真核細(xì)胞型和非細(xì)胞型微生物組成，與人類的健康和疾病關(guān)系密切。正常健康女性陰道內(nèi)可分離出50多種微生物，G+需氧菌主要是乳酸桿菌、隱性桿菌、腸球菌、葡萄球菌以及氣球菌等；G-需氧菌主要是大腸桿菌、加德納菌、奈瑟氏球菌、放線桿菌等；厭氧菌主要是梭狀芽胞桿菌、消化鏈球菌、普雷沃菌及雙歧桿菌等[2]。全面了解正常健康女性陰道內(nèi)菌群的結(jié)構(gòu)及動(dòng)態(tài)變化，有助于研究泌尿生殖道感染疾病的發(fā)生以及發(fā)展過程，輔助指導(dǎo)臨床治療和及時(shí)干預(yù)控制，同時(shí)也可以避免濫用各種藥物而導(dǎo)致的耐藥菌株產(chǎn)生。正常健康女性陰道內(nèi)的菌群主要以乳桿菌為優(yōu)勢菌，其他雜菌少量共生；陰道的酸堿度一般維持在pH 3.8～4.5之間，當(dāng)陰道微生態(tài)平衡被打破時(shí)，可使陰道內(nèi)環(huán)境對病原微生物的抵抗力降低，導(dǎo)致繼發(fā)感染發(fā)生[3]。

本研究由圖10 Heatmap聚類分析可發(fā)現(xiàn)健康正常無性生活史女性陰道菌群結(jié)構(gòu)在屬水平主要的3個(gè)物種分別為乳桿菌屬、小類桿菌屬和普氏菌屬，其中以乳桿菌屬為主，說明乳桿菌屬在健康正常無性生活史女性陰道菌群結(jié)構(gòu)中起關(guān)鍵作用。自然界中有130多種乳桿菌能夠產(chǎn)生乳酸，其中有20余種乳桿菌存在于女性的陰道內(nèi)[4-5]，它們可以利用陰道內(nèi)上皮細(xì)胞的糖原，通過代謝途徑產(chǎn)生乳酸，使陰道的酸堿度維持在弱酸性水平，間接抑制了其他條件致病微生物及外界病原體的感染。而本研究檢測到的乳桿菌屬主要有3個(gè)物種，即瑞氏乳桿菌、惰性乳桿菌和羅伊乳桿菌。我們在研究男性前列腺炎疾病時(shí)發(fā)現(xiàn)對照組正常健康男性的尿道分泌物中也同樣存在瑞氏乳桿菌和惰性乳桿菌，這兩種菌究竟是否為男女泌尿生殖道共有菌有待進(jìn)一步考證。Hoffman等[6]研究發(fā)現(xiàn)細(xì)菌性陰道炎是由于乳酸桿菌減少或缺失，導(dǎo)致陰道加德納菌過度生長繁殖，并促使許多G-厭氧桿菌也過度生長。需氧菌性陰道炎主要是由金黃色葡萄球菌、B族溶血性鏈球菌、腸球菌、大腸埃希菌等需氧菌異常增殖導(dǎo)致的感染。由圖6可見此次實(shí)驗(yàn)OTU在種水平共注釋出19個(gè)物種，分別是Atopobiumvaginae、Campylobacterureolyticus、Clostridiumperfringens、Corynebacteriumkroppenstedtii、Escherichiacoli、Lactobacillushelveticus、Lactobacillusiners、Lactobacillusreuteri、Haemophilusparainfluenzae、Jonquetellaanthropi、Moryellaindoligenes、Neisseriasubflava、Peptostreptococcusanaerobius、Prevotellacopri、Prevotellamelaninogenica、Prevotellananceiensis、Streptococcusagalactiae、Streptococcusanginosus和Veillonella。正常健康女性陰道內(nèi)經(jīng)常是以一種或多種乳桿菌為優(yōu)勢菌，其中最常見的有詹氏乳桿菌、惰性乳桿菌、卷曲乳桿菌和加氏乳桿菌。在不同種族人群之間，其優(yōu)勢菌有明顯的差異，白種人和亞洲人中80%～90%的優(yōu)勢菌都為乳桿菌，而在西班牙人和黑人中則不到60%[7]。Joo等[8]報(bào)道了目前乳桿菌中數(shù)量最多的是嗜酸乳桿菌、唾液乳桿菌和發(fā)酵乳桿菌，它們既能起到自凈作用，還能激活巨噬細(xì)胞，維持陰道局部的抗感染能力，對維持整個(gè)陰道菌群平衡起到關(guān)鍵性作用。哺乳、月經(jīng)周期、妊娠、避孕、分娩和性生活等均能影響陰道菌群的微生態(tài)，本研究在健康正常無性生活史女性陰道分泌物中乳桿菌屬僅檢測出瑞氏乳桿菌、惰性乳桿菌和羅伊乳桿菌，與國內(nèi)文獻(xiàn)報(bào)道的妊娠期孕婦陰道菌群結(jié)構(gòu)存在一定的差異[9]，推測性生活可能會直接或間接影響到乳桿菌屬菌群的結(jié)構(gòu)，或是因?yàn)榈赜?、國家及人種不同，其原因有待進(jìn)一步證實(shí)。本研究發(fā)現(xiàn)瑞氏乳桿菌和惰性乳桿菌在整個(gè)陰道分泌物菌群結(jié)構(gòu)中所占的豐度是最高的，其中瑞氏乳桿菌最高達(dá)到99%，惰性乳桿菌最高達(dá)到90%。由圖8樣本間物種組成聚類分析和圖9樣本間Beta多樣性分析結(jié)果可以看出29名健康正常無性生活史女性陰道分泌物中菌群結(jié)構(gòu)整體比較相似，少數(shù)存在部分差異，說明個(gè)體差異較小，菌群結(jié)構(gòu)比較穩(wěn)定。本研究在健康正常無性生活史女性陰道分泌物中僅檢出白假絲酵母和近平滑假絲酵母兩種真菌，真核細(xì)胞型微生物種類數(shù)量偏少，這可能與隨機(jī)取材有關(guān)。

女性陰道微生態(tài)檢測主要包括功能學(xué)檢測和形態(tài)學(xué)檢測兩部分[10]。功能學(xué)檢測主要是通過測定女性陰道內(nèi)微生物酶的活性以及代謝產(chǎn)物來判定微生物的功能狀況。形態(tài)學(xué)檢測內(nèi)容主要是包括病原體、優(yōu)勢菌群、菌群密集度、多樣性、白細(xì)胞數(shù)和各項(xiàng)疾病評分等指標(biāo)。陰道的微生態(tài)評價(jià)目前主要是通過形態(tài)學(xué)和功能學(xué)兩者相結(jié)合。當(dāng)陰道內(nèi)的優(yōu)勢菌、菌群密集度、多樣性、酸堿度、陰道分泌物中白細(xì)胞等炎癥指標(biāo)和乳酸桿菌功能，其中任何一項(xiàng)出現(xiàn)異常，即可診斷為陰道微生態(tài)失調(diào)狀態(tài)。一些病理情況如內(nèi)分泌性疾病、感染性疾病、抗菌藥物治療、免疫抑制劑和化療藥物的使用等也可以打破陰道微生態(tài)的平衡。陰道微生態(tài)檢測評價(jià)系統(tǒng)不僅能輔助診斷臨床常見類型的陰道炎癥，還能對陰道分泌物常規(guī)檢查未發(fā)現(xiàn)特殊病原體，僅臨床上有“外陰瘙癢和白帶增多”等癥狀而難以診斷的患者提高診斷率[11]。陰道微生態(tài)檢測評價(jià)系統(tǒng)既能準(zhǔn)確診斷單純性陰道感染，也能及時(shí)發(fā)現(xiàn)各種混合性陰道炎。全面評價(jià)陰道微生態(tài)環(huán)境，在明確診斷的基礎(chǔ)上，感染治療方面除按照診治指南進(jìn)行針對病原微生物的藥物治療外，還應(yīng)用陰道微生態(tài)制劑恢復(fù)乳桿菌維持弱酸性環(huán)境的功能，減少陰道感染的反復(fù)發(fā)作[12]，通過修復(fù)陰道黏膜，恢復(fù)陰道內(nèi)菌群微生態(tài)平衡是陰道感染治療的最終目標(biāo)之一。目前研究認(rèn)為，微生態(tài)失調(diào)絕大部分只是暫時(shí)性的，當(dāng)宿主免疫功能增強(qiáng)時(shí)即可恢復(fù)陰道微生態(tài)平衡；當(dāng)外來病原體增加或機(jī)體抵抗力低下時(shí)，可導(dǎo)致炎癥的發(fā)生。

本研究通過高通量二代測序技術(shù)全面了解健康正常無性生活史女性陰道內(nèi)的微生物菌群結(jié)構(gòu)，建立正常菌群物種數(shù)據(jù)庫，對后續(xù)陰道疾病的診治具有非常重要的意義?？梢酝ㄟ^與正常菌群數(shù)據(jù)庫的比對，發(fā)現(xiàn)差異物種，找到導(dǎo)致陰道疾病的病原體。對傳統(tǒng)細(xì)菌培養(yǎng)方法無法鑒定的菌種后續(xù)也可以對其專門進(jìn)行分離驗(yàn)證。