蛋清溶菌酶的改造及其抑菌活性

李 穎，馮自立，白 瑜，張宇航，任雪怡

(陜西理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，漢中 723000)

蛋清溶菌酶(hen egg-white lysozyme，HEWL)來源于雞蛋清，由18種129個(gè)氨基酸組成，分子量為14.3 ku，含有4對(duì)二硫鍵，二級(jí)結(jié)構(gòu)中富含α螺旋，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，pH 1.2～11.3劇烈變化時(shí)，結(jié)構(gòu)仍保持不變，遇熱也比較穩(wěn)定，是商業(yè)化生產(chǎn)的主要溶菌酶。蛋清溶菌酶作為小分子蛋白質(zhì)，具有天然無毒、易分解、不殘留等優(yōu)點(diǎn)，可作為天然抑菌劑用于飼料添加、食品抑菌、防腐等方面，但天然蛋清溶菌酶對(duì)革蘭陰性菌抑菌效果較差，且不能直接分解經(jīng)乙?；揎椀母锾m陽性菌，這限制了蛋清溶菌酶在飼料添加等方面的應(yīng)用[1-6]。研究報(bào)道，改性的蛋清溶菌酶能夠抑制革蘭陰性菌的生長，蛋清溶菌酶的改造方法有化學(xué)改性、生物改性、物理改性等，如溶菌酶游離的N端氨基和賴氨酸的ε殘基與油基共價(jià)結(jié)合[7]，以及溶菌酶與咖啡酸和肉桂酸共價(jià)結(jié)合均可以有效抑制大腸桿菌生長[8]，還原劑Na2SO3能夠降低R-S-S-R的鍵能，擴(kuò)大溶菌酶的抑菌范圍[9]，基因改造增強(qiáng)溶菌酶的抑菌活性[10]，100 Mpa 壓強(qiáng)條件下，70 ℃ 30 s，70 ℃ 5 min或者100 ℃ 5 min 處理溶菌酶均可以提高溶菌酶的抑菌活性[11]。蛋清溶菌酶在多種理化條件(溫度、緩沖體系及酸堿性)下會(huì)形成有毒性的淀粉樣纖維[12-16]，目前，對(duì)于蛋清溶菌酶形成的淀粉樣纖維在抑菌方面的研究鮮見報(bào)道。因此，本試驗(yàn)采用高溫強(qiáng)酸條件改造蛋清溶菌酶，圓二色譜法和BeStSel軟件分析改造前后蛋清溶菌酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)變化，采用牛津杯法、生長曲線測定法以及Western blot測定不同濃度的改造蛋清溶菌酶對(duì)大腸桿菌、鰻弧菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽胞桿菌的抑菌效果，旨在探索改造后的蛋清溶菌酶對(duì)兩種G+和G-的抑菌效果，為改造蛋清溶菌酶在畜牧業(yè)中的應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌種

大腸桿菌ATCC 8739、鰻弧菌ATCC 43308、金黃色葡萄球菌ATCC 25923和枯草芽胞桿菌ATCC 21332均為標(biāo)準(zhǔn)菌株，由陜西省食藥用菌工程技術(shù)中心惠贈(zèng)。

1.2 主要試劑

蛋清溶菌酶購自MedChemExpress(中國)公司，8-苯胺基-1-萘磺酸(ANS)購自艾美捷科技有限公司，Millipore PVDF膜(0.22 μm)購自北京索萊寶生物公司，甘氨酸購自MP生物醫(yī)藥公司，Lysozyme多克隆抗體購自美國Abcam公司，山羊抗兔IgG(辣根酶標(biāo)記)、DAB顯色液均購自北京中杉金橋生物公司；氯化鈉、酵母浸提液、瓊脂粉、蛋白胨等購自陜西樂博生物科技有限公司，其他生化試劑均為進(jìn)口分裝或國產(chǎn)分析純。

1.3 主要儀器

透射電子顯微鏡(型號(hào)為T12)購自FEI公司，熒光分光光度計(jì)(型號(hào)為Cary Eclipse)購自安捷倫(中國)科技有限公司，圓二色譜儀(型號(hào)為J-1500)購自日本分光株式會(huì)社，全波長酶標(biāo)儀(型號(hào)為Epoch)購自美國Bio-Tek公司，蛋白質(zhì)凝膠電泳儀(型號(hào)為DYCZ-24DN)購自北京六一生物科技有限公司，高壓蒸汽滅菌鍋(型號(hào)為GR85DR)購自美國ZEALWAY公司，超凈工作臺(tái)(型號(hào)為SW-CJ-2D)購自蘇州凈化有限公司，冷凍干燥機(jī)(型號(hào)為FD5-3)購自美國SIM國際集團(tuán)，恒溫孵育搖床(型號(hào)為OS60)購自北京萊普特科學(xué)儀器公司。

1.4 改造蛋清溶菌酶樣品制備

稱取一定量蛋清溶菌酶溶解于pH 2.0的甘氨酸溶液(50 mmol·L-1)至終濃度為100 μmol·L-1，在(57.0±0.1)℃、250 r·min-1條件下振蕩孵育。孵育8 d后，經(jīng)透射電子顯微鏡確定其形成桿狀纖維樣的超微結(jié)構(gòu)，經(jīng)凍干處理后，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 透射電鏡觀察

取15 μL蛋清溶菌酶孵育樣品滴加至200目無碳方華膜上，磷鎢酸(phosphotungstic acid，PTA)負(fù)染30 s，室溫干燥后，置于透射電子顯微鏡(軍事口腔醫(yī)學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成)下觀察纖維樣結(jié)構(gòu)，電壓為100 kV。

1.6 ANS熒光檢測和圓二色譜檢測

疏水性測定：取20 μL孵育的蛋清溶菌酶樣品加入適量超純水，再加入20 μL ANS溶液(1 mmol·L-1)， 使溶菌酶待測樣品終濃度為1 μmol·L-1， 染料終濃度為10 μmol·L-1，混勻后，室溫避光孵育3 min，采用熒光分光光度計(jì)在420～600 nm進(jìn)行熒光掃描，激發(fā)波長380 nm，激發(fā)狹縫5 nm，發(fā)射狹縫5 nm。

圓二色譜檢測蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化，最低橢圓率出現(xiàn)在208 nm處時(shí)說明二級(jí)結(jié)構(gòu)以α螺旋為主，最低橢圓率出現(xiàn)在218 nm處時(shí)說明二級(jí)結(jié)構(gòu)以β折疊為主[17]。將蛋白樣品稀釋至終濃度0.1 mg·mL-1，進(jìn)行190～260 nm光譜掃描，帶寬為1 nm，光程為0.1 cm。使用在線BeStSel 軟件[18]計(jì)算β折疊含量。

1.7 菌懸液制備

分別蘸取大腸桿菌、鰻弧菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽胞桿菌菌種接種于適量液體培養(yǎng)基中，37 ℃、 220 r·min-1培養(yǎng)過夜，1∶1 000稀釋制備菌懸液，菌懸液濃度為1.0×106～1.0×108CFU·mL-1。

1.8 抑菌濃度篩選

采用牛津杯法進(jìn)行抑菌濃度篩選。牛津杯中分別加入100、500和1 000 μmol·L-1的改造蛋清溶菌酶30 μL，對(duì)照組分別加入等濃度等體積的蛋清溶菌酶溶液，靜置待溶液完全吸收，倒置于37 ℃恒溫培養(yǎng)過夜，測量抑菌圈直徑并記錄。每個(gè)濃度3次重復(fù)，求平均值。

1.9 供試菌菌液OD值測定

將改造蛋清溶菌酶樣品配制成濃度為100 μmol·L-1的母液，試驗(yàn)組加不同體積的改造蛋清溶菌酶樣品于制備好的菌懸液中，至終濃度分別為2、4、6、8和10 μmol·L-1，空白組加入不含改造蛋清溶菌酶的超純水，37 ℃、220 r·min-1恒溫?fù)u床培養(yǎng)，每30 min取樣100 μL置于96孔板中，測定350 nm處吸光值，繪制生長曲線。

1.10 Western blot

取添加8 μmol·L-1改造蛋清溶菌酶處理和未處理的供試菌菌液各1 mL轉(zhuǎn)移至離心管中，8 000 r·min-13 min低溫離心，分別收集上清和菌體，菌體經(jīng)無菌水洗滌3次后超聲破碎，分別取菌液上清和菌體超聲破碎液各20 μL，加入4 μL的5×上樣緩沖液，沸水中蛋白質(zhì)變性10 min，取10 μL樣品進(jìn)行12%聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。待條帶分離后轉(zhuǎn)印到活化的PVDF膜上，5%脫脂奶粉37 ℃封閉1 h，Lysozyme多克隆抗體(1∶2 000) 4 ℃孵育過夜，山羊抗兔IgG/辣根酶標(biāo)記二抗(1∶6 000) 37 ℃孵育1 h，采用DAB顯色法進(jìn)行顯色，并采集圖像。

A.未改造蛋清溶菌酶; B.改造蛋清溶菌酶; C.凍干處理的改造蛋清溶菌酶A. Unmodified egg-white lysozyme; B. Modified egg-white lysozyme; C. Modified egg-white lysozyme after lyophilization圖1 改造前后蛋清溶菌酶形態(tài)觀察(10.5萬×)Fig.1 Morphological observation of hen egg-white lysozyme before and after modification (105 000×)

2 結(jié) 果

2.1 改造后蛋清溶菌酶的形態(tài)學(xué)改變

透射電鏡下觀察顯示改造前蛋清溶菌酶為球形結(jié)構(gòu)(圖1 A)，改造后，蛋清溶菌酶超微結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯改變，形成了大量短桿狀纖維聚集體，且呈現(xiàn)中空結(jié)構(gòu)(圖1 B)，改造蛋清溶菌酶經(jīng)凍干處理前后超微結(jié)構(gòu)未發(fā)生改變(圖1 C)。

2.2 疏水性和二級(jí)結(jié)構(gòu)變化

ANS能夠與蛋白質(zhì)的疏水區(qū)域結(jié)合，在蛋白質(zhì)變構(gòu)過程中疏水區(qū)域暴露程度越高熒光強(qiáng)度越強(qiáng)。改造后蛋清溶菌酶疏水性較改造前增強(qiáng)，說明改造后蛋清溶菌酶中疏水性氨基酸或基團(tuán)暴露，如圖2 A所示。未改造前蛋清溶菌酶二級(jí)結(jié)構(gòu)以α螺旋為主，改造后蛋清溶菌酶二級(jí)結(jié)構(gòu)以β折疊為主(圖2 B)，且經(jīng)BeStSel軟件預(yù)測分析未改造蛋清溶菌酶的β折疊含量為5.9%，改造蛋清溶菌酶的β折疊含量為37.6%，提高了31.7%，而α螺旋含量從42.9% 降到了改造后的7.7%，β轉(zhuǎn)角含量從6.7%提高至11.5%，無規(guī)則卷曲含量下降了1.1%(表1)。

圖2 蛋清溶菌酶改造前后疏水性及二級(jí)結(jié)構(gòu)變化Fig.2 Changes in hydrophobicity and secondary structure of hen egg-white lysozyme before and after modification

表1 二級(jí)結(jié)構(gòu)含量變化

2.3 改造蛋清溶菌酶抑菌效果分析

衛(wèi)生部2002年版《消毒技術(shù)規(guī)范》指出，牛津杯法抑菌圈直徑大于10 mm的結(jié)果判定為有抑菌效果。與此規(guī)范對(duì)比，改造蛋清溶菌酶對(duì)革蘭陽性菌和革蘭陰性菌有明顯的抑菌作用，且抑菌能力隨著改造蛋清溶菌酶濃度增加而增強(qiáng)。不同濃度改造蛋清溶菌酶對(duì)于供試菌的抑菌能力為鰻弧菌>枯草芽胞桿菌>金黃色葡萄球菌>大腸桿菌，而未經(jīng)改造的蛋清溶菌酶對(duì)4種供試菌均未表現(xiàn)出抑菌能力(表2)。當(dāng)改造蛋清溶菌酶濃度為100 μmol·L-1時(shí)，抑菌圈直徑分別為11.1、11.0、9.6和9.8 mm；濃度為500 μmol·L-1時(shí)，抑菌圈直徑分別為17.8、15.6、13.8和12.4 mm；濃度為1 000 μmol·L-1時(shí)，抑菌圈直徑分別為20.7、17.3、16.0和14.1 mm。結(jié)果顯示，在一定濃度范圍內(nèi)，改造蛋清溶菌酶對(duì)鰻弧菌的抑菌作用最強(qiáng)，且抑菌效果隨改造蛋清溶菌酶濃度增加而增強(qiáng)。

表2 不同濃度的改造溶菌酶淀粉樣纖維樣對(duì)各菌種的抑菌圈直徑

2.4 生長曲線測定

結(jié)果見圖3，以培養(yǎng)基中未添加改造蛋清溶菌酶的大腸桿菌、鰻弧菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽胞桿菌的生長曲線為對(duì)照，與對(duì)照組相比，6 μmol·L-1改造蛋清溶菌酶可以有效抑制大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽胞桿菌的生長，8 μmol·L-1改造蛋清溶菌酶可以有效抑制鰻弧菌。此外，本研究發(fā)現(xiàn)4 μmol·L-1改造蛋清溶菌酶使金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的延遲期延長120 min后，生長速度逐漸恢復(fù)。結(jié)果表明改造蛋清溶菌酶在0～10 μmol·L-1濃度，對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽胞桿菌的最小抑菌濃度均為6 μmol·L-1，對(duì)鰻弧菌的最小抑菌濃度為8 μmol·L-1，而抑菌圈測定結(jié)果中同一濃度改造蛋清溶菌酶對(duì)鰻弧菌的抑菌圈直徑最大，這可能與菌種能否自身表達(dá)溶菌酶有關(guān)。

2.5 溶菌酶含量變化

采用Western blot法探討改造蛋清溶菌酶在抑菌過程中的作用。Western blot檢測發(fā)現(xiàn)天然蛋清溶菌酶分子量為14.3 ku，改造蛋清溶菌酶在14.3 ku處有單一條帶(結(jié)果未顯示)。改造蛋清溶菌酶作用后均于4種菌菌體中檢測到了分子量約為10 ku的條帶，而未經(jīng)改造蛋清溶菌酶作用則均未檢測到此條帶，表明改造蛋清溶菌酶在抑菌過程中被降解為分子量較小的蛋白質(zhì)，或可能與改造蛋清溶菌酶與細(xì)菌細(xì)胞壁的連接導(dǎo)致部分氨基酸丟失有關(guān)。對(duì)于大腸桿菌菌體，改造蛋清溶菌酶作用前后均在14.3和22 ku附近檢測出微弱條帶，且含量無變化，表明此條帶為大腸桿菌自身表達(dá)的溶菌酶；對(duì)于鰻弧菌菌體，僅在作用后檢測出10 ku條帶；對(duì)于金黃色葡萄球菌和枯草芽胞桿菌菌體，改造蛋清溶菌酶作用前后均在14.3、22和28 ku附近檢測到一定的溶菌酶表達(dá)，且作用后在22 ku附近的溶菌酶表達(dá)量明顯增加，在14.3 ku處的溶菌酶表達(dá)量增加微弱(圖4 A)，這說明抑菌過程中改造蛋清溶菌酶與菌體中的蛋白發(fā)生了結(jié)合作用。改造蛋清溶菌酶作用后的供試菌上清中均在分子量為14.3 ku處檢測出單一的目標(biāo)條帶，而在未作用的供試菌上清中無此條帶(圖4 B)，說明上清中存在的改造蛋清溶菌酶未參與抑菌過程，證明了試驗(yàn)結(jié)果的可靠性。

圖3 4種供試菌種的生長曲線測定Fig.3 Growth curve determination of the four strains

A.菌體破碎液，B.菌液上清。M.蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1、3、5、7依次為未添加改造蛋清溶菌酶大腸桿菌、鰻弧菌、枯草芽胞桿菌、金黃色葡萄球菌；2、4、6、8依次為添加改造蛋清溶菌酶的大腸桿菌、鰻弧菌、枯草芽胞桿菌、金黃色葡萄球菌A is the crushed bacterial cellsliquid, B is the bacterial supernatant. M.Marker; 1, 3, 5 and 7 are Escherichia coli, Vibrio anguillarum, Bacillus subtilis and Staphylococcus aureus without modified hen egg-white lysozyme; 2, 4, 6, 8 are Escherichia coli, Vibrio anguillarum, Bacillus subtilis and Staphylococcus aureus added with modified hen egg-white lysozyme圖4 菌體與菌液中溶菌酶含量檢測Fig.4 Detection of lysozyme contents in bacteria cells and bacteria supernatant

3 討 論

大腸桿菌、金黃色葡萄球菌廣泛分布于環(huán)境中，是引起畜禽感染的主要病原菌[19]，鰻弧菌可引起魚、蝦和貝類的死亡，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成了重大經(jīng)濟(jì)損失[20]，枯草芽胞桿菌雖然作為有益菌被應(yīng)用于動(dòng)物養(yǎng)殖和水產(chǎn)養(yǎng)殖等方面，但存在起效慢、作用對(duì)象單一的缺點(diǎn)[21]。

本研究證明高溫57 ℃、酸性 pH 2.0條件可以改造蛋清溶菌酶，且改造蛋清溶菌酶的疏水性增強(qiáng)，二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，β折疊含量提高31.7%，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)從球形結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變成為短桿狀、具中空結(jié)構(gòu)的纖維，且這種纖維能夠有效抑制大腸桿菌、鰻弧菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽胞桿菌的生長。本研究得到的纖維樣聚集體與Mahdavimehr等[15]研究形成的蛋清溶菌酶淀粉樣纖維超微結(jié)構(gòu)一致，且Huang等[22]證實(shí)蛋清溶菌酶淀粉樣纖維對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞具有細(xì)胞毒性。抑菌活性與蛋白質(zhì)的疏水性和二級(jí)結(jié)構(gòu)有關(guān)，疏水性提高使多肽更易插入細(xì)胞膜的脂質(zhì)雙層中，更好地發(fā)揮抑菌活性[7,10,23]。本研究證實(shí)改造蛋清溶菌酶的疏水性增強(qiáng)及β折疊含量提高對(duì)于蛋清溶菌酶抑菌活性的提高具重要意義。革蘭陽性菌具有20～30層肽聚糖結(jié)構(gòu)，蛋清溶菌酶抑菌機(jī)理是通過水解N-乙酰胞壁酸和N-乙酰葡萄糖胺之間的β-1,4糖苷鍵，破壞細(xì)菌細(xì)胞壁的肽聚糖，導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞壁逐漸瓦解，內(nèi)容物外流，從而導(dǎo)致菌體死亡[24-25]，而金黃色葡萄球菌細(xì)胞壁的胞壁酸第6位發(fā)生O-乙酰化，且細(xì)胞壁的四縮氨酸幾乎全部通過戊氨基乙酸進(jìn)行交聯(lián)，形成高密度的網(wǎng)孔結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致天然蛋清溶菌酶無法直接分解金黃色葡萄球菌[26]。經(jīng)高溫、酸性條件改造的蛋清溶菌酶與革蘭陽性菌金黃色葡萄球菌和枯草芽胞桿菌作用后，菌體中22 ku附近的溶菌酶表達(dá)量明顯增加，推測是由于改造蛋清溶菌酶的疏水性基團(tuán)暴露，二級(jí)結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變，部分氨基酸進(jìn)入菌體內(nèi)部并與菌體中某些蛋白質(zhì)發(fā)生結(jié)合作用，致使產(chǎn)生分子量約22 ku的新蛋白質(zhì)，這一結(jié)果與Ercan和Demirci[27]研究發(fā)現(xiàn)的蛋清溶菌酶能夠滲透細(xì)胞壁進(jìn)入革蘭陽性菌菌體內(nèi)部，并與菌體中部分蛋白質(zhì)發(fā)生結(jié)合，致使菌體內(nèi)部結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，最終導(dǎo)致細(xì)菌死亡的結(jié)果一致；而改造蛋清溶菌酶自身因氨基酸丟失，分子質(zhì)量減小，因此，在10 ku處出現(xiàn)蛋白條帶，這一結(jié)果與Ibrahim等[28]發(fā)現(xiàn)的溶菌酶抗菌作用與其結(jié)構(gòu)相關(guān)一致，且Mine等[29]研究也證明了溶菌酶水解形成的多肽能夠抑制金黃色葡萄球菌的生長(多肽序列為His-Gly-Leu-Asp-Asn-Tyr-Arg)。

革蘭陰性細(xì)菌細(xì)胞壁外膜上的脂多糖對(duì)蛋清溶菌酶有很強(qiáng)的親和性，能夠阻止溶菌酶的滲透，使蛋清溶菌酶不能分解革蘭陰性菌。本研究中高溫、酸性改造蛋清溶菌酶對(duì)革蘭陰性菌大腸桿菌和鰻弧菌均表現(xiàn)出了顯著的抑菌活性。改造蛋清溶菌酶的抑菌機(jī)制可能是通過溶解革蘭陰性菌的脂多糖，破壞細(xì)菌外膜，內(nèi)容物外流，最終導(dǎo)致細(xì)菌死亡。Derde等[30]研究發(fā)現(xiàn)，熱改性蛋清溶菌酶對(duì)大腸桿菌的外膜具有破壞作用，Pellegrini等[31]研究發(fā)現(xiàn)，80 ℃、pH 6.0處理的蛋清溶菌酶與脂多糖親和力增強(qiáng)，進(jìn)而抑制大腸桿菌菌落形成。改造蛋清溶菌酶與革蘭陰性菌作用后，大腸桿菌自身表達(dá)的溶菌酶含量未改變，而蛋清溶菌酶分子質(zhì)量減小為10 ku，主要原因可能是改造蛋清溶菌酶在抑菌過程中被水解為分子量較小的蛋白質(zhì)，這一推測與Yoshinori等[29]研究發(fā)現(xiàn)溶菌酶水解形成的多肽(多肽序列為Ile-Val-Ser-Asp-Gly-Asp-Gly-Met-Asn-Ala-Trp)能夠抑制大腸桿菌生長的結(jié)果相似。

4 結(jié) 論

蛋清溶菌酶經(jīng) (57±0.1) ℃、酸性pH 2.0改造后得到短桿狀纖維，且疏水性增強(qiáng)，二級(jí)結(jié)構(gòu)中β折疊含量提高31.7%。改造蛋清溶菌酶抑菌效果顯著增強(qiáng)，不僅能夠顯著抑制革蘭陽性菌金黃色葡萄球菌和枯草芽胞桿菌的生長，對(duì)革蘭陰性菌大腸桿菌和鰻弧菌效果也顯著，這為改造蛋清溶菌酶在畜牧業(yè)中的應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)與參考。然而改造蛋清溶菌酶與革蘭陽性菌和革蘭陰性菌相互作用的具體機(jī)制有待進(jìn)一步探索。