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    雙組分系統(tǒng)CpxR影響禽致病性大腸桿菌的耐藥性、抗血清殺菌能力及毒力

    2021-04-27 11:47:52易正飛張耀東陶程琳AFAYIBODossJeanAptre祁晶晶田明星于圣青王少輝
    畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào) 2021年4期
    關(guān)鍵詞:卡那霉素米卡毒力

    易正飛,張耀東,王 瑤,2,朱 紅,陶程琳,3,AFAYIBO Dossêh Jean Aptre,李 濤,祁晶晶,田明星,丁 鏟,于圣青*,王少輝*

    (1. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所,上海 200241; 2.西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,成都 610041; 3.揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院,揚(yáng)州 225009)

    禽致病性大腸桿菌(avian pathogenicE.coli,APEC)可感染禽類,表現(xiàn)多種不同癥狀的大腸桿菌病,給養(yǎng)禽業(yè)造成重大經(jīng)濟(jì)損失。另外,APEC屬于腸道外致病性大腸桿菌(extraintestinal pathogenicE.coli, ExPEC),與人源ExPEC中新生兒腦膜炎大腸桿菌(neonatal meningitisE.coli, NMEC)和尿道致病性大腸桿菌(uropathogenicE.coli, UPEC)的基因組結(jié)構(gòu)、遺傳進(jìn)化和生態(tài)分布高度相似,且具有類似的毒力因子和致病機(jī)制[1-3]。由于抗生素的不合理使用,APEC的耐藥性日趨嚴(yán)重。因此,APEC被認(rèn)為是人源ExPEC毒力基因和耐藥基因的貯庫(kù),具有重要的公共衛(wèi)生意義[4]。

    病原菌通過復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)控制基因適時(shí)表達(dá),從而適應(yīng)環(huán)境、促進(jìn)生存及感染。其中,雙組分系統(tǒng)(two component system, TCS)廣泛存在于細(xì)菌中并參與感知響應(yīng)環(huán)境變化及促進(jìn)致病性。典型的TCS通常包含位于細(xì)菌膜的組氨酸激酶(histidine kinase, HK)感受元件和存在于細(xì)胞質(zhì)中的應(yīng)答調(diào)控(response regulator, RR)元件兩部分[5]。另外,一些TCS還含有額外的調(diào)控輔助蛋白,在蛋白磷酸化等過程發(fā)揮作用。HK感受元件能夠感應(yīng)各種環(huán)境信號(hào)變化,然后通過磷酸化激活RR并調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá),從而改變細(xì)菌能量代謝、壓力應(yīng)激等以適應(yīng)環(huán)境[6-9]。CpxA/CpxR是典型的TCS,其中,組氨酸蛋白激酶CpxA作為感受元件將外界信號(hào)傳遞給CpxR發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能[10]。Cpx最早被證實(shí)主要在維持細(xì)菌膜結(jié)構(gòu)蛋白的正確折疊和組裝過程中發(fā)揮作用[11]。近年來,研究發(fā)現(xiàn)Cpx TCS可以感知細(xì)菌膜表面壓力變化信號(hào),調(diào)控細(xì)菌的多種毒力因子,如菌毛、分泌系統(tǒng),從而有助于細(xì)菌快速適應(yīng)環(huán)境,進(jìn)而參與調(diào)控不同細(xì)菌的耐藥性、抵抗力和毒力[12-15]。

    為了探討Cpx TCS的應(yīng)答調(diào)控元件CpxR對(duì)APEC生物學(xué)特性和毒力的影響,本文構(gòu)建了Cpx TCS應(yīng)答調(diào)控元件編碼基因cpxR缺失株和基因互補(bǔ)株,比較分析了APEC菌株的生長(zhǎng)速度、運(yùn)動(dòng)能力、生物被膜形成能力、藥物敏感性和抗血清殺菌能力和毒力,為深入研究APEC的致病機(jī)制提供參考。

    1 材料與方法

    1.1 菌株、質(zhì)粒和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

    O2血清型APEC菌株DE719由本實(shí)驗(yàn)室分離鑒定,對(duì)雞、鴨及小鼠具有致病性[16];大腸桿菌DH5α購(gòu)自天根(北京)生化科技有限公司。Red同源重組系統(tǒng)質(zhì)粒pKD46、pKD3、pCP20由本實(shí)驗(yàn)室保存;低拷貝互補(bǔ)質(zhì)粒pSTV28購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司。1日齡櫻桃谷鴨購(gòu)自江蘇省江陰市某養(yǎng)鴨合作社。

    1.2 主要試劑與儀器

    質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自天根(北京)生化科技有限公司;PrimeSTAR Mix、DNA Ligation Mix、限制性核酸內(nèi)切酶購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司;DNA Marker購(gòu)自諾維贊生物科技有限公司;L-阿拉伯糖購(gòu)自Sigma公司;DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自Gibco公司。PCR儀購(gòu)自ABI公司;電轉(zhuǎn)化儀購(gòu)自Bio-Rad公司;電泳儀及凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自上海天能科技有限公司。

    1.3 引物設(shè)計(jì)

    根據(jù)APEC DE719菌株cpxR及其上下游基因序列,設(shè)計(jì)cpxR基因缺失引物、鑒定引物及互補(bǔ)引物(表1),由上海睿勉生物科技有限公司合成。

    表1 本研究使用的引物

    1.4 cpxR基因缺失株及互補(bǔ)株的構(gòu)建

    根據(jù)Red同源重組系統(tǒng)方法[17],構(gòu)建DE719菌株的cpxR基因缺失株。以pKD3質(zhì)粒為模板,cpxRMu-F/R為引物,擴(kuò)增cpxR基因打靶片段。將cpxR基因打靶片段電轉(zhuǎn)化入DE719-pKD46感受態(tài)細(xì)胞,過夜培養(yǎng)后挑取單克隆,分別以缺失鑒定引物進(jìn)行PCR及測(cè)序鑒定cpxR基因缺失株。然后通過輔助性質(zhì)粒pCP20去除氯霉素抗性片段,鑒定正確的cpxR基因缺失株,命名為ΔcpxR。PCR擴(kuò)增cpxR基因及其啟動(dòng)子序列,克隆至pSTV28構(gòu)建互補(bǔ)質(zhì)粒pSTV28-cpxR,電轉(zhuǎn)化入缺失株ΔcpxR中,獲得互補(bǔ)株CΔcpxR。

    1.5 生長(zhǎng)曲線與運(yùn)動(dòng)性測(cè)定

    將新鮮菌液DE719、ΔcpxR、CΔcpxR培養(yǎng)至OD600 nm=1,按照1∶100的比例接種至200 mL LB培養(yǎng)基中,置于37 ℃,200 r·min-1條件下振蕩培養(yǎng),每隔1 h取樣測(cè)定OD600 nm值,繪制生長(zhǎng)曲線。將上述菌株培養(yǎng)至OD600 nm=1,取5 μL菌液點(diǎn)樣于0.5%瓊脂LB平板,37 ℃靜置培養(yǎng)12 h,測(cè)定菌圈直徑,比較不同菌株的運(yùn)動(dòng)能力。

    1.6 生物被膜形成能力測(cè)定

    將新鮮菌液稀釋至OD600 nm=0.1,每孔200 μL加入到96孔細(xì)胞板中,LB培養(yǎng)基作為陰性對(duì)照,37 ℃ 靜止培養(yǎng)24 h。棄去培養(yǎng)液,用無(wú)菌PBS洗3次 后加入200 μL結(jié)晶紫溶液染色30 min,再以無(wú)菌PBS洗滌5次,自然風(fēng)干后加入200 μL 95%乙醇充分溶解,測(cè)定OD595 nm值。

    1.7 最小抑菌濃度(MIC)測(cè)定

    研究表明,Cpx TCS有助于尿道致病性大腸桿菌、沙門菌對(duì)卡那霉素和阿米卡星的耐受性[13, 15, 18-19]。因此,本研究根據(jù)CLSI-2018微量肉湯稀釋法[20],分析APEC對(duì)卡那霉素和阿米卡星的最小抑菌濃度。將新鮮菌液1∶100倍稀釋,與不同濃度抗生素混勻,37 ℃培養(yǎng)16 h后判讀結(jié)果。同時(shí)設(shè)置不添加抗生素的陽(yáng)性對(duì)照組和LB空白對(duì)照組。

    1.8 血清殺菌試驗(yàn)

    以預(yù)冷PBS洗滌新鮮菌液并重懸,調(diào)整濃度為108CFU·mL-1,取10 μL菌懸液與190 μL不同濃度SPF雞血清(100%、50%、25%)混合,對(duì)照組為熱滅活SPF雞血清。37 ℃孵育30 min后倍比稀釋,涂布LB平板,統(tǒng)計(jì)存活細(xì)菌數(shù)。

    1.9 半數(shù)致死量(LD50)測(cè)定

    收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)菌,無(wú)菌PBS洗滌2次,重懸。分別以1×107、1×106、1×105、1×104、1×103CFU·只-1劑量感染7日齡櫻桃谷鴨,每組8只, 連續(xù)觀察7 d,記錄發(fā)病及死亡情況,根據(jù)改良寇氏法計(jì)算半數(shù)致死量(LD50)。

    2 結(jié) 果

    2.1 cpxR 基因缺失株及互補(bǔ)株鑒定

    分別以缺失株內(nèi)側(cè)鑒定引物和外側(cè)鑒定引物對(duì)cpxR基因缺失株、互補(bǔ)株進(jìn)行PCR檢測(cè)。如圖1所示,內(nèi)側(cè)引物鑒定時(shí),野生株和互補(bǔ)株可擴(kuò)增出458 bp的cpxR基因目的條帶,而缺失株無(wú)cpxR基因條帶;外側(cè)引物鑒定時(shí),野生株擴(kuò)增片段大小為1 032 bp,而cpxR基因缺失株、互補(bǔ)株擴(kuò)增片段大小為333 bp目的條帶。PCR檢測(cè)及測(cè)序結(jié)果表明,cpxR基因缺失株及互補(bǔ)株構(gòu)建成功。

    M. DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1、4. 野生株DE719;2、5. 缺失株ΔcpxR;3、6. 互補(bǔ)株CΔcpxRLane M. DNA marker; Lane 1, 4. Wild-type strain DE719; Lane 2, 5. Mutant strain ΔcpxR; Lane 3, 6. Complemented strain CΔcpxR圖1 野生株、缺失株和互補(bǔ)株的PCR鑒定Fig.1 Identification of wild-type, mutant and complemented strains

    2.2 生長(zhǎng)曲線與運(yùn)動(dòng)能力測(cè)定

    生長(zhǎng)曲線和運(yùn)動(dòng)能力測(cè)定結(jié)果顯示,DE719、ΔcpxR和CΔcpxR的生長(zhǎng)速度和運(yùn)動(dòng)性趨于一致,無(wú)明顯差異(圖2),表明CpxR不影響APEC的生長(zhǎng)速度和運(yùn)動(dòng)能力。

    A. 生長(zhǎng)曲線;B. 不同菌株在0.5%瓊脂上的運(yùn)動(dòng)直徑A. Growth curves; B. Motility diameter of each strains on 0.5% LB agar圖2 APEC生長(zhǎng)曲線和運(yùn)動(dòng)能力Fig.2 Growth curves and motility assays of APEC

    2.3 生物被膜形成能力

    生物被膜形成能力測(cè)定顯示,缺失株ΔcpxR的生物被膜形成能力略有下降,分別為野生株DE719、互補(bǔ)株CΔcpxR的91.5%和96.7%,但無(wú)顯著性差異(P>0.05,圖3),表明CpxR不影響APEC的生物被膜形成能力。

    2.4 藥物敏感性

    微量肉湯稀釋法結(jié)果顯示DE719、ΔcpxR和CΔcpxR對(duì)卡那霉素的MIC分別為30、20、50 μg·mL-1; 對(duì)阿米卡星的最小抑菌濃度分別為40、20、70 μg·mL-1(表2)。缺失株ΔcpxR對(duì)卡那霉素和阿米卡星的敏感性均高于野生株和互補(bǔ)株,表明CpxR有助于降低APEC對(duì)卡那霉素和阿米卡星的敏感性。

    圖3 生物被膜形成能力測(cè)定Fig.3 Determination of biofilm formation ability

    表2 APEC菌株的最小抑菌濃度

    2.5 抗血清殺菌能力

    血清殺菌試驗(yàn)結(jié)果顯示,缺失株ΔcpxR在100%、50%和25%SPF雞血清中存活率均顯著低于野生株(P<0.05),互補(bǔ)株的存活率恢復(fù)至野生株水平。APEC在滅活血清中的存活率均無(wú)明顯差異(圖4)。結(jié)果表明,CpxR促進(jìn)APEC的抗血清殺菌能力。

    圖4 抗SPF雞血清殺菌能力Fig.4 Resistance to bactericidal activities of SPF chicken serum

    2.6 半數(shù)致死量(LD50)測(cè)定

    雛鴨感染試驗(yàn)結(jié)果顯示,野生株DE719、缺失株ΔcpxR和互補(bǔ)株CΔcpxR的LD50分別為7.50×105、7.50×106、1.33×106CFU·只-1。與野生株相比,缺失株的毒力降低10倍,而互補(bǔ)株的致病力部分恢復(fù)。另外,作者前期研究發(fā)現(xiàn),缺失株ΔcpxR感染組的雛鴨發(fā)病及死亡慢,且其臨床癥狀、病理變化及組織載菌量均低于野生株和互補(bǔ)株感染組雛鴨[21],表明CpxR有助于APEC的感染及毒力。

    表3 禽致病性大腸桿菌的LD50測(cè)定

    3 討 論

    APEC不僅給養(yǎng)禽業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失,而且作為人類ExPEC的毒力基因及耐藥基因儲(chǔ)庫(kù),嚴(yán)重危害人類健康及公共衛(wèi)生安全[22-23]。在感染過程中,APEC需要通過復(fù)雜的調(diào)控系統(tǒng)控制基因適時(shí)表達(dá),從而抵御機(jī)體免疫和環(huán)境壓力的殺傷[13, 15]并致病。TCS廣泛存在于細(xì)菌中,其可以感應(yīng)外界環(huán)境變化,如養(yǎng)分、滲透壓力和抗生素等,通過雙組分蛋白的磷酸化和去磷酸化調(diào)節(jié)細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)途徑,從而調(diào)控細(xì)菌的生理代謝、壓力應(yīng)激、生物被膜及致病性等方面[5, 7, 9]。研究表明,Cpx TCS可以感知細(xì)菌膜表面壓力變化信號(hào),調(diào)控細(xì)菌的多種毒力因子適應(yīng)環(huán)境變化,有利于細(xì)菌的生存[24-26]。本研究發(fā)現(xiàn)CpxR不影響APEC的生長(zhǎng)速度、運(yùn)動(dòng)能力和生物被膜形成能力。吳同壘等[19]發(fā)現(xiàn)缺失cpxR基因不影響沙門菌的生長(zhǎng)速度。另外,在缺失株ΔcpxA中,高水平的磷酸化CpxR可能抑制鞭毛和運(yùn)動(dòng)基因的轉(zhuǎn)錄,而cpxR基因的缺失可能導(dǎo)致這種抑制作用消除,因而ΔcpxR缺失株與野生株相比在運(yùn)動(dòng)性和生物被膜形成能力無(wú)明顯差異[27]。

    沙門菌缺失cpxR基因后,對(duì)多種抗菌藥物的敏感性增加,其中,包括阿米卡星和卡那霉素[18-19]。本研究中,缺失cpxR基因?qū)е翧PEC DE719菌株對(duì)阿米卡星和卡那霉素的藥物敏感性增加,表明CpxR有利于APEC的耐藥性。TCS Cpx感知抗生素壓力信號(hào)后,調(diào)控病原菌外膜孔道蛋白和外排泵的表達(dá),增強(qiáng)抵御抗生素的殺傷,從而影響細(xì)菌對(duì)藥物的敏感性[28]。CpxR參與調(diào)控大腸桿菌對(duì)氨基糖苷類藥物的敏感性[12, 29],大腸桿菌的Cpx可影響外膜蛋白OmpC、OmpF及acrD的表達(dá)[12, 30],從而調(diào)控大腸桿菌對(duì)氨基糖苷類藥物阿米卡星和卡那霉素的敏感性。

    APEC在體內(nèi)定殖后,進(jìn)入血液循環(huán)引發(fā)全身性感染,從而引起家禽急性死亡,因此抗血清殺菌能力在其生存及致病過程中發(fā)揮重要作用。本研究發(fā)現(xiàn),CpxR有助于APEC在血清中的存活能力,與UPEC中CpxR的結(jié)果一致[15]。細(xì)菌可以利用細(xì)胞表面分子或分泌蛋白逃避補(bǔ)體系統(tǒng)的識(shí)別,從而抵抗血清的殺傷[31],但CpxR的抗血清殺菌機(jī)制還不明確。動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果顯示,cpxR基因缺失株對(duì)雛鴨的毒力下降約10倍,與其他菌種的CpxR功能相似[32]。其中,cpxR基因缺失株的抗血清殺菌能力降低是導(dǎo)致毒力下降的重要原因之一。另外,CpxR作為調(diào)控因子,通過磷酸化激活后可以結(jié)合至靶序列上調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá),從而參與細(xì)菌能量代謝、壓力應(yīng)激及毒力等。CpxR可以直接結(jié)合菌毛基因fimA啟動(dòng)子和Ⅵ型分泌系統(tǒng)2hcp2B操縱子序,調(diào)控菌毛和Ⅵ型分泌系統(tǒng)2的表達(dá),從而影響APEC的黏附、菌間競(jìng)爭(zhēng)能力及體內(nèi)定殖能力及毒力[21, 27]。

    總之,本文證實(shí)TCS CpxR在APEC對(duì)阿米卡星和卡那霉素的耐藥性、抗血清殺菌能力及毒力方面發(fā)揮著重要作用,為進(jìn)一步研究APEC的環(huán)境適應(yīng)性及生存能力提供參考,并為篩選抗生素靶標(biāo)和防控大腸桿菌病提供新的思路。

    4 結(jié) 論

    缺失cpxR基因不影響禽致病性大腸桿菌(APEC)的生物被膜形成能力,但可導(dǎo)致APEC對(duì)阿米卡星和卡那霉素耐藥性降低;CpxR有助于APEC的抗血清殺菌能力;CpxR缺失顯著降低APEC的毒力。研究表明,Cpx雙組分系統(tǒng)中的CpxR在APEC耐藥性、抗血清殺菌能力及毒力方面發(fā)揮作用。

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