誘導(dǎo)多能干細胞在神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤治療中的研究進展

舒文靜 彭 軍△ 江高峰

1）武漢科技大學(xué)附屬天佑醫(yī)院，湖北 武漢430064 2）武漢科技大學(xué)附屬天佑醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心 腫瘤免疫治療研究所，湖北武漢430064

1 誘導(dǎo)多能干細胞簡介

干細胞具有無限生長、分裂的能力，在特定的信號和適當?shù)姆只瘲l件下，它們可以分化成具有特殊功能和性質(zhì)的不同譜系［1］。由于其獨特生物學(xué)性質(zhì)，干細胞在再生醫(yī)學(xué)及細胞治療領(lǐng)域有著很好的發(fā)展前景。但因免疫排斥及倫理學(xué)方面問題，干細胞的研究一直發(fā)展緩慢。2006 年TAKAHASHI 和YAMANAKA 等［2］通過逆轉(zhuǎn)錄病毒將Oct3／4、Sox2、K1f4 和c-Mvc（0SKA4）等4 種基因轉(zhuǎn)染小鼠成纖維細胞，成功獲得誘導(dǎo)多能干細胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）。至此，iPSC 技術(shù)首次出現(xiàn)在人們面前。不到1年，他們又將人皮膚成纖維細胞成功地重編程為iPSCs［3］，成功避免了ESCs研究所面臨的醫(yī)學(xué)倫理和免疫排斥問題，這在干細胞研究領(lǐng)域具有里程碑式的意義。到目前為止，研究人員已經(jīng)從多種體細胞（包括真皮成纖維細胞、脂肪細胞、造血干細胞和外周血單核細胞）建立了制備iPSCs的方法［4-9］。除利用病毒重編程iPSCs外，RNA病毒［10］、無病毒DNA［11］、RNA［12］、蛋白質(zhì)［13］和混合化合物［14］也被用來取代病毒，以增強iPSCs 的遺傳穩(wěn)定性和安全性［15］，此外還探索了改良的mRNA 編碼重編程因子［16］，以提高iPSCs 的生成效率，這些策略加強了人類iPSCs（human iPSCs，hiPSCs）在疾病研究和治療開發(fā)中的應(yīng)用。目前多種疾病模型已建立，如慢性骨髓瘤、白血病、黑色素瘤等，為深入理解疾病發(fā)病機制和藥物的篩選、監(jiān)測提供幫助。

2 iPSCs在神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤中的應(yīng)用

神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤仍是最難治療的腫瘤之一。在全身腫瘤導(dǎo)致的死亡中，中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤占第9位［17］。基于干細胞神經(jīng)元定向分化的方法為疾病建模和再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域提供了一個獨特的平臺［18］。利用模擬胚胎干細胞轉(zhuǎn)化為神經(jīng)干細胞（neural stem cells，NSCs）的策略［19］，可以將iPSCs 分化為NSCs。因此，基于iPSC 策略來制備患者特異性NSCs 可能是未來中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤治療的一個有價值的臨床工具。神經(jīng)干細胞固有腫瘤趨向性和跨越血腦屏障的能力，這使其能夠選擇性地靶向腫瘤部位。作為運輸工具，NSCs被設(shè)計成表達多種抗癌物質(zhì)，包括前藥激活酶、凋亡誘導(dǎo)劑、抗體和溶瘤病毒等［20-23］。NSCs可攜帶各種治療藥物并轉(zhuǎn)移至原發(fā)性或侵襲性腦腫瘤，顯著降低實體腫瘤體積，延長荷瘤小鼠的生存期［24-29］。隨著最近新臨床試驗的啟動，用細胞毒性NSC療法成功治療人類癌癥的潛力正在接近成為現(xiàn)實，從而推動神經(jīng)干細胞廣泛用于神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的治療，現(xiàn)將NSCs在神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤中的應(yīng)用進展總結(jié)于表1。

表1 NSCs在神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤中的應(yīng)用Table 1 Application of NSCs in nervous system tumors

2.1 神經(jīng)膠質(zhì)瘤 膠質(zhì)瘤是成人中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的原發(fā)性惡性腫瘤，世界衛(wèi)生組織根據(jù)惡性程度將其分為Ⅰ～Ⅳ級，其中膠質(zhì)母細胞瘤（glioma，GBM）被認為是Ⅳ級膠質(zhì)瘤，在所有類型的腦腫瘤中增殖和侵襲能力最高。目前GBM標準治療是手術(shù)切除聯(lián)合放射治療和化療［30］。幾十年來盡管出現(xiàn)了許多治療藥物，GBM的存活率并沒有明顯改善，這在很大程度上是由于癌癥的侵襲性和浸潤性及疾病的異質(zhì)性。為了改進GBM 的治療，許多研究探索了改善GBM 藥物治療的新策略。其中iPSC 來源的工程化細胞毒性NSCs是GBM治療最有前途的策略之一。

2.1.1 NSCs介導(dǎo)的酶/前藥治療：神經(jīng)干細胞可在腫瘤病灶內(nèi)釋放前藥活化酶，將非活性前藥轉(zhuǎn)化為腫瘤毒性效應(yīng)藥物。過去20年中，在50多種不同的酶/前藥組合中已有5種得以試驗以增強其功效［31］。（1）CD/5-FC療法將細胞毒性NSC治療GBM的領(lǐng)域首次推進到人體臨床試驗［32］。該試驗應(yīng)用NSC 系（HB1.F3），通過逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)表達CD（胞嘧啶脫氨酶）及亞克隆，CD將5-FC（5-氟胞嘧啶）轉(zhuǎn)化為5-FU（5-氟尿嘧啶）。該研究中在復(fù)發(fā)性高級別膠質(zhì)瘤患者腫瘤切除或活檢過程中采用CD-NSCs 顱內(nèi)灌注治療。試驗發(fā)現(xiàn)CD-NSCs 以5-FC 劑量依賴的方式在大腦局部產(chǎn)生5-FU，同時未發(fā)現(xiàn)由于CD-NSCs 引起的劑量限制毒性（DLT），結(jié)果證明了NSCs 靶向腦腫瘤和局部產(chǎn)生化療的初步安全性和概念驗證。該研究為基于NSC 的腦腫瘤治療的臨床試驗奠定了基礎(chǔ)。（2）NSCs 介導(dǎo)的羧酸酯酶（CE）/伊立替康（CPT-11）治療中，CE 可將前藥CPT-11 在腫瘤局部轉(zhuǎn)換成活性代謝物SN-38，SN-38 是一種有效的拓撲異構(gòu)酶Ⅰ抑制劑。最近關(guān)于該酶/前藥的臨床試驗已經(jīng)啟動（ClinicalTrials.gov 標識碼NCT02192359），主要探討靜脈注射伊立替康聯(lián)合表達羧化酯酶（CE）的人NSC 是否也適用于復(fù)發(fā)性GBM患者［33］。

2.1.2 NSCs 介導(dǎo)的溶瘤病毒治療：溶瘤病毒（oncolytic viruses，OV）治療是GBM的一種有前途的治療策略。到目前為止已有7種菌株在針對GBM治療的臨床試驗中進行了研究［33］。不同于傳統(tǒng)的減毒病毒，OVs 有可能在癌癥中有條件地復(fù)制細胞。這種復(fù)制最終導(dǎo)致腫瘤細胞溶解并釋放新病毒感染鄰近腫瘤細胞。OV 療法可以最大程度地殺滅腫瘤細胞。目前通過這種傳播方式，該治療方法已經(jīng)進入臨床試驗階段。針對新診斷的膠質(zhì)瘤患者，聯(lián)合傳遞腺病毒（crad-survivin-pk7）的NSC、替莫唑胺（TMZ）和放射治療的首次臨床試驗正在進行中（ClinicalTrials.gov identifier NCT03072143），主要目的是為了探討crad-survivin-pk7的安全及最大劑量［34］。

2.1.3 神經(jīng)干細胞介導(dǎo)的治療性蛋白的分泌：神經(jīng)干細胞可以通過整合載體進行轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而穩(wěn)定釋放抗癌蛋白，通過細胞間隙連接介導(dǎo)的“旁觀者效應(yīng)”誘發(fā)腫瘤細胞凋亡，但對正常細胞沒有影響，其中最常用的藥物是腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體（TRAIL）。EHTESHAM 等［35］采用NSCs-TRAIL 治療膠質(zhì)瘤模型小鼠，發(fā)現(xiàn)能夠有效地誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細胞凋亡，使模型小鼠腫瘤體積顯著減小，且對正常組織沒有毒性。另外體外研究發(fā)現(xiàn)，采用NSCs表達膜結(jié)合型TRAIL（NSCs-mTRAIL）與可溶型TRAIL相比更容易使U87 膠質(zhì)瘤細胞凋亡，而且蛋白酶體抑制劑硼替佐米能夠增強這種抗腫瘤作用，同時體內(nèi)研究也證明NSCs-mTRAIL 治療可顯著提高膠質(zhì)瘤模型小鼠的存活率，硼替佐米也能進一步改善小鼠的生存狀況［36］。

2.2 髓母細胞瘤 髓母細胞瘤（medulloblastoma，MB）是兒童最常見的原發(fā)性腦瘤［37］，MB 可分為5 個分子亞型，具有明顯的轉(zhuǎn)錄和表觀遺傳特征。標準的MB治療方法為放療和輔助多藥化療，繼而最大限度的手術(shù)切除［38］。這種療法的5 a 生存率為60%～70%，而且在部分亞型MB患兒中，MB的高侵襲性使得手術(shù)與放化療效果欠佳［39］。存活下來的兒童往往受到放療和化療延遲后果的影響，包括永久性神經(jīng)認知障礙、心理社會缺陷、發(fā)育遲緩和內(nèi)分泌缺陷等。NSCs固有的致瘤特性為MB的治療提供了一個前所未有的優(yōu)勢。由于NSCs能有效穿越血腦屏障，選擇性地將抗癌藥物靶向浸潤腫瘤細胞，可提高局部藥物濃度，同時降低對正常組織的毒性。細胞毒性NSCs 已成為治療MB 的一種有前途的方法。GUTOVA等［40］使用一個已建立的轉(zhuǎn)基因人類NSC系（HB1.F3.CD）將CE傳遞至小腦腫瘤病灶，使CPT-11局部轉(zhuǎn)化為SN-38。該研究探討了HB1.F3.CD NSC在腫瘤內(nèi)分布及臨床療效，實驗顯示同時接受NSCs和CPT-11 治療的實驗組小鼠的腫瘤生長速度較對照組明顯下降，CE/CPT-11 治療為進一步臨床應(yīng)用提供了參考數(shù)據(jù)。有研究人員［41］使用5 個不同MB分子亞群中的兩個細胞系（DAOY，D282）建立了第一個圖像引導(dǎo)下的MB切除/復(fù)發(fā)模型，對比術(shù)前MB小鼠發(fā)現(xiàn)，術(shù)后小鼠MB 生長速度及復(fù)發(fā)率明顯增快。同時利用患兒皮膚來源的iNSCs，將表達胸苷激酶的iNSCs注射到術(shù)后MB 小鼠手術(shù)腔內(nèi)，并給小鼠全身注射更昔洛韋（GCV），結(jié)果發(fā)現(xiàn)NSCs 遷移到MB，且顯著抑制了殘余MB體積的增長，使其存活增加了1 倍以上。這些發(fā)現(xiàn)首次證明腔內(nèi)NSC 治療可以有效地治療術(shù)后MB 小鼠。雖然這些研究表明NSC 在MB 治療中非常有效，但尚缺乏更多、更全面準確模擬手術(shù)切除后MB臨床模型，這限制了NSC在臨床治療中的進展［42］。

2.3 神經(jīng)母細胞瘤 神經(jīng)母細胞瘤（NB）是起源于交感神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤，是兒童最常見的顱外實體瘤，目前對這些患者的標準治療包括：（1）強化誘導(dǎo)化療；（2）清髓鞏固放化療和自體造血干細胞移植；（3）維甲酸與靶向免疫治療。由于其具有易復(fù)發(fā)、遠處轉(zhuǎn)移、產(chǎn)生耐藥性等特點，盡管進行了積極的綜合治療，預(yù)后仍不佳，5 a 總體生存率低于50%［43］。治療失敗主要發(fā)生在原發(fā)部位和轉(zhuǎn)移部位的微小殘留性疾?。∕RD），特別是轉(zhuǎn)移到骨和骨髓的部位，表明MRD是復(fù)發(fā)的一個重要原因。目前的強化化療劑量和放療方案可能處于抗腫瘤療效和患者耐受性的極限，而且鞏固后治療并不能根除許多患者的MRD。因此，迫切需要改進NB 的治療方法，以提高本病患兒的臨床結(jié)果。NSCs 為NB 的治療提供了一種可能。已有研究［44］證實表達兔羧酸酯酶（rCE）的NSCs 可分布于小鼠的多個NB 轉(zhuǎn)移部位，并使CPT-11 轉(zhuǎn)化為1 000 倍毒性的拓撲異構(gòu)酶-1抑制劑SN-38，產(chǎn)生顯著的治療功效。這些研究為繼續(xù)發(fā)展NSCs 介導(dǎo)的基因治療提供了依據(jù)。該研究接著利用表達改良人類CE（hCE1m6-NSCs）探索發(fā)揮最大療效的靜脈使用劑量及治療方案，藥代動力學(xué)結(jié)果證實人源性NB 細胞系對hCE1m6 和CPT-11 同時用藥的敏感性明顯高于單獨用藥。此外，與單獨藥物治療的小鼠相比，反復(fù)靜脈注射hCE1m6-NSCs 和CPT-11 的NB 小鼠腫瘤負荷率顯著降低。這些研究證實NSCs 介導(dǎo)的藥物治療可以改善NB小鼠的預(yù)后。

3 問題與展望

iPSC在破譯病因?qū)W和多種疾病的病理生理機制方面極大提高了我們的認識。用iPSC衍生的表型細胞治療一些嚴重的退化性疾病和器官損傷已進入臨床試驗，然而以iPSCs 為基礎(chǔ)的治療仍處于起步階段。到目前為止，大多數(shù)使用iPSCs細胞的疾病模型都集中在單基因引起的疾病。iPSCs 應(yīng)用于臨床仍然存在一些問題，一方面iPSC技術(shù)中的安全性、效率和誘導(dǎo)多能干細胞再分化機制等方面的問題，另一方面基因的不穩(wěn)定性、表觀遺傳異常和致瘤性的可能都將是iPSCs 技術(shù)面臨的困難。相信在不遠的未來，誘導(dǎo)多能干細胞技術(shù)定會在臨床實際應(yīng)用取得重大突破，為治療人類疾病帶來新希望。