黑木耳菌糠基質(zhì)下毛木耳細(xì)胞工程菌株的生殖生長

劉微，徐凡，楊超上，耿丹萌，張鐵軍，王謙

(1.河北大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河北 保定 071002；2.承德市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局 農(nóng)業(yè)環(huán)境保護(hù)監(jiān)測站，河北 承德 067000)

毛木耳[Auriculariapolytricha(Mont.) Sacc.][1]隸屬真菌界Eumycetes、真菌門Eumycophyta、擔(dān)子菌亞門Basidiomycotina、層菌綱Hymenomycetes、木耳目Auriculariales、木耳科Auriculariales、木耳屬Auricularia，是一種中高溫型食藥兼用蕈菌[2].毛木耳含有豐富的多糖，具有抗腫瘤[3]、抗凝血[4]、抗氧化[5]、降血脂[6]功能和免疫調(diào)節(jié)[7]活性.此外，每100 g袋栽毛木耳干品中含水分9.3 g、粗蛋白9.1 g、粗脂肪0.6 g、碳水化合物69.2 g、粗纖維9.7 g、灰分2.1 g.在灰分中含鈣145.0 mg、磷181.1 mg、鐵52.0 mg，還含有硫胺素、核黃素、抗壞血酸、胡蘿卜素等維生素，人體紅細(xì)胞中血色素的結(jié)構(gòu)物——鐵質(zhì)，毛木耳中含量比肉類高30多倍，鈣含量是肉類的25倍[8].

黑木耳菌糠是黑木耳采摘后廢棄的固體培養(yǎng)基質(zhì)，但仍具有豐富的營養(yǎng)價值，其粗蛋白和粗纖維的含量比平菇、香菇等其他一些常見的食用菌菌糠高[9]；黑木耳現(xiàn)在成為國內(nèi)栽培規(guī)模最大的品種，產(chǎn)業(yè)發(fā)展產(chǎn)生的菌糠成為隨之出現(xiàn)需要解決的問題，其資源化利用成為科技部、農(nóng)業(yè)農(nóng)村部引導(dǎo)的本領(lǐng)域重點(diǎn)研發(fā)方向之一；但是目前，黑木耳菌糠大部分被丟棄在田間地頭、河流兩岸，不但造成資源浪費(fèi)，還會造成環(huán)境污染[10].河北省黑木耳主產(chǎn)區(qū)多分布在貧困地區(qū)，其菌糠除帶來生態(tài)脅迫外，資源化開發(fā)也具有科技扶貧的社會效益；毛木耳恰恰可以發(fā)揮其分解能力好、抗逆性強(qiáng)的品種優(yōu)勢對黑木耳菌糠進(jìn)行生物降解，不僅有效地降低了面源污染，還從經(jīng)濟(jì)效益和社會效益方面，提供了新的發(fā)展思路與技術(shù)途徑.

育種是產(chǎn)業(yè)的核心工作，本單位采用ARTP誘變技術(shù)[11]選育出優(yōu)良毛木耳細(xì)胞工程菌株新河大SL205，已于2019年12月通過河北省科技成果第三方評價，其選育工作另文報(bào)道；在此，主要探討黑木耳菌糠資源化開發(fā)中毛木耳新河大SL205生殖生長的優(yōu)化利用創(chuàng)新技術(shù)，該創(chuàng)新已經(jīng)查新報(bào)告確認(rèn)；相關(guān)工作已經(jīng)在河北省相關(guān)貧困地區(qū)完成示范研究.

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 供試菌種及材料

供試菌株：毛木耳新河大SL205，河北大學(xué)食藥用真菌研究所保藏.

對照菌株：毛木耳3號，河北大學(xué)食藥用真菌研究所保藏.

供試材料：黑木耳菌糠，由河北省隆化縣德隆食用菌有限公司提供；雜木屑、棉籽皮、玉米芯、麩皮、石灰等市售.

1.2 供試培養(yǎng)基

PDA(potato dextrose agar)培養(yǎng)基：馬鈴薯20%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同)，葡萄糖2%，瓊脂2%，pH自然.

原種培養(yǎng)基：雜木屑40%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同)，棉籽皮20%，玉米芯20%，麩皮18%，石灰2%.

生殖生長培養(yǎng)基配方見表1.

表1 黑木耳菌糠培養(yǎng)基的5個配方處理

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 黑木耳菌糠、雜木屑、玉米芯營養(yǎng)成分的測定

2.1.1 全碳、全氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測定

采用重鉻酸鉀滴定法[12]測定全碳質(zhì)量分?jǐn)?shù)，采用凱氏定氮法[13]進(jìn)行全氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測定.

2.1.2 粗纖維、粗灰分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測定

采用酸堿洗滌法[14]進(jìn)行粗纖維質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測定，采用馬弗爐法[15]進(jìn)行粗灰分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測定.

2.2 供試菌株與對照菌株在黑木耳菌糠培養(yǎng)基上的品比

2.2.1 長速長勢對比

礦權(quán)范圍內(nèi)圈定70個金礦體，全部為盲礦體，根據(jù)礦石氧化程度分類，礦石類型全部為原生礦。巖性為黃鐵絹英巖化碎裂巖和黃鐵絹英巖化花崗質(zhì)碎裂巖，礦石結(jié)構(gòu)以自形—半自形晶粒狀結(jié)構(gòu)和碎裂結(jié)構(gòu)為主，其次為包含結(jié)構(gòu)，填隙結(jié)構(gòu)等。礦石構(gòu)造主要有浸染狀構(gòu)造、細(xì)脈狀構(gòu)造、塊狀構(gòu)造、條帶狀構(gòu)造和斑狀構(gòu)造等。礦石礦物成分由金屬礦物、非金屬礦物組成，其中金屬礦物主要有黃鐵礦、黃銅礦、方鉛礦、閃鋅礦、自然金、銀金礦等，非金屬礦物主要有石英、絹云母、長石、方解石等[8-10]，其中金礦物呈亮黃色，粒狀—不規(guī)則狀，粒徑一般在0.01～0.03mm，主要包含黃鐵礦或分布在黃鐵礦晶隙、裂隙脈石礦物粒間或脈石礦物中(圖5)。

黑木耳采耳結(jié)束后，菌絲潔白、無污染的黑木耳菌棒粉碎成小顆粒，經(jīng)陽光曬干后備用.

供試菌株與對照菌株各挑取長勢相同、大小接近的菌塊，在無菌環(huán)境下接種于黑木耳菌糠培養(yǎng)基的試管中，每株5個平行，3次重復(fù)，將接種后的試管做好標(biāo)記后放置于26 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待菌絲萌發(fā)長齊后開始劃線，每5 d劃線1次，觀察菌絲長速.

菌絲長速(mm/d)=菌絲生長長度/菌絲生長時間[16].

2.2.2 生物學(xué)效率對比

按表1培養(yǎng)基配方準(zhǔn)確稱取黑木耳菌糠培養(yǎng)基中各原料，混合后加水(以緊握原料沒有水滴下最為適宜)，攪拌均勻，待原材料充分吸水后等量裝入17 cm×32 cm×0.005 cm聚丙烯塑料袋中，每袋干料約450 g，121 ℃、高壓滅菌2.5 h.冷卻至室溫后，將菌袋取出置于無菌操作臺中，紫外照射30 min，無菌環(huán)境下進(jìn)行接種，將接種后的菌袋放于26 ℃、空氣相對濕度55%～65%條件下避光培養(yǎng)，當(dāng)菌絲全部滿袋現(xiàn)蕾后，轉(zhuǎn)移至溫度25～28 ℃、空氣相對濕度為80%～90%的出耳室內(nèi)進(jìn)行出耳管理.注意早晚各通風(fēng)1次，每次約40 min，當(dāng)耳片呈紫褐色，邊緣卷起，直徑達(dá)到10～14 cm時開始采耳，采收下來的子實(shí)體立即稱重并計(jì)算生物學(xué)效率.

生物學(xué)效率=(子實(shí)體鮮質(zhì)量/培養(yǎng)料干質(zhì)量)×100%[17].

2.3 生殖生長培養(yǎng)基配方篩選

生殖生長基料經(jīng)預(yù)處理后，按表1培養(yǎng)基配方稱重，后續(xù)過程同2.2.2.

3 結(jié)果與分析

3.1 黑木耳菌糠與雜木屑、玉米芯營養(yǎng)成分對比

3.1.1 全碳、全氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)對比

由表2可知，黑木耳菌糠全碳、全氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)均高于雜木屑、玉米芯，且與其他2種原料有顯著差異，說明黑木耳菌糠能夠滿足新河大SL205對碳源、氮源的需求.

表2 不同原料中全碳、全氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)對比

3.1.2 粗灰分質(zhì)量分?jǐn)?shù)對比

表3 不同原料中粗灰分質(zhì)量分?jǐn)?shù)對比

3.1.3 粗纖維質(zhì)量分?jǐn)?shù)對比

由表4可知，雜木屑中粗纖維質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高達(dá)55.68%，玉米芯中粗纖維的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為55.56%，而黑木耳菌糠中粗纖維的質(zhì)量分?jǐn)?shù)只有30.13%，與雜木屑、玉米芯有顯著性差異，所以在利用黑木耳菌糠的同時，需要添加一定比例的玉米芯和雜木屑，以補(bǔ)充黑木耳菌糠的不足.

表4 不同原料中粗纖維質(zhì)量分?jǐn)?shù)對比

3.2 不同配方下供試菌株菌絲生長情況

從表5可以看出，新河大SL205在添加不同比例黑木耳菌糠的培養(yǎng)基下，菌絲均可正常生長，但生長速率存在明顯的差異，在配方A、B與CK下菌絲潔白濃密，生長旺盛.其中配方B的菌絲生長速度最快，達(dá)7.26 mm/d，與其他配方相比呈極顯著性差異，因此使用配方B作為比較供試菌株新河大SL205和對照菌株生物學(xué)效率的配方.

表5 新河大SL205在不同黑木耳菌糠培養(yǎng)基中的菌絲長速

3.3 供試菌株與對照菌株在不同配方下生物學(xué)效率

由表6、7可以看出，同樣使用配方B，供試菌株新河大SL205生物學(xué)效率最高達(dá)126.29%；對照菌株毛木耳3號的生物學(xué)效率最高達(dá)113.39 %，呈顯著性差異.因此最終優(yōu)化得到適宜生殖生長的培養(yǎng)基配方是：黑木耳菌糠50%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同)、雜木屑30%、玉米芯10%、麩皮8%、石灰2%；研究也可以確定黑木耳菌糠的添加，有利于提高生物學(xué)效率，經(jīng)細(xì)胞工程育種得到的新河大SL205分解黑木耳菌糠能力優(yōu)于出發(fā)菌株.

表6 新河大SL205在不同黑木耳菌糠培養(yǎng)基中的生物學(xué)效率

表7 對照菌株毛木耳3號在不同黑木耳菌糠培養(yǎng)基中的生物學(xué)效率

4 結(jié)論與討論

研究確定了黑木耳菌糠可以作為毛木耳的主要生殖生長基料；細(xì)胞工程菌株新河大SL205與對照菌株相比對黑木耳菌糠更具有分解優(yōu)勢.通過新河大SL205在以黑木耳菌糠為主要基質(zhì)的培養(yǎng)基配方上的菌絲長速與生物學(xué)效率的對比實(shí)驗(yàn)，得到適宜配方：黑木耳菌糠50%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同)，雜木屑30%，玉米芯10%，麩皮8%，石灰2%.

黑木耳菌糠的添加量在50%時，供試菌株與對照菌株生物學(xué)效率均達(dá)到最高，隨著菌糠添加量逐漸增高，生物學(xué)效率反而逐漸降低，說明黑木耳菌糠的添加能夠在一定范圍內(nèi)提高生物學(xué)效率.因此，黑木耳菌糠作為毛木耳新河大SL205主要生殖生長基料，可以實(shí)現(xiàn)黑木耳菌糠的循環(huán)再利用，從而推動木耳類產(chǎn)業(yè)綠色可持續(xù)發(fā)展.本項(xiàng)研究表明：利用毛木耳對河北省貧困地區(qū)黑木耳主產(chǎn)區(qū)菌糠的資源化開發(fā)，是產(chǎn)業(yè)扶貧、生態(tài)農(nóng)業(yè)可以利用的技術(shù)途徑之一.