黃頂菊入侵不同時(shí)間對土壤微生物功能的影響

王妍，杜鄂巍，蒙彥良，孫建茹，桑曉玲，張風(fēng)娟

(河北大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河北 保定 071002)

外來入侵植物對土壤微生物的影響及其反饋在其定植和擴(kuò)散中起著重要作用[1].一方面，植物凋落物、根系分泌物等釋放到土壤，提供了豐富碳源，從而改變了土壤微生物的結(jié)構(gòu)和功能[2].如外來入侵植物銀荊(AcaciadealbataLink)入侵南非后，通過凋落物輸入碳和生物固氮等過程改變土壤養(yǎng)分，影響土壤微生物群落功能[3]；外來入侵植物北美矢車菊(CentaureacyanusL.)其根系通過分泌化感物質(zhì)，從而影響了土壤微生物群落[4].另一方面，土壤微生物將難以吸收利用的營養(yǎng)元素分解，加快物質(zhì)循環(huán)，有利于外來入侵植物的競爭生長[5-6].如蔥芥(Alliariapetiolata)可以提高入侵地土壤氮、磷、鈣等營養(yǎng)成分的含量，提高養(yǎng)分的吸收利用，形成對自身有利的土壤環(huán)境，實(shí)現(xiàn)成功入侵[7]；黃頂菊[Flaveriabidentis(L.) Kuntze]根系分泌物或根系周圍的土壤微生物有能力將土壤中難溶性磷轉(zhuǎn)化為可溶性磷[8].入侵植物對土壤微生物的影響在其競爭反饋中也發(fā)揮了重要的作用[9].于文清等[10]研究表明紫莖澤蘭(EupatoriumadenophorumSpreng.)入侵改變了土壤微生物群落，阻礙了當(dāng)?shù)刂参锏陌l(fā)育，卻提高了紫莖澤蘭的競爭能力.研究表明外來入侵植物鹽生草(HalogetonglomeratusL.)的土壤細(xì)菌功能多樣性高于本地植物[11]；陳學(xué)林等[12]發(fā)現(xiàn)隨著入侵程度的加劇, 改變了外來植物紅毛草(Rhynchelytrumrepens)土壤固氮菌群，提高了土壤微生物群落的豐富度指數(shù)和多樣性指數(shù).由此可以看出外來入侵植物可以影響土壤微生物功能.但是這些研究都主要集中在外來植物入侵后同一時(shí)間點(diǎn)或不同入侵程度，沒有考慮入侵時(shí)間對土壤微生物功能的持續(xù)作用.

入侵中國的惡性雜草黃頂菊[Flaveriabidentis(L.)Kunt]，原生長于南美洲巴西、阿根廷等國，隨后因強(qiáng)大的繁殖能力、生態(tài)適應(yīng)性和生長可塑性等自然原因和人為因素逐步擴(kuò)散到其他地區(qū).20世紀(jì)90年代末發(fā)現(xiàn)于中國天津,直至2018年，黃頂菊已入侵華北地區(qū)多地，發(fā)生面積超過2×104hm2，破壞了當(dāng)?shù)氐闹参锒鄻有院图Z食生產(chǎn)[13-14].近年來有研究表明黃頂菊改變了入侵地土壤中微生物群落的結(jié)構(gòu)，影響了土壤中與養(yǎng)分代謝相關(guān)的功能群落[15].如紀(jì)巧鳳[16]研究表明黃頂菊改變了入侵地土壤磷細(xì)菌群落，豐富了群落多樣性，優(yōu)勢菌群更加突出；Chen等[17]發(fā)現(xiàn)黃頂菊入侵的土壤中氮庫增加，磷庫尤其是有效磷減少.也有一些學(xué)者發(fā)現(xiàn)黃頂菊入侵地養(yǎng)分的改變與土壤微生物群落功能變化密切相關(guān).如趙曉紅[18]發(fā)現(xiàn)黃頂菊入侵后能通過改變根際土壤微生物的多樣性來提高對營養(yǎng)成分的吸收利用.而目前學(xué)者發(fā)現(xiàn)，隨著外來植物入侵時(shí)間發(fā)生變化，也改變了根際土壤微生物群落.如長興縣不同種植時(shí)間下毛竹林(Phyllostachysedulis)土壤化學(xué)性質(zhì)發(fā)生了變化，而隨著毛竹種植時(shí)間的延長，也影響了土壤中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)[19].但有關(guān)外來植物在不同定植時(shí)間下對土壤微生物功能的影響缺少相關(guān)報(bào)道.因此，本研究利用同質(zhì)園試驗(yàn)，選用黃頂菊及其常見伴生植物狗尾草為實(shí)驗(yàn)材料，研究分析不同定植時(shí)間植物根際土壤微生物對碳源的利用及功能多樣性的影響，探究外來入侵植物根際土壤微生物功能隨時(shí)間變化的規(guī)律，有助于進(jìn)一步揭示外來植物的入侵機(jī)制.

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)樣地

同質(zhì)園位于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院廊坊科研中試基地，氣候適宜植物生長，土壤類型為棕色砂質(zhì)黏壤土.2010年10月設(shè)立同質(zhì)園小區(qū)(4 m×3 m)，小區(qū)間設(shè)置1 m寬的隔離帶.共設(shè)黃頂菊單一種植小區(qū)(簡稱F)、本地植物狗尾草單一種植小區(qū)(簡稱S)和黃頂菊與本地植物混合種植小區(qū)(簡稱F+S)3個(gè)處理，同時(shí)設(shè)有空白對照(簡稱CK)，每個(gè)處理6個(gè)重復(fù)，5月中旬進(jìn)行播種，6月中旬間苗至每小區(qū)36棵植株，混種小區(qū)混種比例為1∶1.

1.2 根際土樣的采集和保存

分別于2014年10月、2016年10月和2018年10月收集樣地土樣，分別代表黃頂菊入侵后定植5年、7年、9年的土壤.在每個(gè)樣地中按對角線采集法隨機(jī)挑選發(fā)育比較好的5株植株的根際土壤，混合，并將混合后的土樣過直徑2 mm篩裝袋標(biāo)記，保存在-20 ℃冰箱中，備用.

1.3 Biolog測定

在超凈工作臺中用天平稱量10 g土樣置于無菌的250 mL錐形瓶中，加9 g/L的NaCl無菌水90 mL，用封口膜封口，用振蕩培養(yǎng)箱120 r/min培養(yǎng)0.5 h，取出后靜置3～5 min.取上清液5 mL于錐形瓶中，用無菌水稀釋1 000倍，靜置10 min后，用移液槍吸取150 μL稀釋溶液置于生態(tài)板孔，于28 ℃培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)10 d.每隔1 d在全波長掃描酶標(biāo)儀上在590 nm和750 nm處測得吸光值.

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

用Excel 2013軟件統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)作圖，用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析.

測定每個(gè)ECO板的平均顏色變化(average well color development，AWCD)，計(jì)算公式為

AWCD=∑[(C590-R590)-(C750-R750)]/31，

物種豐富度指數(shù)(H)計(jì)算公式為H=-∑Pi(lnPi)，

Pi計(jì)算公式為Pi=(Ci-Ri)/∑(Ci-Ri)，

Simpson優(yōu)勢度指數(shù)(D)計(jì)算公式為D=1-∑Pi×Pi，

式中,Ci表示第i個(gè)ECO板孔的吸光值，Ri表示第i個(gè)對照孔的吸光值，ni表示第i個(gè)孔，Pi表示第i個(gè)孔吸光值與整個(gè)平板相對吸光值總和的比率.

2 結(jié)果與分析

2.1 根際土壤微生物群落AWCD的動態(tài)變化

對定植不同時(shí)間(5年、7年、9年)黃頂菊和狗尾草根際土壤微生物進(jìn)行培養(yǎng)，從培養(yǎng)開始計(jì)時(shí)，每隔1 d測定Biolog-ECO板的AWCD值，得到的動態(tài)變化如圖1～3所示.由圖1可知，在1 d之前，4種植被類型的AWCD值都很低，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，AWCD值逐漸增大.CK處理的AWCD值最低，F(xiàn)+S處理的AWCD值最高，而F和S處理的AWCD值處于中間且依次增大.由圖2可以看出， CK處理最低，F(xiàn)處理次之，培養(yǎng)前5 d 的F+S處理的AWCD值高于S處理，5 d后F+S處理的AWCD值低于S處理.圖3顯示：CK處理的AWCD值最低，F(xiàn)+S處理的AWCD值最高，S處理和F處理的AWCD值依次增大.

圖1 定植5年不同處理土壤AWCDFig.1 AWCD of soil in different treatment at 5 years of colonization

圖2 定植7年不同處理土壤AWCDFig.2 AWCD of soil in different treatment at 7 years of colonization

圖3 定植9年不同處理土壤AWCDFig.3 AWCD of soil in different treatment at 9 years of colonization

總之，F(xiàn)+S處理利用碳源能力最高，說明黃頂菊與狗尾草的競爭生長對土壤微生物的代謝活性起促進(jìn)作用.

2.2 根際土壤微生物群落功能的多樣性指數(shù)分析

選取培養(yǎng)第8天的數(shù)據(jù)分析黃頂菊不同定植時(shí)間不同植物處理下的土壤微生物功能多樣性指數(shù)(表1).定植5年，豐富度指數(shù)H在這幾個(gè)處理之間無顯著差異，S處理的優(yōu)勢度指數(shù)D顯著高于F處理，F(xiàn)處理和F+S處理的均勻度指數(shù)U顯著高于其他處理.定植7年，S處理的H值顯著高于CK處理和F處理，CK處理的D值顯著小于其他處理，F(xiàn)處理和F+S處理的U值顯著高于其他處理.定植9年，CK處理的H值和D值顯著小于其他處理，F(xiàn)+S和S處理的U值顯著高于其他處理.

3個(gè)年份中F+S處理的H值沒有顯著差異，定植9年 F處理的D值顯著高于其他年份.F+S處理和S處理的U值定植9年顯著高于其他年份.F處理的U值隨著定植時(shí)間增加而減少，定植9年顯著低于S處理.

總之，該結(jié)果說明黃頂菊單種處理中，土壤微生物功能多樣性隨定植時(shí)間的增加而降低.而在黃頂菊與狗尾草混種中，土壤微生物功能多樣性隨定植時(shí)間的增加而增加.

表1 定植不同時(shí)間不同處理土壤微生物群落的多樣性分析(n=3)

不同大寫字母代表定植不同時(shí)間之間在P<0.05水平上存在顯著差異，不同小寫字母代表同一定植時(shí)間不同處理之間在P<0.05水平上存在顯著差異.下同.

2.3 根際土壤微生物對4類碳源的利用

選取第8天的數(shù)據(jù)分析土壤微生物利用4類碳源的能力(圖4).微生物對脂類、氨基酸類和糖類利用較多，而對其他碳源的利用較少.定植5年F處理的土壤微生物對脂類的利用能力高于其他處理；F+S處理的土壤微生物對糖類、氨基酸和其他碳源的利用能力顯著高于其他處理.定植7年F+S處理和S處理的土壤微生物對脂類的利用能力顯著高于其他處理；F+S處理的土壤微生物對糖類和其他碳源的利用能力顯著高于其他處理；F+S處理的土壤微生物對氨基酸的利用能力顯著高于CK處理和F處理.定植9年S處理的土壤微生物對脂類的利用顯著高于其他處理；F+S處理和S處理的土壤微生物對氨基酸的利用顯著高于其他處理.

定植5年CK處理的土壤微生物對這4類碳源的利用能力都顯著高于定植9年的.定植9年F+S處理、F處理和S處理的土壤微生物對脂類的利用顯著高于定植5年的.定植5年F處理和F+S處理的土壤微生物對糖類的利用顯著高于定植9年的.定植9年F處理的土壤微生物對其他碳源的利用在顯著高于其他年份.

總之，與其他處理相比，F(xiàn)+S處理促進(jìn)了土壤微生物對脂類、糖類和氨基酸的吸收，與其他定植年份相比，定植9年F+S處理的土壤微生物對脂類的利用能力顯著提高，對糖類利用能力顯著降低.

a.脂類;b.糖類;c.氨基酸;d.其他碳源.圖4 定植不同時(shí)間不同處理根際土壤微生物群落對4類碳源的利用情況Fig.4 Utilization of four carbon sources in rhizosphere soil microbial communities treated with different colonization time

3 討論

黃頂菊與狗尾草競爭生長提高了土壤微生物的代謝活性.本文結(jié)果顯示，定植5年AWCD變化規(guī)律為F+S處理>F處理>S處理>CK處理；定植7年AWCD變化規(guī)律為S處理>F+S處理>F處理>CK處理；定植9年AWCD變化規(guī)律為F+S處理>S處理>F處理>CK處理.總之，這3個(gè)年份AWCD變化規(guī)律都是F+S處理>F處理.較高的AWCD值說明土壤微生物群落存在較高的代謝活性[20].表明黃頂菊與狗尾草混種土壤中微生物類群的代謝活性較旺盛.趙紫檀等[21]研究發(fā)現(xiàn)紅樹林-互花米草混種土地的微生物功能多樣性和豐富度都要高于紅樹林單種群落和互花米草單種群落.侯曉杰等[22]的研究表明土壤有機(jī)碳、土壤碳氮比對土壤微生物的代謝活性影響較大.具有高代謝能力的土壤微生物對土壤中有機(jī)質(zhì)的利用增加[23]，驅(qū)動有機(jī)物的循環(huán)，并通過固定和礦化反應(yīng)調(diào)節(jié)植物養(yǎng)分的供應(yīng)[24]，進(jìn)而促進(jìn)入侵植物生長和擴(kuò)散[25].推測黃頂菊與狗尾草競爭生長通過促進(jìn)土壤微生物的代謝活性，提高對養(yǎng)分的利用吸收，從而實(shí)現(xiàn)成功入侵.

外來植物改變了入侵地的土壤微生物群落功能多樣性.豐富度指數(shù)H反映微生物群落多樣性，H值越高，其物種數(shù)量越多、分布越均勻.將豐富度指數(shù)H應(yīng)用于Biolog-ECO板時(shí)，微生物能夠利用的碳源種類越多，H值越大.本研究結(jié)果表明定植7年和9年的3個(gè)處理的豐富度指數(shù)均大于空白處理，而3個(gè)處理之間沒有差異性.說明黃頂菊入侵后沒有改變土壤微生物的豐富度.優(yōu)勢度指數(shù)D可以反映微生物群落優(yōu)勢度，D值越大，群落常見物種優(yōu)勢度越高，代表多樣性程度越低[26].將優(yōu)勢度指數(shù)D應(yīng)用于Biolog-ECO板，D值較高表示微生物能夠利用的碳源種類較單一，而D值越低則表示微生物能夠利用的碳源種類越多.由結(jié)果可知，隨著入侵時(shí)間的增加，F(xiàn)處理優(yōu)勢度指數(shù)D顯著增加.說明黃頂菊長期定植后優(yōu)勢土壤微生物種群種類集中，數(shù)量較大.表明隨著黃頂菊入侵時(shí)間的增加，入侵地土壤微生物功能的多樣性降低.均勻度指數(shù)U反映物種的變化度和差異度.群落的物種數(shù)越多、均勻度越高，U值越大.將均勻度指數(shù)U應(yīng)用于Biolog-ECO板，微生物能夠利用的碳源種類越多樣，U值越高.結(jié)果顯示，3個(gè)年份的F+S處理的均勻度指數(shù)U均高于F處理，并且在定植9年時(shí)顯著高于另2個(gè)年份.說明在F+S處理的土壤微生物群落分布更均勻，能夠利用的碳源種類更多樣.表明黃頂菊與狗尾草競爭生長的土壤微生物功能多樣性最高，并且這種多樣性與入侵時(shí)間呈正比.而F處理定植5年和7年均勻度指數(shù)U顯著高于S處理，然而隨著入侵時(shí)間的增加，均勻度指數(shù)U卻呈現(xiàn)下降趨勢，并在定植9年時(shí)顯著低于S處理.說明入侵時(shí)間越長黃頂菊單種的土壤微生物均勻度越差.表明隨入侵時(shí)間的增加，黃頂菊入侵降低了土壤微生物功能的多樣性.綜合3個(gè)多樣性指數(shù)，表明黃頂菊入侵后土壤微生物功能多樣性隨入侵時(shí)間的增加而降低.而在黃頂菊與狗尾草競爭生長時(shí)，提高了土壤微生物功能多樣性，并且隨入侵時(shí)間的增加而增加.Huangfu等[27]研究表明黃頂菊入侵顯著降低了土壤細(xì)菌群落的多樣性，其含量的下降與入侵程度呈正相關(guān).入侵植物通過影響土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和功能，打破了本地植物與微生物群落之間平衡共生的關(guān)系，影響當(dāng)?shù)匚锓N發(fā)育，從而促進(jìn)自身生長[28].牛紅榜等[29]表明紫莖澤蘭入侵后土壤微生物多樣性增加，與養(yǎng)分代謝有關(guān)的微生物的數(shù)量也明顯增多.區(qū)余端等[30]對土壤微生物功能多樣性與土壤養(yǎng)分之間關(guān)系的研究表明：土壤有機(jī)碳和全氮含量與土壤微生物群落功能多樣性呈顯著正相關(guān).因此，外來植物聚集優(yōu)勢微生物，改變其功能多樣性，獲得偏利生長，實(shí)現(xiàn)成功入侵.但是具體的這種微生物有利反饋途徑有待進(jìn)一步的研究.有學(xué)者發(fā)現(xiàn)入侵歷史較長的土壤微生物生物量和活性均高于入侵歷史較短的土壤[31]，土壤微生物可能會逐漸適應(yīng)土壤環(huán)境并積累，但是積累到一定程度后也會發(fā)生降解.因此可以解釋土壤微生物功能多樣性指數(shù)隨入侵時(shí)間的變化而改變.宋振等[32]等研究發(fā)現(xiàn)黃頂菊入侵后細(xì)菌多樣性升高，群落結(jié)構(gòu)更加復(fù)雜.這與本文結(jié)論不一致.推測由于他采用的是原生生態(tài)系統(tǒng)的土壤樣品，許多非生物環(huán)境因素的影響不可控制，因此本文采取同質(zhì)園試驗(yàn)，可以排除環(huán)境因素的干擾.

Biolog-ECO微平板的31種碳源可根據(jù)官能團(tuán)不同分成脂類、糖類、氨基酸類和其他四大類別.本文研究表明，與其他處理相比，F(xiàn)+S處理促進(jìn)了土壤微生物對脂類、糖類和氨基酸的吸收，與其他入侵年份相比，定植9年F+S處理土壤微生物對脂類的利用能力顯著增高，對糖類利用能力顯著降低.定植5年與7年之間無顯著差異.趙曉紅等[33]也發(fā)現(xiàn)黃頂菊入侵后顯著提高了對糖類、氨基酸類、羧酸類和聚合物的利用.糖類、氨基酸類和脂類是植物根系分泌物的主要成分，而不同植物物種根系分泌物的量與組成成分不同，被微生物利用程度也不同，根系周轉(zhuǎn)速率通常存在差異[34].因此黃頂菊入侵后會影響根系對土壤物質(zhì)的運(yùn)輸，從而改變土壤微生物群落功能.并且有研究表明，隨著入侵時(shí)間的延長，外來植物根系分泌的次生代謝物質(zhì)是可以累積的[35].然而當(dāng)各種代謝產(chǎn)物積累到一定量后, 土壤微生物會降解這些化感物質(zhì)[36]，從而減弱土壤微生物對碳源的利用能力.因此，本地與外來植物土壤微生物利用碳源成分存在差異，它們之間的競爭生長促進(jìn)了糖類、氨基酸類和脂類的吸收.而不同的入侵時(shí)間對各種碳源的影響有所不同.有關(guān)入侵時(shí)間對于不同碳源的利用機(jī)制還需進(jìn)一步探究.

綜上，黃頂菊的入侵改變了土壤微生物的功能，黃頂菊與狗尾草混種處理土壤微生物代謝活性高于黃頂菊單種處理，且混種處理土壤微生物均勻度指數(shù)均高于其他處理.隨著入侵時(shí)間的延長，土壤微生物功能多樣性的變化與種植方式有關(guān)：黃頂菊單種處理土壤微生物功能多樣性隨入侵時(shí)間的延長而降低，而黃頂菊與狗尾草混種處理土壤微生物功能多樣性隨入侵時(shí)間的延長而增加.