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    化瘀消癥復方對PI3K/Akt/mTOR信號通路及輸卵管妊娠滋養(yǎng)細胞的作用機制研究

    2021-04-26 00:54:56袁爍陳敏紅鄧高丕
    環(huán)球中醫(yī)藥 2021年4期
    關(guān)鍵詞:培養(yǎng)液輸卵管批號

    袁爍 陳敏紅 鄧高丕

    中醫(yī)認為輸卵管妊娠的發(fā)病機理與少腹素有瘀滯、沖任不暢、胞絡受阻、孕卵移行受到阻滯、不能順利進入胞宮有關(guān),故中醫(yī)對輸卵管妊娠的治療是以化瘀消癥殺胚為大法。宮外孕I號方(丹參、赤芍、桃仁)作為治療異位妊娠的方劑,從1956年開始應用于臨床[1]。研究團隊在宮外孕I號方的基礎(chǔ)上,加上了從現(xiàn)代藥理研究角度對滋養(yǎng)細胞具有抑制作用的紫草[2]、天花粉[3]組成化瘀消癥復方。在前期開展了一系列復方治療輸卵管妊娠的機制探索,結(jié)果發(fā)現(xiàn)化瘀消癥復方可通過誘導FAS/FASL、Bcl-2/Bax凋亡通路[4-5],促進相關(guān)蛋白的表達增加,而影響滋養(yǎng)細胞的凋亡程序;或通過對雌孕激素發(fā)揮拮抗作用[6],對溶解輸卵管蛻膜、引起絨毛及蛻膜組織的性質(zhì)改變產(chǎn)生干擾;或通過干預細胞周期進程,上調(diào)增殖抑制率[7];或呈濃度、時間依賴性地影響FAK信號通路表達,抑制滋養(yǎng)細胞遷移力[8],進而起到抑制滋養(yǎng)細胞活性,阻滯輸卵管妊娠進展的目的。本實驗基于前期研究基礎(chǔ),著眼于PI3K/Akt/mTOR 信號通路,旨在探索化瘀消癥復方對輸卵管妊娠滋養(yǎng)細胞凋亡、侵襲影響的調(diào)控機制。

    1 材料與方法

    1.1 試劑與儀器

    化瘀消癥復方由紫草、天花粉、赤芍、丹參、桃仁各15 g組成,藥物購自廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院藥學部;甲氨蝶呤(廣東嶺南制藥有限公司;批號:472004);LY294002(RE-Vectec;批號:WXBC0225V);雷帕霉素(rapamycin,Rapa)(RB-sigma;批號:92M4616V);胎牛血清(Biological Industries;批號:1435272);DMEM/F12培養(yǎng)基(Gibico;批號:8114362);0.25%胰蛋白酶(Gibico;批號:1616025);HBSS(1×)(Gibico;批號:C-0130);Hanks(10×)(Sigma;批號:RNBC1413);一抗p-AKT(R&D;批號:AF887);一抗p-雷帕霉素靶蛋白(mammalian taget of rapamycin,mTOR)(Cell Signaling;批號:2983S);Annexin V-FITC細胞凋亡試劑盒(上海貝博生物公司;批號:BB130031);Transwell板(Corning;批號:3422);Matrigel膠(Corning;批號:354277)。

    主要儀器:CO2培養(yǎng)箱:英國 NEW BRUNSWICK SCIENTIFIC 公司;低/高速離心機:科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司;細胞自動計數(shù)儀:美國 CELLOMETER 公司;全自動化學發(fā)光免疫分析儀:美國 Beckman 公司;脫色搖床:海門市其林貝爾公司;倒置熒光顯微鏡:日本 Nikon EclipseTi-s;流式細胞儀:美國 Beckman 公司。

    1.2 細胞培養(yǎng)

    手術(shù)中取輸卵管妊娠部位典型的絨毛組織,剪碎后進行體外培養(yǎng),差異貼壁法分離純化,傳代至第四代,進行細胞鑒定,細胞抗波形蛋白(Vimentin)陰性,抗角蛋白(Cytokeratin 18,CK18)陽性者為符合實驗要求的滋養(yǎng)細胞[9]。當細胞長滿25 cm2培養(yǎng)瓶底90%時傳代,用PBS清洗2次,加入1 mL 0.25%胰酶的消化液進行消化,37℃孵育3~5分鐘,鏡下觀察90%以上細胞懸浮,吸出細胞懸浮液置于15 mL離心管中800 r/min離心5分鐘,棄上清。用含10%胎牛血清的DMEM/F12重懸,按1∶2比例接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。

    1.3 化瘀消癥復方及各組培養(yǎng)液制備

    紫草、天花粉、赤芍、丹參、桃仁各15 g,取2 劑共150 g,加入8倍藥物體積純水,2次煮沸,過濾,將所得濾液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上減壓濃縮。將復方水煎劑溶于無血清的 DMEM/F12,過 0.22 μm 濾膜。配成低劑量組2.5 mg/mL、中劑量組5 mg/mL、中藥高劑量組10 mg/mL的無血清DMEM 培養(yǎng)液。將甲氨蝶呤溶于無血清的DMEM/F12,過0.22 μm濾膜,配制成濃度為1 mg/mL的無血清DMEM培養(yǎng)液。將LY294002[胞磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidy linositol 3-kinase,PI3K)抑制劑]溶于無血清的 DMEM/F12,過0.22 μm濾膜,配制成濃度100 μmol/mL的無血清 DMEM 培養(yǎng)液。 將LY294002(PI3K抑制劑)溶于無血清的 DMEM/F12,過0.22 μm 濾膜,配制成濃度100 μmol/mL的無血清DMEM培養(yǎng)液。將Rapa(mTOR抑制劑)溶于無血清的DMEM/F12,過0.22 μm濾膜,配制成濃度300 μmol/mL的無血清 DMEM 培養(yǎng)液。以上培養(yǎng)液配置后置于-20℃保存。

    1.4 分組與藥物干預方法

    將滋養(yǎng)細胞分為空白組、中藥低、中、高劑量組、LY294002組和Rapa組??瞻捉M:繼續(xù)予DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng);中藥低、中、高劑量組:分別以2.5 mg/mL、 5 mg/mL、10 mg/mL的無血清 DMEM 培養(yǎng)液培養(yǎng);西藥組:以甲氨蝶呤濃度為 1 mg/mL的無血清DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng);LY294002組:以LY294002(PI3K抑制劑)濃度為100 μmol/mL的無血清 DMEM 培養(yǎng)液培養(yǎng);Rapa組:以Rapa(mTOR抑制劑)濃度為300 μmol/mL的無血清 DMEM 培養(yǎng)液。

    1.5 流式細胞術(shù)檢測藥物對細胞凋亡率的影響

    6孔板細胞種植密度為 1×105細胞/孔,待細胞長滿80%時, 加入空白組、中藥低、中、高劑量組、西藥組、LY294002組、Rapa組的培養(yǎng)液各2.5 mL,培養(yǎng) 72小時。用 PBS 洗滌 2 次,加入適量胰蛋白酶消化,收集細胞懸液,1000 r/min 4℃低溫離心 5分鐘,棄上清;加入預冷的 PBS 洗滌 2 次后每管加入 400 μL Binding Buffer 重懸后,加入 5 μL錨定蛋白 V-異硫氰酸熒光素(AnnexinV-FITC),4℃避光孵育 15分鐘后加10 μL 碘化丙啶(PI) 4℃避光孵育15分鐘,混勻上流式細胞儀測定細胞凋亡率。

    1.6 Transwell 體外細胞侵襲實驗

    Matrigel基質(zhì)膠準備,冰上操作鋪膠,將生長為對數(shù)期的輸卵管妊娠滋養(yǎng)細胞用胰酶消化,PBS稀釋成 5×105細胞/mL 的濃度,待用;于Transwell 板中的每個下室添加 DMEM/F12 培養(yǎng)液(含 10%胎牛血清),加入空白組、中藥低、中、高劑量組、西藥組、LY294002組、Rapa組的培養(yǎng)液各2 mL,混合均勻,上室內(nèi)進行接種,培養(yǎng)72小時后進行固定、臺盼藍染色、細胞計數(shù)。

    1.7 蛋白免疫印跡法檢測藥物與通路抑制劑對通路蛋白的影響

    6孔板細胞種植密度為 1×105細胞/孔,加入空白組、中藥低、中、高劑量組、西藥組、LY294002組、Rapa組的培養(yǎng)液各2.5 mL,每組設(shè)6個復孔,培養(yǎng)72小時細胞,采用蛋白免疫印跡法檢測每組細胞 p-Akt,p-mTOR蛋白的表達:上樣,SDS-PAGE 凝膠電泳,轉(zhuǎn)膜 (濕轉(zhuǎn)) 、封閉,加入一抗(1∶1000),洗滌,加入二抗反應,洗滌,配制ECL化學發(fā)光底物與膜共孵育1分鐘, 放入化學發(fā)光成像分析儀內(nèi), 自動曝光, 洗片,灰度值分析,計算相對蛋白含量。

    1.8 統(tǒng)計學處理

    2 結(jié)果

    2.1 各組細胞凋亡率比較

    與空白組對比,各組細胞凋亡率均上升,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。中藥高劑量組較空白組、中藥低劑量組、中劑量組的細胞凋亡率上升,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05),且呈濃度依賴性。中藥高劑量組較西藥組的細胞凋亡率上升,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與LY294002組、Rapa組對比,中藥高劑量組的細胞凋亡率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。詳見圖1、表1。

    表1 各組細胞凋亡率比較

    2.2 各組細胞侵襲能力比較

    與空白組對比,各組的過膜細胞數(shù)均減少,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。中藥高劑量組較中藥低劑量、中劑量組過膜細胞數(shù)減少,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05),且呈濃度依賴性。與西藥組、Rapa組對比,中藥高劑量組的過膜細胞數(shù)差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與LY294002組對比,中藥高劑量組的過膜細胞數(shù)增加,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。詳見圖2、表2。

    注:A:空白組; B:中藥低劑量組;C:中藥中劑量組;D:中藥高劑量組;E:西藥組;F:LY294002組;G:Rapa組。

    注:A:空白組; B:中藥低劑量組;C:中藥中劑量組;D:中藥高劑量組;E:西藥組;F:LY294002組;G:Rapa組。

    表2 各組細胞侵襲力比較

    2.3 各組細胞PI3K/Akt/mTOR信號通路相關(guān)蛋白表達比較

    與空白組對比,各組的p-Akt、p-mTOR蛋白表達均下降,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05);中藥高劑量組較中藥低、中劑量組,p-Akt、p-mTOR蛋白表達下降,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05),且呈濃度依賴性。與LY294002組對比,中藥高劑量組、西藥組細胞中 p-Akt 蛋白水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);與Rapa組對比,中藥高劑量組、西藥組p-mTOR蛋白水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);詳見圖3、表3。

    注:A:空白組; B:中藥低劑量組;C:中藥中劑量組;D:中藥高劑量組;E:西藥組;F:LY294002組;G:Rapa組。

    表3 各組磷酸化 Akt、mTOR蛋白比較

    3 討論

    妊娠時,由凋亡引起的程序化細胞死亡,對母胎界面的種植與蛻膜化意義重大,適度的細胞凋亡促進了胚胎種植所需的血管形成,這種與凋亡相關(guān)的微妙變化,被認為對胚胎的正常發(fā)育起到正向的促進作用[10]。適度的調(diào)控是關(guān)鍵,若滋養(yǎng)細胞中關(guān)于凋亡與增殖的平衡遭到破壞,導致過度凋亡的發(fā)生,影響胚胎在著床部位的種植,可能是誘發(fā)流產(chǎn)增加的原因[11]。對輸卵管妊娠治療結(jié)局的期待,恰恰是與宮內(nèi)正常妊娠相反的。

    輸卵管妊娠時,受精卵在非子宮體腔著床,絨毛滋養(yǎng)細胞發(fā)揮侵襲種植局部——輸卵管管壁的能力,種植場所同樣有細胞凋亡與增殖的發(fā)生。由于輸卵管的環(huán)境異于宮腔環(huán)境,凋亡調(diào)節(jié)的平衡狀態(tài)受到影響,比如抗凋亡蛋白的大量存在,導致不加控制的滋養(yǎng)細胞的存活、增殖[12],加之輸卵管的管壁菲薄,對滋養(yǎng)細胞漸進性的侵襲耐受性差,最終出現(xiàn)輸卵管管壁破裂,腹腔內(nèi)出血的結(jié)局。研究團隊前期已對化瘀消癥復方的作用機制做出初步探索[4-9],而PI3K/Akt/mT0R信號通路與細胞凋亡的相關(guān)性是本實驗的重點。

    PI3K/Akt/mTOR信號通路是一條可調(diào)控眾多信號因子,與細胞增殖、分化、血管生成、胚胎發(fā)育和腫瘤侵襲的精細調(diào)節(jié)相關(guān)的通路,其介導絨毛滋養(yǎng)層細胞生長與侵襲借助的是生長因子的效能[13]。在這條信號通路中,Akt是最關(guān)鍵的因子[14],尤其表現(xiàn)在對細胞凋亡的抑制與對細胞增殖的促進方面。當PI3K受到上游信號刺激后,激活下游的Akt,引起Akt磷酸化,激活下游的mTOR[15],進而影響各種細胞行為。目前的研究發(fā)現(xiàn)該信號通路在滋養(yǎng)細胞種植過程中有舉足輕重的作用:PI3K /Akt信號通路作為介導滋養(yǎng)細胞增殖、侵襲與凋亡發(fā)生的靶通路而廣泛地應用于與妊娠相關(guān)的疾病研究[16]。研究表明,增強滋養(yǎng)細胞中PI3K/Akt信號通路的表達,可以提高Bcl-2的相對表達水平;降低Bax和Bim的表達水平,由此推斷PI3K/Akt信號通路與細胞凋亡的發(fā)生呈負相關(guān)[17]。促進PI3K/AKT/mTOR通路的激活,正向促進了滋養(yǎng)細胞的入侵以及對氧化應激的抑制;抑制其表達可逆轉(zhuǎn)上述影響[18]。在滋養(yǎng)細胞中,誘導基質(zhì)金屬蛋白酶蛋白水解活性,影響基質(zhì)金屬蛋白酶9和基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑1的比值變化,可能通過AKT通路[19]和mTOR信號通路[20],刺激細胞粘附和增殖,并增加侵襲性。mTOR作為自噬相關(guān)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子,若其蛋白及磷酸化的表達被靶向抑制,可誘導細胞自噬發(fā)生和受損細胞遷移,因而影響胎盤功能障礙的發(fā)生[21]。以上研究結(jié)果表明,PI3K/Akt/mTOR信號通路及其相關(guān)蛋白的表達活性,與滋養(yǎng)細胞增殖、侵襲呈正相關(guān),與滋養(yǎng)細胞凋亡呈負相關(guān)。該通路活性的增強,對正常宮內(nèi)妊娠種植,是正向促進作用;而輸卵管妊娠則反之。

    化瘀消癥復方由天花粉、紫草、赤芍、桃仁、丹參組成,臨床與基礎(chǔ)研究均表明其乃治療輸卵管妊娠的有效方劑[8,22]。本實驗發(fā)現(xiàn)化瘀消癥復方促進輸卵管妊娠滋養(yǎng)細胞凋亡率的增加,并抑制輸卵管妊娠滋養(yǎng)細胞的侵襲,均與藥物濃度呈量-效關(guān)系;化瘀消癥復方抑制p-Akt與p-mTOR的表達,與通路抑制劑的作用結(jié)果相似。檢測磷酸化的蛋白即檢測處于活性狀態(tài)的蛋白,與分子功能更直接相關(guān),可直接反映PI3K/Akt/mTOR信號通路活性程度。以上結(jié)果與文獻中報道的PI3K/Akt/mTOR信號通路調(diào)控滋養(yǎng)細胞凋亡、侵襲的趨勢相一致[23-24]。

    由本實驗的結(jié)果推論,化瘀消癥復方治療輸卵管妊娠的可能機制是:干預上游的PI3K,使Akt磷酸化水平的表達下調(diào),阻斷下游多種抗凋亡效應分子的活化,調(diào)控 mTOR蛋白磷酸化水平的低表達,導致細胞蛋白質(zhì)翻譯得不到有效啟動,減弱了維持細胞生長與存活的信號,從而實現(xiàn)對微環(huán)境中細胞凋亡狀態(tài)的平衡。輸卵管局部細胞凋亡的增加,使滋養(yǎng)細胞侵襲活性受到抑制,改善對輸卵管的無限制侵襲,從而起到“殺胚”的作用。

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