復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者絨毛及蛻膜組織中BUB3和BubR1的表達(dá)研究

趙 娟 李 輝 陳廣新 杜利軍 張曉麗 曹天生

1.廣州市花都區(qū)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東廣州 501800；2.廣州市花都區(qū)人民醫(yī)院內(nèi)科，廣東廣州 501800；3.廣州市花都區(qū)人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，廣東廣州 501800；4.廣州市花都區(qū)人民醫(yī)院外科，廣東廣州 501800

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)（recurrent miscarriage，RM）指妊娠28周前發(fā)生3次及3次以上的自然流產(chǎn)，其發(fā)病率為1%～3%[1-2]。但多數(shù)學(xué)者認(rèn)為連續(xù)發(fā)生2次流產(chǎn)就應(yīng)給予重視并進(jìn)行評(píng)估，因?yàn)槠滹L(fēng)險(xiǎn)與流產(chǎn)3次者接近[3]。RM 病因復(fù)雜，各因素之間相互影響，染色體異常、內(nèi)分泌失調(diào)、自身免疫因素等均可導(dǎo)致發(fā)病[4]。因此針對(duì)RM的診斷只能依靠各種輔助檢查篩查病因。研究發(fā)現(xiàn)，流產(chǎn)胚胎細(xì)胞處于分裂中期時(shí)，紡錘體檢查點(diǎn)（spindle checkpoint，SAC）需要確保全部染色體均能連接到紡錘體微管上，進(jìn)而排列在細(xì)胞赤道板上，使細(xì)胞能夠進(jìn)入分裂后期[5]。BUB3（budding uninhibited by benzimida-zole 3，BUB3）是一種磷酸氨基酸銜接子，是SAC 結(jié)構(gòu)相關(guān)的復(fù)合物成分之一，這些復(fù)合物具有功能不同的旁系同源物，如Bub1 相關(guān)蛋白（Bub1 related protein，BubR1）。而BubR1的水平與SAC的功能存在一定的劑量依賴，該基因一旦缺失將引起大量非整倍體產(chǎn)生，從而引發(fā)SAC的功能失調(diào)，細(xì)胞分裂抑制，導(dǎo)致胚胎發(fā)育遲緩[6-8]。本研究探討B(tài)UB3 及BubR1 在RM患者絨毛及蛻膜組織中的表達(dá)及其與RM的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016年3月～2018年3月于廣州市花都區(qū)人民醫(yī)院就診的50例稽留流產(chǎn)孕婦作為病例組，另選取同期50例正常人工流產(chǎn)婦女作為對(duì)照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合《復(fù)發(fā)性流產(chǎn)診治的專家共識(shí)》中RM 定義[1]；②自行經(jīng)陰道排出妊娠組織或經(jīng)臨床確診為稽留流產(chǎn)的患者；③RM次數(shù)（包括此次入院前妊娠后流產(chǎn)）≥3次。排除標(biāo)準(zhǔn)：①存在生殖道畸形者；②生殖道感染者；③患有嚴(yán)重肝腎等系統(tǒng)性疾病者。收集受試者的年齡、體重指數(shù)（body mass index，BMI）、孕次、產(chǎn)次、總膽固醇（total cholesterol，TC）、三酰甘油（triglyceride，TG）、低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）等一般資料。所有研究對(duì)象或其直系親屬簽署知情同意書，本研究所用方法符合《赫爾辛基宣言》，且經(jīng)廣州市花都區(qū)人民醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑與儀器

-80℃超低溫冰箱（美國(guó)Thermo 公司），一抗為兔抗人BUB3、BubR1（Abcam 公司），二抗為羊抗兔IgG（Abcam 公司），BCA 試劑盒（北京中杉金橋公司），熒光實(shí)時(shí)定量PCR（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）儀（美國(guó)Applied biosygtems 公司），Trizol 試劑（美國(guó)Invirotrogen 公司），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（北京天根生物科技公司），SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒（大連TaKaRa 公司），引物由上海生工生物工程有限公司設(shè)計(jì)并合成。TC、TG、LDL-C、HDL-C 試劑盒（批號(hào)KH216、KJ919、ER363、KF707） 均由富士膠片和光純藥株式會(huì)社提供。

1.3 方法

1.3.1 樣本采集及處理 無菌條件下對(duì)稽留流產(chǎn)患者進(jìn)行清宮術(shù)，術(shù)后挑取胚胎絨毛組織（villous tissue，VT）、蛻膜組織（decidual tissue，DT）分成兩份，一份提取總RNA，一份進(jìn)行組織蛋白的提取。

1.3.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)受試者胚胎VT、DT 中BUB3 mNRA、BubR1 mNRA 水平 采用Trizol 法提取受試者胚胎VT、DT 樣本中的總RNA，用分光光度計(jì)測(cè)總RNA 純度，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA。參照SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒說明書進(jìn)行qRT-PCR 反應(yīng)，以GAPDH 基因?yàn)閮?nèi)參，BUB3 mNRA、BubR1 mNRA、GAPDH 引物序列見表1。反應(yīng)條件為：95℃，10 min；40個(gè)PCR 循環(huán)（95℃，10 s；60℃，60 s；72℃，15 s）。采用2-ΔΔCt 方法計(jì)算樣本中BUB3 mNRA、BubR1 mNRA 相對(duì)表達(dá)量。

1.3.4 蛋白免疫印跡（Western Blot）檢測(cè)受試者組織中BUB3、BubR1 蛋白表達(dá) 將胚胎VT、DT 組織剪碎，加入蛋白裂解液，冰浴30 min，4℃，10 000 r/min，離心30 min，吸取上清液至EP 管。用BCA 法測(cè)定全細(xì)胞裂解液蛋白濃度，每孔取50 μg 進(jìn)行SDSPAGE電泳，一抗（BUB3、BubR1抗體，稀釋倍數(shù)1:500）孵育4℃過夜，羊抗兔二抗（1:10 000）室溫孵育2 h，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光顯色，采用Quantlty One 軟件進(jìn)行灰度值分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩組間比較采用t 檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用率表示，兩組間比較采用χ2檢驗(yàn)；采用Logistic回歸分析RM 發(fā)生的影響因素，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 qRT-PCR 引物序列

2 結(jié)果

2.1 兩組一般資料的比較

病例組的年齡、BMI、產(chǎn)次、TC、TG、LDL-C、HDL-C水平與對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），病例組的孕次多于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表2）。

表2 兩組一般資料的比較（）

表2 兩組一般資料的比較（）

組別 例數(shù)年齡（歲）BMI（kg/m2）孕次（次）產(chǎn)次（次）TC（mmol/L）TG（mmol/L）LDL-C（mmol/L）HDL-C（mmol/L）對(duì)照組病例組χ2/t值P值50 50 34.56±3.25 35.13±3.86 0.799 0.426 26.68±5.73 26.75±5.36 0.063 0.950 1.58±0.32 3.85±0.83 18.044 0.000 0.85±0.21 0.92±0.25 1.516 0.133 4.35±0.85 4.62±0.93 1.515 0.133 1.89±0.23 1.94±0.26 1.019 0.311 2.61±0.62 2.75±0.63 1.120 0.265 1.03±0.23 1.06±0.31 0.550 0.584

2.2 兩組BUB3mRNA、BubR1 mRNA表達(dá)的比較

病例組VT、DT 中BUB3 mRNA、BubR1 mRNA 水平低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；對(duì)照組和病例組VT 中BUB3 和BubR1 mRNA 水平均高于DT，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表3）。

表3 兩組BUB3 mRNA、BubR1 mRNA表達(dá)的比較（）

表3 兩組BUB3 mRNA、BubR1 mRNA表達(dá)的比較（）

與VT 比較，*P＜0.05

組別 例數(shù) BUB3 mRNA/GAPDH VT DT BubR1 mRNA/GAPDH VT DT對(duì)照組病例組t值P值50 50 1.02±0.19 0.73±0.08 9.947 0.000 0.83±0.11*0.51±0.05*18.727 0.000 1.23±0.21 0.76±0.13 13.456 0.000 1.02±0.15*0.53±0.06*21.447 0.000

2.3 兩組BUB3 及BubR1 蛋白表達(dá)的比較

病例組VT、DT 中BUB3、BubR1 蛋白表達(dá)水平低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；對(duì)照組和病例組VT 中BUB3 和BubR1 蛋白表達(dá)水平均高于DT，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表4，圖1）。

表4 兩組BUB3 及BubR1 蛋白表達(dá)的比較（）

表4 兩組BUB3 及BubR1 蛋白表達(dá)的比較（）

與VT 比較，*P＜0.05

組別 例數(shù) BUB3 VT DT BUBR1 VT DT對(duì)照組病例組t值P值50 50 1.34±0.25 0.75±0.11 15.275 0.000 0.93±0.16*0.56±0.05*15.608 0.000 1.03±0.19 0.54±0.07 17.112 0.000 0.76±0.12*0.35±0.03*23.438 0.000

圖1 兩組BUB3 及BubR1 蛋白表達(dá)情況

2.4 Logistic回歸分析RM 發(fā)生的影響因素

以行流產(chǎn)手術(shù)孕婦是否發(fā)生RM 為因變量，以流產(chǎn)孕婦孕次、BUB3 mRNA、BubR1 mRNA 水平為自變量進(jìn)行Logistic回歸分析，孕次、BUB3 mRNA、BubR1 mRNA 為發(fā)生RM的危險(xiǎn)因素（P＜0.05）（表5）。

表5 Logitic回歸分析RM 發(fā)生的影響因素

3 討論

RM是一種較為罕見的疾病，病因復(fù)雜，是目前基礎(chǔ)與臨床研究的難點(diǎn)和熱點(diǎn)[9-10]。研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞分裂過程中，SAC 能夠監(jiān)控細(xì)胞分裂中期全部染色體與紡錘體微管的連接情況，若SAC 相關(guān)基因表達(dá)異常，則會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞分裂受到抑制或細(xì)胞染色體數(shù)目出現(xiàn)異常[5，11]。SAC 在細(xì)胞分裂中后期能夠抑制細(xì)胞分裂周期基因20（cell division cycle gene 20，Cdc20）激活后期促進(jìn)復(fù)合物/環(huán)體（anaphase-promoting complex/cyclosome，APC/C），使細(xì)胞保持于分裂中期，保證染色體與紡錘體正常連接，二者正確結(jié)合后，SAC 失活，APC/C-Cdc20 泛素化分離酶抑制劑及細(xì)胞周期蛋白B，使染色體正確分離，細(xì)胞分裂進(jìn)入后期[12-13]。因此探討胚胎細(xì)胞分裂過程中SAC 基因的表達(dá)，對(duì)探明流產(chǎn)發(fā)生的機(jī)制具有重要意義。

Wei 等[14]將BUB3、BubR1基因過表達(dá)以及采用RNA 干擾方法，分析SAC 復(fù)合物在小鼠胚胎中的作用。結(jié)果表明，過表達(dá)的SAC 成分通過阻止姐妹染色單體分離而抑制了細(xì)胞中期-后期的轉(zhuǎn)變。RNA 干擾方法刪除SAC 成分會(huì)加速第一次減數(shù)分裂過程中的中期-后期過度，并導(dǎo)致微核形成，染色體錯(cuò)位或非整倍性，造成胚胎發(fā)育遲緩，說明SAC 及其表達(dá)基因?qū)β蚜哑谛∈笈咛ブ杏薪z分裂細(xì)胞周期進(jìn)程的調(diào)節(jié)至關(guān)重要。本研究結(jié)果顯示，病例組VT、DT 中BUB3及BubR1 mRNA 和蛋白水平均低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；對(duì)照組和病例組VT 中BUB3 及BubR1 mRNA 和蛋白水平均高于DT，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。提示病例組BUB3 及BubR1 水平降低，造成SAC 復(fù)合物含量異常，胚胎細(xì)胞分裂過程中形成非整倍體細(xì)胞，且主要集中于滋養(yǎng)細(xì)胞胞漿內(nèi)，可能具有VT 細(xì)胞特異性，最后產(chǎn)生致死性胚胎，從而導(dǎo)致流產(chǎn)。

有研究報(bào)道，缺失BUB3、BubR1或MAD2的小鼠有早產(chǎn)現(xiàn)象，因成纖維細(xì)胞內(nèi)缺乏SAC，細(xì)胞表現(xiàn)為非整倍性[15]。Logistic回歸分析結(jié)果顯示，孕次、BUB3及BubR1 mRNA 均是發(fā)生RM的危險(xiǎn)因素，提示孕次及BUB3 及BubR1 mRNA 與RM 發(fā)生有關(guān)。

綜上所述，RM患者VT、DT中BUB3 及BubR1 mRNA 和蛋白水平均降低，且VT 中BUB3 及BubR1 mRNA 和蛋白水平均高于DT，BUB3 及BubR1 mRNA是RM的危險(xiǎn)因素，可能對(duì)RM 有潛在預(yù)測(cè)價(jià)值。本研究存在研究方法單一，研究深度及影響因素不夠豐富的不足，RM患者中BUB3 及BubR1的作用機(jī)制仍需進(jìn)一步驗(yàn)證。