益氣清毒消瘤方誘導(dǎo)腸癌細(xì)胞凋亡的機(jī)制研究

唐曉玲 郭 健 熊林楷 王利勤 熊墨年

1.江西省中醫(yī)藥研究院惡性腫瘤益氣清毒重點(diǎn)研究室，江西南昌 330046；2.南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院中醫(yī)科，江西南昌330006；3.江西省腫瘤醫(yī)院內(nèi)二科，江西南昌 330029；4.江西省中醫(yī)藥研究院，江西南昌 330046

大腸癌是目前威脅人類健康與生命安全的惡性疾病之一，具有較高的發(fā)病率[1]，且早期發(fā)病隱匿，加之目前我國(guó)國(guó)民體檢及胃腸道篩查普及率不高，多數(shù)腸癌患者確診時(shí)已是中晚期[2]，錯(cuò)過(guò)最佳手術(shù)時(shí)機(jī)，并且放化療除具有較嚴(yán)重的毒副反應(yīng)外，長(zhǎng)時(shí)間應(yīng)用還易導(dǎo)致患者不耐受及耐藥等情況，限制了臨床的應(yīng)用[3]。近年來(lái)，中醫(yī)藥在各種惡性疾病的治療中扮演重要角色，成為臨床應(yīng)用及研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)[4]。益氣清毒法是熊墨年教授基于祖國(guó)醫(yī)學(xué)“邪之所湊，其氣必虛”和“積之成也，正氣不足，而后邪氣踞之”理論，在長(zhǎng)期的腫瘤臨床診療與科研實(shí)踐中形成并提出的治療腫瘤的學(xué)術(shù)思想。本研究主要針對(duì)益氣清毒消瘤方含藥血清對(duì)大腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用，初步分析其誘導(dǎo)腸癌細(xì)胞凋亡的機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)資料

1.1.1 主要儀器和試劑 激光流式細(xì)胞儀、激光共聚焦顯微鏡、凝膠成像儀均購(gòu)自O(shè)lympus 公司，電泳儀購(gòu)自北京六一公司；RPMI1640 培養(yǎng)基、單克隆Bcl-2 抗體、單克隆Bax 抗體、單克隆Fas 抗體均購(gòu)自abcam公司。

1.1.2 益氣清毒消瘤方藥物制備 太子參15 g，白術(shù)15 g、茯苓15 g、甘草6 g、黃芪20 g、白花蛇舌草30 g、半枝蓮30 g、藤梨根20 g、敗醬草15 g、地榆15 g、枳殼10 g、莪術(shù)10 g，加水煎煮1 h，煎液濃縮至1.3 g/mL 生藥，冰箱冷藏保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.3 含藥血清制備 本研究經(jīng)過(guò)動(dòng)物倫理委員會(huì)審核同意。采用清潔級(jí)18～22 g 雄性昆明小鼠40 只（南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號(hào)：190608），隨機(jī)分為高、中、低劑量組和對(duì)照組，每組各10 只，對(duì)照組給予0.2 mL的生理鹽水，高、中、低劑量組給藥量分別為13 g 生藥/kg 體重、6.5 g 生藥/kg 體重、3.25 g生藥/kg 體重，4 組小鼠均灌胃給藥3 d，2次/d，于末次給藥前12 h 禁食，末次給藥后1 h 乙醚麻醉，下腔動(dòng)脈取血，無(wú)菌分離血清，經(jīng)56℃30 min 滅活，過(guò)濾除菌，-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及傳代

人大腸癌Wide 細(xì)胞系購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液研究所，使用含15 %胎牛血清的RPMI1640 培養(yǎng)基，置CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。每2～3 天傳代1次。

1.3 細(xì)胞增殖抑制試驗(yàn)（MTT 法）

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，胰酶消化后計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×105/mL，接種于96 孔板內(nèi)，每孔0.1 mL，培養(yǎng)24 h后加入等體積不同濃度血清（高、中、低劑量組和對(duì)照組），每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔，37℃的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)12、24、48 h后，細(xì)胞增殖抑制試驗(yàn)（MTT 法）測(cè)定各組細(xì)胞OD值，計(jì)算抑制率，重復(fù)3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。

1.4 細(xì)胞凋亡的形態(tài)觀察

配置0.025%AO-EB 染液，取蓋玻片培養(yǎng)細(xì)胞，入AO 染液染色5 s，20%乙醇-生理鹽水溶液分色2 s，置于載玻片上，藍(lán)光（502 nm）激發(fā)，激光共聚焦顯微鏡（LSCM）觀察各組細(xì)胞形態(tài)。

1.5 流式細(xì)胞儀（FCM）檢測(cè)

1.5.1 細(xì)胞凋亡率測(cè)定 取經(jīng)各含藥血清處理24 h后的腸癌細(xì)胞，胰酶消化后調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×106/mL，按試劑說(shuō)明每樣本分別加入異硫氰酸熒光素標(biāo)記的磷脂結(jié)合蛋白5 μL 和碘化丙啶10 μL，震蕩混勻，加入緩沖溶液懸浮細(xì)胞400 μL 進(jìn)行FCM 檢測(cè)。

1.5.2 蛋白免疫印跡試驗(yàn)（Western Blot）檢測(cè)凋亡調(diào)控基因Bcl-2、Bax、Fas的蛋白表達(dá) 含藥血清處理24 h 胰酶消化后調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×106/mL，常規(guī)處理細(xì)胞進(jìn)行凝膠電泳-轉(zhuǎn)膜-封閉，按細(xì)胞內(nèi)蛋白染色方法，分別加入20 μL的Bcl-2、Bax、Fas 抗體進(jìn)行抗原-抗體雜交反應(yīng)，完成后置于凝膠成像儀觀察檢測(cè)結(jié)果并拍照。各組蛋白表達(dá)強(qiáng)度=每個(gè)樣本條帶的灰度值/β-actin條帶灰度值，進(jìn)行半定量分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 23.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩組間比較采用t 檢驗(yàn)；多組間比較采用單因素分析，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組培養(yǎng)12、24、48 h后的OD值和抑制率的比較

對(duì)照組24、48 h的OD值高于12 h，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；低劑量組48 h的OD值高于12 h，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；低、中、高劑量組培養(yǎng)12、24、48 h的OD值低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；含藥血清干預(yù)組細(xì)胞抑制率呈現(xiàn)時(shí)間和劑量依賴趨勢(shì)（表1）。

2.2 各組細(xì)胞形態(tài)的比較

AO/EB 染色LSCM 鏡下顯示，對(duì)照組細(xì)胞完整，橙色細(xì)胞占（3.12±0.13）%；低劑量組細(xì)胞膜存在皺縮現(xiàn)象，少量凋亡細(xì)胞，橙色細(xì)胞占（38.37±7.92）%；中劑量組橙色細(xì)胞占（69.16±9.65）%，呈簇出現(xiàn)，細(xì)胞膜明顯皺縮、細(xì)胞質(zhì)存在空泡、染色質(zhì)存在塊狀及邊聚現(xiàn)象，凋亡比例升高；高劑量組橙色細(xì)胞占（84.64±11.37）%，細(xì)胞膜破碎，染色質(zhì)團(tuán)塊狀、邊聚，核固縮、核破碎，裸核的壞死細(xì)胞比例高于其他三組（圖1，封四）。

表1 各組培養(yǎng)12、24、48 h后的OD值和抑制率的比較

2.3 各組細(xì)胞凋亡率的比較

含藥血清干預(yù)組24 h后細(xì)胞凋亡率高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；中、高劑量組24 h 細(xì)胞凋亡率均高于低劑量組，高劑量組24 h 細(xì)胞凋亡率高于中劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表2，圖2）。

表2 各組細(xì)胞凋亡率的比較（%，）

表2 各組細(xì)胞凋亡率的比較（%，）

與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與低劑量組比較，#P＜0.05；與中劑量組比較，&P＜0.05

組別 早期 晚期對(duì)照組（n=10）低劑量組（n=10）中劑量組（n=10）高劑量組（n=10）F值P值4.26±0.71 13.75±1.23*19.53±1.34*#29.36±2.04*#&610.848 0.000 1.06±0.56 7.94±1.65*10.38±1.93*#14.81±1.83*#&143.318 0.000

圖2 各組細(xì)胞24h后早期細(xì)胞凋亡流式檢測(cè)

2.4 各組細(xì)胞凋亡調(diào)控基因Bcl-2、Bax、Fas的蛋白表達(dá)的比較

含藥血清干預(yù)組細(xì)胞凋亡調(diào)控基因Bax、Fas表達(dá)高于對(duì)照組，Bcl-2表達(dá)低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；中、高劑量量組細(xì)胞凋亡調(diào)控基因Bax、Fas表達(dá)高于低劑量組，Bcl-2表達(dá)低于低劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；高劑量量組細(xì)胞凋亡調(diào)控基因Bax、Fas表達(dá)高于中劑量組，Bcl-2表達(dá)低于中劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表3，圖3）。

表3 各組細(xì)胞凋亡調(diào)控基因Bcl-2、Bax、Fas的蛋白表達(dá)的比較（）

表3 各組細(xì)胞凋亡調(diào)控基因Bcl-2、Bax、Fas的蛋白表達(dá)的比較（）

與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與低劑量組比較，#P＜0.05；與中劑量組比較，&P＜0.05

組別 Bax Bcl-2 Fas對(duì)照組（n=10）低劑量組（n=10）中劑量組（n=10）高劑量組（n=10）F值P值0.17±0.02 0.33±0.06*0.56±0.04*#0.81±0.05*#&459.830 0.000 1.06±0.08 0.67±0.07*0.45±0.09*#0.21±0.06*#&266.354 0.000 0.11±0.03 0.39±0.05*0.51±0.09*#0.73±0.07*#&173.384 0.000

圖3 各組細(xì)胞凋亡調(diào)控基因Bcl-2、Bax、Fas 蛋白的表達(dá)

3 討論

近年來(lái)，隨著祖國(guó)醫(yī)學(xué)在腫瘤領(lǐng)域的不斷進(jìn)展，中醫(yī)藥在惡性腫瘤治療中越發(fā)重要[5]。熊墨年教授基于多年的科研和臨床實(shí)踐，提出“益氣清毒法”治療腫瘤的學(xué)術(shù)思想，其益氣清毒消瘤方以中醫(yī)扶正祛邪和脾樞機(jī)理論為基礎(chǔ)，以四君子湯健脾益氣、運(yùn)轉(zhuǎn)樞機(jī)、激發(fā)和調(diào)理臟腑功能為核心，兼以消除毒邪、消腫散結(jié)，提高機(jī)體免疫和抗腫瘤能力，全方用藥輕柔，如清滌污濁，達(dá)到扶正不留邪，攻邪不傷正的目的[6]。臨床以此方為基礎(chǔ)視腫瘤侵犯臟器的情況而辨證加減，產(chǎn)生良好的效果。

腸癌相當(dāng)于中醫(yī)“腸蕈”“臟毒”“鎖肛痔”“積聚”等范疇，病機(jī)特點(diǎn)多為本虛標(biāo)實(shí)和虛實(shí)夾雜，脾虛和腎虛是虛之本，氣、濕、痰、瘀、毒為實(shí)之標(biāo)[7]。中醫(yī)認(rèn)為，脾胃為后天之本，氣血生化之源，氣虛則受納與健運(yùn)乏力，加之濕濁內(nèi)生，脾胃運(yùn)化不利則引起腸胃等諸多疾病[8]。四君子湯組方以太子參為君，甘溫益氣，健脾養(yǎng)胃；臣以苦溫之白術(shù)，健脾燥濕，加強(qiáng)益氣助運(yùn)之力；佐以甘淡茯苓，健脾滲濕，苓術(shù)相配，則健脾祛濕之功益著；使以炙甘草，益氣和中，調(diào)和諸藥，益氣健脾之功[9]。另黃芪包括苷類、多糖、黃酮、葉酸及多種微量元素具有抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫、抗氧化等多種作用[10]；白花蛇舌草包含蒽醌、萜類、黃酮、香豆素、苯丙素、多糖等多種化學(xué)成分，具有調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)、抗腫瘤、抑制血管生成等多種作用[11]；半枝蓮具有調(diào)節(jié)免疫力、抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡等作用[12]；藤梨根清熱利濕，祛風(fēng)除痹，解毒消腫，在消化系癌腫中應(yīng)用廣泛[13]；敗醬草具有清熱解毒，祛痰排膿之功[14]；地榆解毒斂瘡[15]；枳殼理氣寬中，行滯消脹[16]；莪術(shù)破血祛瘀行氣、消腫止痛[17]。全方用藥輕柔，以四君子湯為核心，健脾益氣、調(diào)理臟腑，兼以諸藥消除毒邪，調(diào)理機(jī)體免疫和抗腫瘤能力。

本研究結(jié)果顯示，益氣清毒消瘤方對(duì)大腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)具有明顯的抑制作用，細(xì)胞抑制率呈現(xiàn)時(shí)間和劑量依賴趨勢(shì)，并且能夠破壞腸癌細(xì)胞結(jié)構(gòu)，增加細(xì)胞凋亡率，同樣呈現(xiàn)明顯的量效相關(guān)性，進(jìn)一步證實(shí)益氣清毒消瘤方在大腸癌中的治療作用。本研究對(duì)Bcl-2、Bax、Fas的蛋白表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè)，Bcl-2、Bax 為同屬家族，但二者作用相反，Bcl-2 為凋亡抑制基因，Bax 為凋亡促進(jìn)基因[18]，F(xiàn)as 屬于死亡受體家族，是一種跨膜蛋白[19]?，F(xiàn)已證實(shí)，包括腸癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤Bcl-2、Bax、Fas 均異常表達(dá)[20]，并且存在相互關(guān)聯(lián)。本研究結(jié)果顯示，對(duì)照組Bax、Fas 明顯低表達(dá)，Bcl-2 高表達(dá)，提示腸癌細(xì)胞可能存在凋亡與增殖失衡，從而促進(jìn)癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖。此外，含藥血清干預(yù)組細(xì)胞凋亡調(diào)控基因Bax、Fas表達(dá)高于對(duì)照組，Bcl-2表達(dá)低于對(duì)照組，且隨劑量的升高Bax、Fas表達(dá)升高，Bcl-2表達(dá)降低，呈現(xiàn)明顯的量效相關(guān)性。因此，有理由認(rèn)為益氣清毒消瘤方可能通過(guò)調(diào)控腸癌細(xì)胞Bax、Fas的高表達(dá)、Bcl-2 低表達(dá)干預(yù)細(xì)胞結(jié)構(gòu)，使細(xì)胞膜破碎，染色質(zhì)團(tuán)塊狀、邊聚，核固縮、核破碎，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

綜上所述，益氣清毒消瘤方能夠明顯抑制腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖，有效提高細(xì)胞凋亡調(diào)控基因Bax、Fas表達(dá)，抑制Bcl-2表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，為益氣清毒法治療大腸癌提供了可靠的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。