基于7-異戊二烯色氨酸合成酶催化合成C-7異戊烯化的吲哚二酮哌嗪生物堿

劉 瑞，張弘弛，李 慧，周 鳳

(山西大同大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山西大同 037009；山西大同大學(xué) 應(yīng)用生物技術(shù)研究所，山西大同 037009)

異戊烯化的吲哚天然產(chǎn)物是存在于多種生物體(包括植物、真菌和海洋生物)中的一大類天然產(chǎn)物，真菌是這類天然產(chǎn)物的最大生產(chǎn)者[1-2]。目前的研究已經(jīng)證實(shí)，異戊二烯基團(tuán)可以通過(guò)與膜相關(guān)蛋白質(zhì)的相互作用，改善生物膜的親和力[2]，進(jìn)而提高異戊烯化的吲哚天然產(chǎn)物的生物活性。其中，這類天然產(chǎn)物中由異戊二烯基二磷酸的異戊二烯部分和色氨酸的吲哚環(huán)組成的異戊烯基吲哚二酮哌嗪生物堿[3]，其生物活性最特別，發(fā)現(xiàn)具有多種生物學(xué)和藥理活性，如抗真菌、抗細(xì)菌、抗病毒、抗寄生蟲(chóng)、抗炎、抗腫瘤、化學(xué)預(yù)防、雌激素和抗雌激素活性等[4-5]。

在真菌細(xì)胞內(nèi)，異戊烯基吲哚二酮哌嗪生物堿是經(jīng)異戊二烯色氨酸合成酶催化而代謝合成。異戊二烯色氨酸合成酶(Dimethylallyl tryptophan synthase，DMATS)僅接受必需的二甲基烯丙基二磷酸酯(Dimethylallyl diphosphate，DMAPP)作為異戊烯基團(tuán)的供體，對(duì)芳香族底物表現(xiàn)出廣泛的底物特異性，例如簡(jiǎn)單的色氨酸衍生物或含色氨酸的環(huán)狀二肽，進(jìn)而選擇性催化吲哚環(huán)不同位置的區(qū)域異戊烯化，可以產(chǎn)生具有不同生物學(xué)活性且結(jié)構(gòu)多樣化的異戊烯基化吲哚二酮哌嗪生物堿，例如，F(xiàn)tmPT1催化了所有測(cè)試的含色氨酸的環(huán)狀二肽的C2-異戊烯化作用[6]，而AnaPT則將這些化合物在吲哚環(huán)的C3位置異戊烯化作用[7]。

因此，本研究以多種含色氨酸的環(huán)二肽為酶反應(yīng)底物，催化合成C-7異戊烯化的吲哚二酮哌嗪生物堿，考察7-異戊二烯色氨酸合成酶(7-dimethylallyl tryptophan synthase，7-DMATS)對(duì)不同底物的轉(zhuǎn)化率影響，并通過(guò)分析環(huán)二肽底物與7-DMATS的分子對(duì)接關(guān)系，進(jìn)一步分析C-7異戊烯化的吲哚二酮哌嗪生物堿的酶催化底物特異性機(jī)理。測(cè)定合成的C-7異戊烯化的吲哚二酮哌嗪生物堿的細(xì)胞毒性，驗(yàn)證異戊烯化的吲哚二酮哌嗪生物堿可以大大提高其生物活性，并對(duì)活性最高的化合物(7b)進(jìn)行7-DMATS催化反應(yīng)條件的優(yōu)化研究，為進(jìn)一步深入研究異戊烯化的吲哚二酮哌嗪生物堿的生物合成奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

試劑及生化材料：各種氨基酸(國(guó)藥集團(tuán))，Ni-NTA瓊脂糖樹(shù)脂(德國(guó)Qiagen公司)，HPLC用色譜純?cè)噭?上海星可生化有限公司)；大腸桿菌XL1-Blue MRF’，pGEM-T和pQE60 (德國(guó)Qiagen公司)；煙曲霉AspergillusfumigatusB5233(ATCC 13073)的UniZAP XR預(yù)制文庫(kù)(美國(guó)Stratagene公司)。

儀器：ESI-MS質(zhì)譜儀JEOL SX102A(日本電子株式會(huì)社)，核磁共振儀Bruker ADVANCE 500 MHz(德國(guó)布魯克公司)，高效液相色譜Agilent 1200型(美國(guó)惠普公司)，自動(dòng)旋光儀WZZ-3型(上海儀電物理光學(xué)儀器有限公司)。

癌細(xì)胞株：人源性宮頸癌細(xì)胞(Human cervical carcinoma cells，HeLa)由第四軍醫(yī)大學(xué)提供；人源性肺癌細(xì)胞(Human lung cancer cells，A549)和人源性乳腺癌細(xì)胞(Human breast cancer cells，MCF-7)購(gòu)自中科院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。

1.2 方 法

1.2.1 DMAPP和吲哚二酮哌嗪的合成 按照文獻(xiàn)[8]的方法，合成供體DMAPP，經(jīng)HPLC測(cè)定，產(chǎn)物純度為96%；按照文獻(xiàn)[9-10]的方法合成二酮哌嗪底物(環(huán)二肽)，經(jīng)HPLC測(cè)定，環(huán)二肽純度為81%～92%。

1.2.2 DNA的分離、PCR擴(kuò)增和載體克隆 依據(jù)文獻(xiàn)[11]的方法，AspergillusfumigatusB5233的UniZAP XR預(yù)制文庫(kù)導(dǎo)入受體細(xì)胞后，進(jìn)行7-DMATS的DNA分離，PCR擴(kuò)增，片段長(zhǎng)度為1 425 bp，包含Afu3g12930的整個(gè)編碼序列，引物為7-dmats-1(5′-CACCATGGCCATCGGAGCCGAGAT-3′)，和7-dmats-2(5′-TGCAGATCTGCTGTACACCCGGAG-3′)。其中粗體字母表示插入的突變，帶下劃線字母表示限制性位點(diǎn)，NcoI位于7-dmats-1的起始密碼子，BglII位于7-dmats-2的預(yù)期終止密碼子。然后將PCR片段克隆到pGEM-T中，得到質(zhì)粒pLW39，其序列通過(guò)遺傳分析儀經(jīng)過(guò)測(cè)序得到驗(yàn)證。創(chuàng)建表達(dá)載體pLW40，用限制酶NcoI和BglII消化pLW39之后，將得到的1 418 bp的NcoI-BglII片段直接連接到pQE60中，pQE60提前已用NcoI和BglII消化過(guò)。獲得含有7-DMATS基因的質(zhì)粒pLW40，用于蛋白質(zhì)表達(dá)和純化。

1.2.3 蛋白質(zhì)的表達(dá)、純化和鑒定 將pLW40轉(zhuǎn)化至大腸桿菌XL1 Blue MRF’中，重組子形成后，接種于含液態(tài)Luria-Bertani(LB)培養(yǎng)基的錐形瓶中，補(bǔ)充羧芐青霉素(終濃度50 μg·mL-1)，37 ℃下生長(zhǎng)至OD600達(dá)0.6。加異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至終濃度為0.8 mmol·L-1，37 ℃將細(xì)胞再培養(yǎng)16 h。離心收集菌體，沉淀以2～5 g·mL-1(g濕重)的濃度重懸浮于裂解緩沖液(10 mmol·L-1咪唑，50 mmol·L-1NaH2PO4和300 mmol·L-1NaCl，pH 8.0)中，加溶菌酶(終濃度1 mg·mL-1)，冰上孵育30 min，以200 W的頻率超聲處理6次，每次10 s，裂解液在4 ℃以14 000 g離心30 min。用Ni-NTA瓊脂糖樹(shù)脂(Qiagen)進(jìn)行親和層析，純化重組融合蛋白，用洗脫液(50 mmol·L-1NaH2PO4，300 mmol·L-1NaCl，250 mmol·L-1咪唑，pH 8.0)洗脫收集，經(jīng)NAP-5柱(50 mmol·L-1Tris-HCl，15%甘油，pH 7.5，平衡)交換緩沖液，SDS-PAGE 鑒定收集得目的蛋白。

1.2.4 酶催化合成反應(yīng)、產(chǎn)物分析、分離和結(jié)構(gòu)鑒定 酶催化合成反應(yīng)總體積10 mL，包含50 mol·L-1Tris-HCl，5 mmol·L-1CaCl2、1 mmol·L-1DMAPP，1 mmol·L-1底物和50 μg(0.9 mmol·L-1)7-DMATS，pH 7.5，溫度 37 ℃，反應(yīng)16 h，加10 μL三氯乙酸(1.5 mmol·L-1)終止反應(yīng)，離心(15 000 g，10 min，4 ℃)除去蛋白質(zhì)。通過(guò)HPLC(Agilent 1200，RP18-column，10 mm×250 mm，5 μm，1.0 mL·min-1)分析酶促產(chǎn)物，含0.1%三氟乙酸(溶劑A)和甲醇(溶劑B)作為溶劑，從50%到100%的溶劑B進(jìn)行梯度洗脫10 min，100%溶劑B洗滌10 min后，50%溶劑B平衡色譜柱10 min，紫外檢測(cè)器設(shè)置波長(zhǎng)277 nm。分離酶產(chǎn)物，使用酶產(chǎn)物分析相同的HPLC條件，流速為2.5 mL·min-1，檢測(cè)到的產(chǎn)物的峰面積與產(chǎn)物和底物的總和之比來(lái)計(jì)算酶反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率。收集后真空除去溶劑，凍干除水，得產(chǎn)物。核磁共振法(1H-NMR，500 MHz)鑒定其結(jié)構(gòu)，電噴霧離子化質(zhì)譜(ESI-MS)鑒定其分子量。

1.2.5 分子對(duì)接 使用結(jié)構(gòu)相似的蛋白FgaPT2(PDB ID：3I4X)作為同源模板，建立 7-DMATS的同源性模型。為了考慮底物結(jié)合袋中的氫鍵網(wǎng)絡(luò)，在模型構(gòu)建過(guò)程中還包括了底物分子。采用Ledock軟件完成對(duì)接，對(duì)接成功后，按照對(duì)接能量排序，選取最優(yōu)構(gòu)象，采用Pymol 1.5分析對(duì)接結(jié)果，并繪制分子對(duì)接圖。

1.2.6 細(xì)胞毒性測(cè)定 MTT法[12]測(cè)定異戊烯化的吲哚二酮哌嗪生物堿對(duì)3種癌細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用。將待測(cè)物溶于5%的DMSO，配成濃度為2 mg·mL-1的母液，用培養(yǎng)基將其稀釋成6個(gè)不同的濃度。將4.0×103mL-1的細(xì)胞懸液接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔150 μL，設(shè)3個(gè)平行。24 h后，棄掉原培養(yǎng)液，將不同濃度含待測(cè)物的培養(yǎng)液加入培養(yǎng)板內(nèi)，每孔150 μL，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照。48 h后，棄掉原來(lái)的培養(yǎng)基，并向每孔加入20 μL MTT溶液和150 μL新鮮培養(yǎng)基，培養(yǎng)4 h檢測(cè)。波長(zhǎng)490 nm下測(cè)定吸光值(A)，計(jì)算抑制率，公式如下，運(yùn)用SPSS 19計(jì)算半數(shù)抑制濃度(IC50)。

IC50=[(Acontrol-Atest)/Acontrol]× 100% 其中：Acontrol為對(duì)照組的吸光度，Atest為樣品組的吸光度。

1.2.7 酶催化條件優(yōu)化 為了研究活性最高的產(chǎn)物cyclo-L-7-dimethylallyl-Trp-L-Pro(7b)的7-DMATS的酶催化合成最佳反應(yīng)條件，分別考察反應(yīng)時(shí)間、pH、溫度、二價(jià)離子。優(yōu)化反應(yīng)時(shí)間為8～24 h；優(yōu)化pH，設(shè)置各種反應(yīng)緩沖液中進(jìn)行酶促反應(yīng)，反應(yīng)緩沖液pH為4.0～6.0(檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液)、6.0～8.0(Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液)、7.0～9.0(Tris-HCl緩沖液)和10.0～11.0(Na2CO3-NaHCO3緩沖液)；優(yōu)化反應(yīng)溫度，在不同溫度(5～50 ℃)下進(jìn)行酶促反應(yīng)；測(cè)試二價(jià)離子對(duì)酶活性的影響，分別添加最終濃度為5 mmol·L-1的不同陽(yáng)離子Mg2+、Ca2+、Mn2+、Fe2+、Ba2+、Zn2+、Cu2+。所有酶促反應(yīng)均以DMAPP為供體，cyclo-L-Trp-L-Pro(7a)為底物進(jìn)行，試驗(yàn)重復(fù)3次，并對(duì)酶混合物進(jìn)行HPLC分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 7-DMATS蛋白的表達(dá)和純化

37 ℃下，0.8 mmol·L-1IPTG誘導(dǎo)攜帶pLW40的大腸桿菌細(xì)胞。通過(guò)SDS-PAGE判斷，用Ni-NTA瓊脂糖將His6-7-DMATS純化至表觀均勻性(圖1)，每升培養(yǎng)物獲得5 mg純化的His6-tagged 7-DMATS的蛋白。觀察到的分子質(zhì)量為50 ku，這與His6-7-DMATS的54 ku的計(jì)算值非常吻合。

2.2 C-7異戊烯取代的吲哚二酮哌嗪的結(jié)構(gòu) 鑒定

經(jīng)7-DMATS酶催化，合成了7個(gè)C-7異戊烯取代的吲哚二酮哌嗪，以合成產(chǎn)率為指標(biāo)，經(jīng)HPLC分析(圖2)發(fā)現(xiàn)7-DMATS酶對(duì)底物有一定的選擇性，以cyclo-L-Trp-L-Leu(3a)為底物，轉(zhuǎn)化率最高(30.2%)，其次是以cyclo-L-Trp-L-Trp(6a)和cyclo-L-Trp-L-Tyr(5a)和cyclo-L-Trp-L-Pro(7a)為底物，轉(zhuǎn)化率分別為(28.5%、28.1%和25.4%)，以cyclo-L-Trp-L-Phe(4a)為底物，轉(zhuǎn)化率最低(11.8%)。ESI-MS數(shù)據(jù)分析，分離到的所有產(chǎn)物的分子量均比各自底物的分子量大68，與單異戊烯基的分子量吻合，表明其結(jié)構(gòu)中存在單異戊烯基。將產(chǎn)物1b-7b與底物1a-7a的1H-NMR的比較，證明芳香族質(zhì)子H-7的雙峰信號(hào)消失，而增加異戊烯基的化學(xué)位移信號(hào)δH3.41-3.54(1H，d，H-1′)，5.24-5.43(1H，t，H-2′)，1.58-1.79(3H，s，H-4′)和1.49-1.75(3H，s，H-5′)，同時(shí)H-1′的化學(xué)位移H-1′ (δH3.49-3.54)也證明其與芳香族C原子連接[13]。

與已發(fā)表的文獻(xiàn)的核磁數(shù)據(jù)比較，1b和2b的1H-NMR中異戊烯化的吲哚環(huán)部分?jǐn)?shù)據(jù)與Fan等[14]催化合成的異戊烯化的色氨酸衍生物類似。3b、5b和7b的1H-NMR數(shù)據(jù)與Wunsch等[15]采用His6-CdpC7PT催化合成的異戊烯化的吲哚二酮哌嗪數(shù)據(jù)一致。4b和6b的1H-NMR數(shù)據(jù)與Zou等[16]采用His6-CTrpPT催化合成的異戊烯化的吲哚二酮哌嗪結(jié)果基本吻合。這些數(shù)據(jù)也驗(yàn)證本研究酶催化產(chǎn)物結(jié)構(gòu)的正確性，合成的化合物經(jīng)ESI-MS和1H-NMR表征分析，詳細(xì)數(shù)據(jù)如下。

2.3 分子對(duì)接結(jié)果分析

圖3為1a-7a進(jìn)行的多組構(gòu)象中能量最低的構(gòu)象與受體蛋白(7-DMATS)的對(duì)接3D圖，7種目標(biāo)化合物均很好地結(jié)合到蛋白受體中，色氨酸的吲哚環(huán)的H原子是共同的活性位點(diǎn)，分別與蛋白受體的GLU89、LEU81等氨基酸殘基形成氫鍵，使受體蛋白與目標(biāo)底物結(jié)合更加牢固，其他氫鍵如表2所示，這也是7-DMATS可以催化底物異戊烯化的原因所在。

分子力學(xué)泊松-波爾茲曼表面積(Molecular mechanics Poisson-Boltzmann surface area，MM-PBSA)法是一種常用于受體與配體分子對(duì)接后計(jì)算結(jié)合自由能值(binding free energy，ΔGbind)的方法[17]，通過(guò)4個(gè)組分計(jì)算結(jié)合自由能：范德華力貢獻(xiàn)(ΔGvdw)，靜電貢獻(xiàn)(ΔGele)，去溶劑化極性部分(ΔGpolar)和非極性貢獻(xiàn)(ΔGnonpolar)，ΔGbind值越低說(shuō)明受體與配體之間的親和力越高[18]。吲哚二酮哌嗪1a-7a和 7-DMATS進(jìn)行分子對(duì)接和優(yōu)化后，結(jié)合情況見(jiàn)圖3，對(duì)接復(fù)合物的計(jì)算結(jié)合自由能見(jiàn)表1，通過(guò)pymol統(tǒng)計(jì)1a-7a和7-DMATS相互作用的疏水氨基酸殘基見(jiàn)表1。

表1 配體與7-DMATS靶點(diǎn)殘基作用情況Table 1 Relations between ligands and residues of 7-DMATS

遵循對(duì)接能量ΔGbind低，結(jié)合鍵的數(shù)量和類型的原則，可以得出7-DMATS對(duì)目標(biāo)底物的催化效果為3a>6a>5a>7a>1a>2a>4a，而合成試驗(yàn)中1b-7b的產(chǎn)率排序?yàn)?b(30.2%)>6b(28.5%)>5b(28.1%)>7b(25.4%)>1b (23.6%)>2b(20.2%)>4b(11.8%)。試驗(yàn)數(shù)據(jù)和分子對(duì)接模型分析的吻合性，也證實(shí)這一對(duì)接模型的準(zhǔn)確性，為進(jìn)一步7-DMATS的酶催化反應(yīng)提供一定的預(yù)測(cè)模型。此外，從結(jié)構(gòu)來(lái)看，組成底物二酮哌嗪的除色氨酸的另一個(gè)氨基酸取代基為異丙基(3a)，其分子對(duì)接效果最佳，這可能由于其空間位阻小，易于進(jìn)攻受體蛋白的原因，取代基為苯基(4a)時(shí)，分子對(duì)接效果最差，這與分子間存在較大的空間位阻有關(guān)。

2.4 抗腫瘤活性分析

抗腫瘤活性結(jié)果表明(表2)，吲哚環(huán)上的異戊二烯基明顯導(dǎo)致細(xì)胞毒性的增加，非異戊烯化的吲哚二酮哌嗪對(duì)3種癌細(xì)胞(人源性宮頸癌細(xì)胞HeLa，人源性肺癌細(xì)胞A549，人源性乳腺癌細(xì)胞 MCF-7)的IC50值>100 μmol·L-1(試驗(yàn)設(shè)置的最高濃度)，而所有測(cè)試的異戊烯化的酶產(chǎn)物對(duì)3種細(xì)胞系的毒性都比原底物高。對(duì) MCF-7的IC50值在中低微摩爾范圍內(nèi)，而對(duì)HeLa和A549細(xì)胞的IC50則在較高微摩爾范圍內(nèi)，特別是化合物cyclo-L-7-dimethylallyl-Trp-L-Pro(7b)對(duì)給定的細(xì)胞系均顯示出最高的細(xì)胞活性，表明7b中的脯氨酸部分組成的吡咯環(huán)有助于提高腫瘤細(xì)胞的抑制活性。

表2 吲哚二酮哌嗪(1a-7a)以及異戊烯化吲哚二酮哌嗪(1b-7b)的抗癌細(xì)胞增殖活性IC50值Table 2 IC50 values of non-prenylated and prenylated tryptophan-containing cyclic dipeptides against HeLa，A549，and MCF-7 cell lines μmol·L-1

2.5 最優(yōu)酶催化條件分析

對(duì)活性最高的產(chǎn)物cyclo-L-7-dimethylallyl-Trp-L-Pro(7b)的7-DMATS的酶催化合成最佳反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化(圖4)，為了更準(zhǔn)確反應(yīng)出影響酶反應(yīng)的因素，首先確定酶促反應(yīng)最佳時(shí)間為16～18 h，積累反應(yīng)時(shí)間達(dá)到18 h以上，時(shí)間積累量對(duì)轉(zhuǎn)化率影響不大，確定后續(xù)反應(yīng)時(shí)間采用18 h。酶反應(yīng)的影響因素試驗(yàn)結(jié)果反應(yīng)出 7-DMATS的酶活性受溫度和pH的強(qiáng)烈影響，最佳反應(yīng)溫度為35 ℃左右，在高于40 ℃時(shí)，活性迅速下降，最佳pH控制在8.0左右(Tris-HCl緩沖液)。而7-DMATS活性對(duì)二價(jià)金屬離子呈現(xiàn)出強(qiáng)依賴性，測(cè)試的不同的二價(jià)陽(yáng)離子對(duì)于終產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化率偏差很大，影響順序?yàn)镸g2+>Ca2+>Mn2+>Fe2+>Ba2+>Zn2+，而在Cu2+存在條件下未檢測(cè)到產(chǎn)物，這一結(jié)果與已報(bào)道的異戊烯化的黃酮的反應(yīng)類似[19]。

3 結(jié) 論

本研究以L-色氨酸系的7個(gè)二酮哌嗪為底物(1a-7a)，經(jīng)7-DMATS催化合成7個(gè)異戊烯化的吲哚二酮哌嗪(1b-7b)，通過(guò)合成率和HPLC分析，可以發(fā)現(xiàn)7-DMATS對(duì)底物有一定的選擇性，利用分子對(duì)接分析7-DMATS對(duì)底物選擇性催化的原因，也驗(yàn)證酶催化效率的差異性；采用MTT法測(cè)定1b-7b對(duì)3種腫瘤細(xì)胞(HeLa、A549、MCF-7)的抑制活性，7個(gè)異戊烯基化的吲哚二酮哌嗪表現(xiàn)出一定的抑制腫瘤細(xì)胞的活性，其中確定7b的活性最高，單因素法得出其最佳酶催化條件為：反應(yīng)時(shí)間18 h，溫度為35 ℃，pH為8.0(Tris-HCl緩沖液)，添加5 mmol·L-1的MgCl2。這些結(jié)果為后續(xù)酶催化合成更多位點(diǎn)的異戊烯基化的吲哚二酮哌嗪提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

近年來(lái)，利用芳香族異戊烯基轉(zhuǎn)移酶的酶催化合成法獲得一系列異戊烯基化的吲哚類生物堿，此途徑可作為化合物修飾的新策略。但是，酶催化合成法對(duì)于底物的特異性以及酶促反應(yīng)條件都有著嚴(yán)格的要求。目前，很多學(xué)者普遍采用增加酶量，延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間，達(dá)到有效合成化合物的目的，筆者的研究證實(shí)，這些條件都有著一定的局限性。提升產(chǎn)率的更精確方案，應(yīng)該建立多因素試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)模型[20]去進(jìn)一步探索，這也是筆者進(jìn)一步研究的方向。