連作對馬鈴薯酚酸類自毒物質(zhì)及根際真菌群落的影響

龔 靜，馬海艷，鄭順林,2，向竹清，熊 湖，黃 強，方小婷

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，農(nóng)業(yè)部西南作物生理生態(tài)與耕作重點實驗室,成都 611130；2.農(nóng)業(yè)部薯類作物遺傳育種重點實驗室，成都久森農(nóng)業(yè)科技有限公司,四川新都 610500)

馬鈴薯成為中國第四大主糧后，需求量增加，與可選倒茬作物低效益間的矛盾導(dǎo)致連作障礙越發(fā)明顯[1]。自毒物質(zhì)積累和根際微生物群落結(jié)構(gòu)的改變是導(dǎo)致連作障礙發(fā)生的兩個重要因素[2-3]。目前，烤煙[4]、花生[5]、甜茶[6]、三七[7]等作物中證實對羥基苯甲酸、香草酸、丁香酸、阿魏酸等化合物為主要的自毒物質(zhì)，連作后土壤中細(xì)菌數(shù)量下降，真菌數(shù)量增加[8]，包括青霉、曲霉、鐮霉、粉孢霉等非病原性腐生菌及寄生性菌[9]。土壤中自毒物質(zhì)與微生物存在一定相關(guān)性[10]，研究表明，酚酸積累促進(jìn)了人參銹腐病菌菌絲生長，使人參爆發(fā)銹腐病[11]，其通過改變微生物數(shù)量和種群的結(jié)構(gòu)間接影響植物生長[12]，造成經(jīng)濟損失。目前連作條件下馬鈴薯根際土壤中酚酸類物質(zhì)及真菌群落間的相關(guān)性還有待進(jìn)一步研究。本研究采用HPLC法和高通量測序技術(shù)，研究了不同連作季馬鈴薯根際土壤中化感物質(zhì)與真菌群落的變化以及分析二者的相關(guān)性，旨在對馬鈴薯連作下根際土壤中化感類物質(zhì)及微生物群落變化有更深刻的認(rèn)識，為西南地區(qū)馬鈴薯生產(chǎn)及農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)可持續(xù)性發(fā)展提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試材為‘費烏瑞它’，選取30～45 g均勻一致的原種做種薯。

1.2 試驗設(shè)計

于2017 年8 月下旬至2019 年8 月上旬在四川農(nóng)業(yè)大學(xué)三教樓頂溫棚開展盆栽試驗，土壤以蛭石與珍珠巖3∶1(體積比)進(jìn)行配比，試驗盆規(guī)格為37 cm×37 cm×24 cm，每盆4 kg基質(zhì)土。采用單因素隨機區(qū)組試驗設(shè)計，在連作1 季的土壤上繼續(xù)種植第2 季，連作2 季的基礎(chǔ)上繼續(xù)種植第3 季(LZ3)，以此類推，連續(xù)種植5 季，每季重復(fù)12 次，共計60 盆，具體試驗設(shè)計見表1。每季馬鈴薯收獲后清理盆內(nèi)土壤中殘體、殘根，待出苗約1 cm施加改良赫格蘭德營養(yǎng)液提供植株營養(yǎng)，每4 d一次，直到馬鈴薯塊莖形成期，期間管理同當(dāng)?shù)卮筇锕芾怼?/p>

表1 試驗設(shè)計Table 1 Experimental design

1.3 采樣方法及測定指標(biāo)

于連作5 季時馬鈴薯塊莖成熟期采用抖根法收集種植1、3、5 季根際土壤(0～20 cm)，將根系完整取出后，抖落并棄去與根系聯(lián)系較松的土壤，再用小刷子輕輕將與根系密切接觸的土壤刷入到采樣袋中，混合均勻后用無菌塑封袋分裝為2 份，一份保存于-80 ℃冰箱，用于高通量測序；一份風(fēng)干后用于酚酸測定。

采用高效液相色譜法(HPLC)測定土壤中酚酸含量及種類，具體參考熊湖等[13]的測定方法，略有改進(jìn)；總酚含量采用福林酚比色法[14]測定；土壤pH采用電位法[15]；真菌群落測定由上海微分基因公司完成測序。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

真菌群落分析參考上海微分基因公司數(shù)據(jù)處理方法，其他采用Excel 2007進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，DPS 5.0進(jìn)行方差分析(LSD法)。

2 結(jié)果與分析

2.1 連作對馬鈴薯根際土壤中酚酸類物質(zhì)的 影響

表2可知，對羥基苯甲酸與阿魏酸含量呈上升趨勢，丁香酸、香豆酸和總酚含量呈先上升后下降趨勢，土壤pH不斷下降。其中LZ5處理下對羥基苯甲酸與阿魏酸含量顯著(P<0.05)高于LZ1和LZ3；丁香酸與香豆酸含量在LZ3時顯著(P<0.05)高于LZ1和LZ5；LZ3和LZ1間總酚含量達(dá)顯著差異；LZ5土壤pH顯著低于LZ1和LZ3。因此，連作對馬鈴薯根際土壤中酚酸和土壤pH有較為顯著的影響。

表2 馬鈴薯根際土壤中酚酸類物質(zhì)含量及Table 2 Content and pH of phenolic acids in potato rhizosphere soil mg·g-1

2.2 馬鈴薯連作對根際土壤中真菌群落的影響

2.2.1 測序結(jié)果分析 對9 個連作根際土壤進(jìn)行質(zhì)控后得到408 251個優(yōu)質(zhì)序列，在97%相似度下進(jìn)行OTU聚類后得到1 584 個OTUs。

由圖1可以看出，3個處理中OTU總數(shù)分別為251 個、310 個、219 個，共780 個。其中LZ1和LZ3共有OTU種類151 種，與LZ5共有114 種，LZ3和LZ5共138 種，3 個根際土壤中共同OTU種類為93 個，表明不同連作處理間的組成和結(jié)構(gòu)存在著差異。

2.2.2 土壤真菌多樣性 由表3可知，Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)趨勢一致，均為先增加后下降，Observed Species指數(shù)呈現(xiàn)先下降后升高的趨勢。LZ3處理下Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)與LZ5差異不顯著，顯著高于LZ1；LZ3時Observed Species指數(shù)顯著(P<0.05)低于其他兩季。因此，不同連作下真菌多樣性差異較大。

表3 馬鈴薯根際土壤中真菌多樣性Table 3 Fungi diversity in potato rhizosphere soil

2.2.3 土壤真菌群落結(jié)構(gòu) 篩選出豐度排名前20真菌進(jìn)行統(tǒng)計分析，連作土壤中共檢出6 個真菌門群落(表4)，包括子囊菌門(Ascomycota)、擔(dān)子菌門(Basidiomycota)、絲孢菌門(Mortierellomycota)、小孢子菌門(Calcarisporiellomycota)、毛霉門(Mucoromycota)、球囊菌門(Glomeromycota)，子囊菌門不同連作處理占比均高于80%，LZ1檢測出小孢子菌門，LZ5中未檢測出球囊菌門。

表4 馬鈴薯根際土壤中真菌群落結(jié)構(gòu)及豐度Table 4 Community structure and abundance of fungi in potato rhizosphere soil %

LZ1的優(yōu)勢菌為節(jié)叢孢屬，占比為62.68%，其次為被孢霉屬、枝孢霉屬、鐮刀菌屬；節(jié)叢孢屬、枝孢霉屬、被孢霉屬、鐮刀菌屬、曲霉屬為LZ3的優(yōu)勢菌屬，分別占比19.49%、17.89%、17.64%、14.60%、9.41%；LZ5時盤菌屬為優(yōu)勢真菌，占比達(dá)69.37%，其次為璉格孢屬、枝孢霉屬、其他未知菌，表明LZ1和LZ3間真菌群落組成類型相似，但比例差異較大，而LZ3與LZ5間組成差異較大。

2.2.4 土壤真菌群落的主成分(PCoA)分析 采用主成分法分析不同連作處理土壤真菌群落組成結(jié)構(gòu)及距離差異(圖2)。結(jié)果顯示，2 個主成分的方差累積貢獻(xiàn)率為88.41%，第一軸(PC1)解釋樣品中63.83%的變量，第二軸(PC2)解釋了 24.58%的變量。LZ1、LZ3、LZ5分別分布在第三、二、四象限，LZ3和LZ1間橫坐標(biāo)間距離較短，進(jìn)一步證明這兩季間差異較小，群落結(jié)構(gòu)相似，與LZ5分布較遠(yuǎn)，群落結(jié)構(gòu)差異較大，說明不同連作條件對土壤中真菌群落結(jié)構(gòu)組成的影響差異明顯，連作3 季可能是連作障礙發(fā)生的臨界點。

2.3 相關(guān)性分析

通過對屬水平下優(yōu)勢菌種豐度與根際土壤中酚酸及pH進(jìn)行相關(guān)關(guān)系分析(表5)，丁香酸與被孢霉屬之間存在顯著(P<0.05)正相關(guān)關(guān)系，與璉格霉屬之間存在極顯著(P<0.01)正相關(guān)關(guān)系；香草酸與盤菌屬之間存在極顯著(P<0.01)正相關(guān)關(guān)系，與被孢霉屬之間存在顯著(P<0.05)正相關(guān)關(guān)系；阿魏酸與節(jié)叢孢屬之間存在顯著(P<0.05)正相關(guān)關(guān)系，與盤菌屬之間存在顯著(P<0.05)負(fù)相關(guān)關(guān)系。

表5 屬水平下優(yōu)勢菌種豐度與土壤酚酸含量及pH的相關(guān)性Table 5 Correlation between abundance of dominant strains and content and pH of soil phenolic acid at genus level

3 討 論

3.1 連作對馬鈴薯根際酚酸類物質(zhì)的影響

前人在西瓜[16]、西洋參[17]連作土壤中證明棕櫚酸、香豆酸等多種酚類化合物的積累是作物連作障礙產(chǎn)生的重要原因之一[18]。本研究中，連作根際土壤檢測出對羥基苯甲酸、丁香酸、香豆酸、阿魏酸等4種酚酸，連作后對羥基苯甲酸、阿魏酸不斷增加，丁香酸、香豆酸在連作3 季達(dá)到最大值，總酚含量反應(yīng)一致，說明引起馬鈴薯連作障礙的酚酸不一定含量高，可能是丁香酸或其他未發(fā)現(xiàn)的酚酸，還有待進(jìn)一步研究，連作后根際土壤pH下降，土壤酸化，病原菌滋生，植物抵御病蟲害的能力下降[19]。

3.2 連作對馬鈴薯根際土壤中真菌群落的影響

土壤微生物多樣性是土壤環(huán)境的健康狀況的重要指標(biāo)[20]。本研究顯示，土壤中真菌多樣性隨連作加深呈先增加后下降的趨勢，這與在丹參、花生、煙草等連作土壤中真菌多樣性研究一致[21-23]，與大豆[24]不一致，但與丁香酸、香豆酸趨勢相同，推測可能和這些根際分泌物積累變化有關(guān)。

某些特定植物病原微生物富集會引起作物感病，如鐮刀菌富集后引起花生的根腐病[25]。本研究表明，連作土壤中子囊菌門為優(yōu)勢種群。節(jié)叢孢屬同為連作1 季與連作3 季優(yōu)勢菌群，兩季的真菌結(jié)構(gòu)類似，連作5 季的優(yōu)勢真菌主要為盤菌屬，也包括引起馬鈴薯塊莖腐病的鐮刀霉屬和早疫病的璉格孢霉屬，說明連作改變了土壤真菌群落結(jié)構(gòu)，連作3 季可能是一個臨界點，在此之后有害真菌豐度增加，真菌群落結(jié)構(gòu)的失衡后有害真菌富集也是連作障礙產(chǎn)生的重要因素。

自毒物質(zhì)的積累與土壤微生物存在密切的聯(lián)系[26]。根際微生物對根際分泌的自毒物質(zhì)代謝和降解使其發(fā)生改變，進(jìn)一步影響土壤微生物的種類和分布[27]。本研究中酚酸類物質(zhì)與真菌群落結(jié)構(gòu)關(guān)系密切，不同類型真菌豐度群落對不同酚酸的反映不一致，丁香酸、香豆酸、阿魏酸對鏈格孢屬、被孢霉屬等真菌豐度表現(xiàn)為正相關(guān)性，可能是這幾種酚酸為微生物提供了能源，加快了新陳代謝，增加了微生物數(shù)量[28]，如苯甲酸、肉桂酸增加了枯萎病的發(fā)病幾率[29]。阿魏酸與盤菌屬間表現(xiàn)為負(fù)相關(guān)，可能是因為阿魏酸不是盤菌屬的主要碳源，因此不利于該類真菌的繁殖。綜上，馬鈴薯根際分泌物改變了根際真菌群落結(jié)構(gòu)。

4 結(jié) 論

馬鈴薯連作后根際土壤中4 種酚酸類物質(zhì)趨勢不同，阿魏酸、對羥基苯甲酸在連作5 季含量最高，丁香酸、香豆酸含量在連作3 季最高。

連作改變根際微生物群落，使真菌多樣性增加，連作3 季后具有最高多樣性，連作增加了病菌的數(shù)量和豐度，連作5 季的優(yōu)勢菌包括盤菌屬、鐮刀菌屬和璉格孢霉屬，而連作1 季和3 季間真菌結(jié)構(gòu)更相似。

綜上所述，連作3季為連作障礙發(fā)生的臨界點，而根際自毒物質(zhì)和土壤微生物群落的改變存在關(guān)聯(lián)性，為今后緩解馬鈴薯連作障礙提供了理論依據(jù)。