抗纖益心方對擴張型心肌病大鼠心肌纖維化相關(guān)蛋白表達的影響*

王振濤，邊汝濤，楊鳳鳴，劉嫄淑，吳 鴻

(1. 河南省中醫(yī)院，鄭州 450003； 2. 河南中醫(yī)藥大學(xué)，鄭州 450046)

擴張型心肌病(dilated cardiomyopathy，DCM)是一類以單側(cè)或雙側(cè)心室擴大并伴有收縮功能障礙為主要特征的心肌疾病，我國發(fā)病率約13～84/10萬，5年病死率約為42.24%[1]。DCM的主要病理變化為心室重構(gòu)，而心肌纖維化是心室重構(gòu)的重要病理變化，故抑制心肌纖維化是治療DCM的一個重要方向[2]。心肌成纖維細胞的增殖、轉(zhuǎn)分化在心肌纖維化中具有重要地位[3]，在轉(zhuǎn)分化的心肌成纖維細胞內(nèi)可進一步激活α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)、結(jié)締組織生長因子(connective tissue growth factor，CTGF)、I型膠原蛋白(Collagen I，CoI-1)等心肌纖維化相關(guān)因子，從而導(dǎo)致心肌纖維化的發(fā)生發(fā)展[4]，而心房利鈉肽(atrialnatriureticpeptide，ANP)、B型利鈉肽(brain natriuretic peptide，BNP)是心功能變化的重要指標。

抗纖益心方是臨床治療擴張型心肌病的有效方劑[5]。前期基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)，抗纖益心方具有改善DCM模型大鼠心室重構(gòu)的作用[6-7]，但其對心肌纖維化的作用機制研究仍未明確。本研究通過DCM大鼠模型探討抗纖益心方抑制心肌纖維化的作用及其可能機制。

1 材料與方法

1.1 動物

SPF級Wister雄性大鼠100只，出生后4周，體質(zhì)量(52.31±5.65)g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，合格證號SYXK(豫)-2016-0006)。所有大鼠均飼養(yǎng)于河南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院中心實驗室SPF級動物實驗中心，室溫在(22±3)℃，濕度控制在(45±5)%，12 h光暗循環(huán)。本研究由河南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院倫理委員會批準，本單位倫理學(xué)批件無批號。

1.2 藥物

抗纖益心方藥物組成：紅參12 g，黃芪30 g，茯苓15 g，白術(shù)15 g，丹參15 g，升麻9 g，麥冬12 g，澤蘭15 g，益母草15 g。以上配方顆粒購自四川新綠色科技發(fā)展有限公司，藥物質(zhì)量采用 GMP 認證(證書編號SC20150037)。將1劑中藥配方顆粒溶于煮沸的20 mL生理鹽水中充分攪拌均勻，再用微波爐煮沸2次，使藥物完全溶解即為中藥原液，其濃度為0.57 g/ml,保存于4 ℃?zhèn)溆谩？ㄍ衅绽徸陨虾Ｉ纤幮耪x藥廠有限公司(批號63170904)， 25 mg/片；呋喃唑酮片購自天津力生制藥股份有限公司(批號12020160)，100 mg/片。

1.3 主要試劑

Masson三色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司，貨號G1340)；α-SMA、CoI-1抗體(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，貨號14395-AP、14695-1-AP)；CTGF抗體(武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，貨號E-AB-12339)；GAPDH(武漢博士德生物技術(shù)有限公司，貨號BM3876)；辣根過氧化物標記羊抗免疫球蛋白、辣根過氧化物標記羊抗鼠免疫球蛋白(武漢塞維爾生物科技有限公司，貨號GB23204、GB23301)；SDS-PAGE凝膠制備試劑盒(西安晶彩生物科技有限公司，貨號JC-PE001)；PVDF膜(美國Millipore公司，貨號IPHV0010)；RNA提取試劑盒(上海生工生物工程股份有限公司，貨號B518651)；cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara Bio，貨號6210 A)；熒光定量試劑盒(Takara Bio，貨號RR430 A)。

1.4 主要儀器

小動物超聲儀(德國西門子股份公司，型號：Acuson Cypress)，石蠟切片機(湖北慧達儀器公司，型號：HD-325)；組織包埋機(湖北慧達儀器公司，型號：HD-310)；凝膠電泳儀(美國伯樂，型號：164-5070)、光學(xué)顯微鏡(日本OLYMPUS公司，型號：CKX41)；攝影顯微鏡(德國萊卡公司，型號：ICES-003)；CFX96實時熒光定量PCR儀(美國伯樂，型號：185-2148)。

2 方法

2.1 DCM大鼠模型建立

100只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機分為造模組90只和正常組10只，按照文獻[8]和前期研究方法復(fù)制DCM大鼠模型，在造模組大鼠飲用水中加呋喃唑酮(按1 kg去離子水加700 mg呋喃唑酮)喂養(yǎng)。造模組大鼠連續(xù)10周自由飲用呋喃唑酮水溶液，正常組大鼠同期自由飲用去離子水，造模期間造模組及正常組均無死亡。10周后對造模大鼠進行心臟超聲心動圖檢查，造模成功大鼠室壁運動符合DCM影像學(xué)改變，且射血分數(shù)與正常組有明顯統(tǒng)計學(xué)差異。

2.2 分組及給藥

將造模成功大鼠隨機分為模型組、抗纖益心方高劑量組、抗纖益心方中劑量組、抗纖益心方低劑量組和卡托普利組5組各10只。根據(jù)《藥理實驗方法學(xué)》提供的計算方法，抗纖益心方高劑量組灌胃量為18.8 g/(kg·d)、中劑量組9.4 g/(kg·d)、低劑量組4.7 g/(kg·d)，卡托普利組灌胃10.125 mg/(kg·d)，正常組、模型組灌服等量的生理鹽水[9]。同時模型組、抗纖益心方各治療組及卡托普利組大鼠繼續(xù)自由飲用呋喃唑酮水溶液，以保證致病因素的持續(xù)存在。

2.3 取材

藥物干預(yù)4周后，用4%水合氯醛對大鼠進行腹腔注射麻醉，檢測各組大鼠心臟超聲射血分數(shù)(ejection fraction，EF)、左室短軸縮短率(fractional shortening，F(xiàn)S)等相關(guān)指標后處死動物，開胸迅速取出心臟。部分大鼠心肌組織用PBS洗滌殘留血液后，用組織剪剪切成 1 cm3左右的小塊，液氮速凍后保存于-80 ℃冰箱中備用。另取部分大鼠心肌組織在預(yù)冷的生理鹽水中沖洗殘留的血液成分，然后用4%多聚甲醛溶液固定，24 h后進行組織脫水、包埋、切片。

2.4 Masson染色觀察大鼠心肌纖維化情況

組織切片后脫蠟至水，依次用蘇木素染色、分化、返藍、麗春紅品染色、苯胺藍染色、脫水、二甲苯透明，中性樹脂膠封片。在顯微鏡下觀察各組切片染色情況，肌纖維呈紅色，膠原纖維呈藍色，隨機選取5個視野留取圖像進行分析。

2.5 Real-time PCR法檢測大鼠心肌組織ANP、BNP、CTGF、α-SMA mRNA的表達

表1示，取各組大鼠心肌組織50 mg加入到Buffer Rlysis-AG溶液中，勻漿后靜置5 min，12000 r/min離心5 min，離心2次，取上清加入1/2體積的無水乙醇，混勻后加入到組織柱式RNA提取柱中，按照操作步驟依次加入GT Solution、NT Solution等溶液，提取總RNA溶液，測定總RNA濃度及純度后逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板行Real-time PCR檢測，以正常組為參照組，β-actin為內(nèi)參，用2-ΔΔCt表示mRNA的相對表達，計算各組的表達量。ANP、BNP、α-SMA、CTGF、β-actin引物由上海生工合成。

表1 ANP、BNP、α-SMA、CTGF、β-actin引物合成序列

2.6 Weston blot法檢測大鼠心肌組織CTGF、α-SMA、CoI-1的表達 取各組大鼠心肌組織30 mg加入200 μL RIPA裂解液中，冰上裂解1 h，4 ℃ 12000 r/min離心10 min，取上清即為總蛋白液。BCA法檢測蛋白濃度，100 ℃金屬浴10 min，冰上靜置10 min，4 ℃ 12000 r/min離心5 min，上清即為上樣液。在SDS-PAGE膠中電泳，電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，轉(zhuǎn)印結(jié)束后取出膜在5%脫脂牛奶中封閉1 h。用5%脫脂牛奶配制孵育抗體：CTGF(1∶1000)、α-SMA(1∶1500)、CoI-1(1∶2000)，4 ℃孵育過夜，TBST洗膜5次，每次5 min，洗膜結(jié)束后用二抗孵育1.5 h，TBST洗膜5次，每次5 min。將條帶放入ELC顯影液，用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析條帶灰度值，用目的蛋白灰度值與內(nèi)參蛋白灰度值的比值表示蛋白相對表達量。

2.7 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 正常組與模型組大鼠心臟超聲檢測結(jié)果

表2示，造模10周后超聲心動圖檢測造模大鼠與正常組心功能，結(jié)果發(fā)現(xiàn)造模成功大鼠心室壁運動幅度降低，舒張末內(nèi)徑(Left ventricular end diastolic diameter，LVEDD)及收縮末內(nèi)徑(Left ventricular end systolic diameter，LVESD)較正常組擴大(P<0.05或P<0.01)，EF降低(P<0.01)，造模成功大鼠共計50只。

表2 模型組與正常組大鼠心臟超聲情況

3.2 抗纖益心方對DCM模型大鼠心功能影響

表3示，與正常組比較，模型組大鼠EF、FS下降(P<0.01)；與模型組比較，抗纖益心方各組及卡托普利組大鼠給予藥物干預(yù)4周，EF、FS較模型組均有明顯升高(P<0.05或P<0.01)，且升高程度與抗纖益心方濃度增加具有明顯的量效關(guān)系。

表3 抗纖益心方對DCM模型大鼠心臟超聲指標EF、FS的影響

3.3 抗纖益心方對DCM模型大鼠心肌組織纖維化的影響

圖1示，在400倍光鏡下，正常組大鼠心肌組織僅見少量的心肌膠原纖維。與正常組比較，模型組心肌組織可見大量藍色心肌膠原纖維增生，心肌纖維化程度顯著加重。與模型組比較，抗纖益心方高、中劑量組及卡托普利組可見藍色心肌膠原纖維明顯減少，而低劑量組仍可見大量心肌膠原纖維增生。

注：1.正常組；2.模型組；3.高劑量組；4.中劑量組；5.低劑量組；6.卡托普利組圖1 各組大鼠心肌組織心肌膠原纖維化Masson染色(400×)

3.4 各組大鼠心肌組織ANP、BNP、α-SMA、CTGF mRNA表達水平

表4示，與正常組比較，模型組ANP、BNP、α-SMA、CTGF mRNA表達水平明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，抗纖益心方高、中劑量組及卡托普利組都有不同程度的降低(P<0.01)，而抗纖益心方低劑量組α-SMA、CTGF mRNA表達水平降低不明顯(P>0.05)。

表4 各組大鼠心肌組織ANP、BNP、α-SMA、CTGF mRNA表達水平比較

3.5 各組大鼠心肌組織CTGF、α-SMA、CoI-1蛋白表達水平

圖2表5示，與正常組比較，模型組α-SMA、CTGF、CoI-1表達水平明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，抗纖益心方高、中劑量組及卡托普利組表達水平都有明顯降低(P<0.05或P<0.01)，而低劑量組降低不明顯(P>0.05)。

表5 抗纖益心方對CTGF、α-SMA、CoI-1蛋白表達水平影響比較

圖2 抗纖益心方對CTGF、α-SMA、CoI-1蛋白表達水平的影響

4 討論

臨床實踐表明，中醫(yī)藥在擴張型心肌病治療中具有良好的療效。中醫(yī)認為本病基本病機為本虛標實，心氣虧虛為基礎(chǔ)，心陽不振為后期之根本，血瘀、水濕為病理產(chǎn)物，是疾病發(fā)展及加重的重要因素，其病位在心，常累及肺、脾、肝、腎等臟腑，故臨床治療多采用益氣、活血、利水等措施[10]。王振濤根據(jù)本病的病因病機自擬具有益氣活血作用的中藥復(fù)方抗纖益心方?？估w益心方在升陷湯及補中益氣湯的基礎(chǔ)上化裁而來，重用黃芪為君藥以補氣，紅參既可補脾胃之氣又可補元氣、肺氣，白術(shù)有燥濕健脾之功效，從而使氣血生化有源；針對本病瘀血水濕停留等實邪，加入丹參、茯苓、益母草、澤蘭等以化瘀利水，諸藥合用使氣血生化有源，瘀血、水濕得化，從而有效治療擴張型心肌病。

心肌纖維化在病理形態(tài)上主要表現(xiàn)為膠原沉積，各型膠原比例失調(diào)，尤其是Ⅰ型、Ⅲ型膠原的比例升高、排列紊亂，同時伴有心肌成纖維細胞的增生[11]。心肌成纖維細胞是調(diào)節(jié)細胞外基質(zhì)合成與降解的主要細胞[12]。血管緊張素Ⅱ、醛固酮、內(nèi)皮素等刺激因子可促進心肌成纖維細胞的增殖及轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細胞，肌成纖維細胞合成分泌膠原蛋白的能力遠大于成纖維細胞，是膠原蛋白合成的主要來源細胞[13]。α-SMA是國際認可的肌成纖維細胞活化的標志性蛋白，肌成纖維細胞可大量合成I、III型膠原蛋白，從而導(dǎo)致膠原代謝異常[14]。CTGF是一種促成纖維細胞分裂和膠原沉積的細胞因子，可介導(dǎo)血管緊張素Ⅱ、TGF-β的部分生物效應(yīng)[15]，從而刺激心肌成纖維細胞增殖和細胞外膠原的沉積，在促進組織纖維化方面起到重要作用。

本次研究結(jié)果顯示，抗纖益心方具有改善DCM模型大鼠心功能的作用，與前期實驗結(jié)果一致[6]?？估w益心方高、中劑量組及卡托普利組可明顯改善大鼠心臟超聲EF、FS值，而低劑量組改善不明顯。抗纖益心方各組及卡托普利組可明顯降低DCM模型大鼠心肌組織中ANP、BNP、α-SMA、CTGF mRNA表達水平，且抗纖益心方高、中劑量組及卡托普利組可顯著降低DCM模型大鼠心肌組織中α-SMA、CTGF、CoI-1蛋白表達水平，而低劑量改善不明顯。綜上所述，抗纖益心方可能通過抑制心肌成纖維細胞的增殖、轉(zhuǎn)分化，從而抑制DCM模型大鼠心肌纖維化的發(fā)展，但其作用途徑仍需今后進一步的深入研究。