血清miR-146a水平與小兒支氣管哮喘發(fā)作期中醫(yī)證型的相關(guān)性分析*

李香玉，周 旋，陳莉麗

(長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院， 長(zhǎng)春 130000)

支氣管哮喘簡(jiǎn)稱哮喘，是兒科常見呼吸系統(tǒng)慢性炎癥性疾病，臨床主要表現(xiàn)為喘息、胸悶、呼吸困難等癥狀[1-2]。有研究報(bào)道，全世界哮喘發(fā)病人數(shù)不斷升高，尤以嬰幼兒的發(fā)病率常年居高不下，其長(zhǎng)期反復(fù)發(fā)作的特點(diǎn)給家庭帶來(lái)諸多方面負(fù)擔(dān)[3]。中醫(yī)認(rèn)為，哮喘急性發(fā)作病因?yàn)榉沃蟹?、氣道受阻、咳嗽多痰故而生喘，其中以風(fēng)寒、風(fēng)熱為主引發(fā)哮喘反復(fù)發(fā)作，久病不愈常導(dǎo)致腎陽(yáng)虛弱，因此有中醫(yī)學(xué)家將小兒哮喘發(fā)作期哮喘按寒熱虛實(shí)辨證。如馬融教授[4]根據(jù)中醫(yī)辨證分型將發(fā)作期哮喘分為寒哮型、熱哮型、外寒內(nèi)熱型、虛實(shí)夾雜型。中醫(yī)多從宏觀角度對(duì)哮喘進(jìn)行辨證論證，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)多從實(shí)驗(yàn)檢測(cè)方面入手，二者相結(jié)合對(duì)臨床更有指導(dǎo)意義。

目前大量研究發(fā)現(xiàn)，微小RNA(microRNA，miRNA)在哮喘發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮著重要作用。已有研究發(fā)現(xiàn)，微小RNA-146a(miR-146a)與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中醫(yī)證型有關(guān)[5]，miR-146a基因多態(tài)性與兒童哮喘易感性密切相關(guān)[6]。但未見關(guān)于血清miR-146a表達(dá)與小兒哮喘中醫(yī)證型關(guān)系的研究報(bào)道。因此，本研究旨在分析血清miR-146a水平與小兒哮喘中醫(yī)證型的關(guān)系，為其治療及機(jī)制研究提供新思路。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2017年3月至2019年3月長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院兒科收治的130例哮喘發(fā)作期患兒進(jìn)行研究(即哮喘組)，選取同期130例體檢健康兒童作為對(duì)照組。最終納入哮喘組男76例，女54例；年齡3～12歲，平均年齡(7.56±2.18)歲；對(duì)照組男79例，女51例；年齡3～14歲，平均年齡(8.02±2.35)歲。2組受試兒童性別、年齡比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本研究經(jīng)長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)文號(hào)20161218)。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn)

哮喘組診斷依據(jù)兒童支氣管哮喘診斷與防治指南(2016年版)中的診斷標(biāo)準(zhǔn)制定[7]。

1.3 辨證分型標(biāo)準(zhǔn)

中醫(yī)辨證分型參考《中醫(yī)兒科學(xué)》制定辨證標(biāo)準(zhǔn)，將哮喘組患兒分為熱哮型、外寒內(nèi)熱型、寒哮型、虛實(shí)夾雜型4種類型[4]。

1.4 納入標(biāo)準(zhǔn)

符合哮喘發(fā)作期中西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]；符合中醫(yī)辨證分型標(biāo)準(zhǔn)[4]；年齡<14歲；監(jiān)護(hù)人知情并簽署知情同意書。

1.5 排除標(biāo)準(zhǔn)

哮喘緩解期者；由縱膈腫瘤、心源性疾病繼發(fā)的哮喘者；伴肺心病、呼吸衰竭者；伴心血管、肝、腎等嚴(yán)重疾病者；伴造血系統(tǒng)障礙疾病者；合并呼吸道傳染病者；依從性差者；精神失常患兒。

1.6 樣本收集

所有受試兒童抽取清晨空腹肘靜脈血3 mL，室溫靜止25 min，2800 r/min離心20 min，分離上清，超低溫凍存待檢。

1.7 主要試劑與儀器

miR-146a、U6引物由美國(guó)Invitrogen公司設(shè)計(jì)并合成。mir VanaTMPARISTMKit試劑盒(Ambion，貨號(hào)AM1556)；Taq Man?Micro RNA Reverse(美國(guó)Life Technologies公司，貨號(hào)80284)；Transcription Kit(上海熹垣生物科技有限公司，貨號(hào)XY-JBS-PCR-519XS)；Taqman?Universal Master Mix II(上海恒斐生物科技有限公司，貨號(hào)444-0040)；Taq Man?Micro RNAAssay試劑盒(ABI，貨號(hào)403061)；總IgE試劑盒(上海晶抗生物工程有限公司，貨號(hào)JK-(a)-1665)；人白介素6 ELISA試劑盒(杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司，貨號(hào)70-EK106/2-96)；人嗜酸性粒細(xì)胞檢測(cè)試劑盒(上海滬震實(shí)業(yè)有限公司，貨號(hào)hz-H2341c)；分光光度計(jì)(Eppen dorf，型號(hào)Biophotometer)；普通PCR儀(Bio-Rad，型號(hào)T100)；G-3000熒光定量PCR儀(Corbett Research，型號(hào)Rotor-Gene 3000 A)。

1.8 觀察指標(biāo)與方法

1.8.1 血清miR-146a檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)血清miR-146a表達(dá)。miR-146a引物序列：上游引物：5’-CGGATCCTTGGTCTCCTCCAGATGTTTAT-3’，下游引物：5’-CCTCGAGT}CATTAAAGTGATTTCTCCCAAG-3’，內(nèi)參U6：上游引物：5’-CTCGCTTCGGCAGCACATA-3’，下游引物：5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’；總RNA提取、純化，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，反應(yīng)條件：16 ℃ 30 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5min，以U6為內(nèi)參進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件：50 ℃ 2min 1個(gè)循環(huán)，95 ℃ 10 min 1個(gè)循環(huán)，95 ℃ 15 s、60 ℃ 60 s 40個(gè)循環(huán)，具體實(shí)驗(yàn)步驟參照試劑盒說(shuō)明書操作，采用2-ΔΔCT方法計(jì)算血清miR-146a相對(duì)表達(dá)量。

1.8.2 病情控制評(píng)估 采用哮喘控制測(cè)試(asthma control test，ACT)評(píng)分[8]評(píng)估病情，患兒與家屬共同填寫ACT表，共包括7個(gè)問(wèn)題，前4個(gè)問(wèn)題為0～3分，由患兒獨(dú)立完成，后3個(gè)問(wèn)題0～5分，由家屬完成，總分25分，分?jǐn)?shù)越高說(shuō)明患兒病情控制越好。

1.8.3 血清指標(biāo)檢測(cè) 采用酶聯(lián)免疫法使用相應(yīng)的試劑盒檢測(cè)受試者血清白細(xì)胞介素-6(interleukin 6，IL-6)、總免疫球蛋白E(Immunoglobulin E，IgE)、嗜酸性粒細(xì)胞水平。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 130例哮喘患兒中醫(yī)證型分布情況

收治的130例哮喘發(fā)作期患兒中，熱哮型58例(44.62%)，外寒內(nèi)熱型40例(30.77%)，寒哮型患兒32例(24.61%)，虛實(shí)夾雜型0例，以熱哮型、外寒內(nèi)熱型、寒哮型常見。

2.2 2組受試兒血清miR-146a表達(dá)及相關(guān)炎癥因子水平比較

表1示，哮喘組患兒血清miR-146a表達(dá)、IL-6、總IgE、嗜酸性粒細(xì)胞水平明顯高于對(duì)照組(P<0.05)。

表1 2組受試兒血清miR-146a及炎癥因子表達(dá)比較

2.3 不同中醫(yī)證型哮喘患兒血清miR-146a水平比較

表2示，寒哮型、外寒內(nèi)熱型患兒血清miR-146a表達(dá)均顯著高于熱哮型(P<0.05)，寒哮型血清miR-146a表達(dá)高于外寒內(nèi)熱型(P<0.05)。

表2 不同中醫(yī)證型哮喘患兒血清miR-146a表達(dá)比較

2.4 不同中醫(yī)證型哮喘患兒血清相關(guān)炎癥因子水平比較

表3示，寒哮型、外寒內(nèi)熱型患兒血清IL-6、總IgE、嗜酸性粒細(xì)胞水平均顯著高于熱哮型(P<0.05)，寒哮型血清IL-6、總IgE、嗜酸性粒細(xì)胞水平高于外寒內(nèi)熱型(P<0.05)。

表3 不同中醫(yī)證型哮喘患兒血清相關(guān)炎癥因子水平比較

2.5 不同中醫(yī)證型哮喘患兒ACT評(píng)分比較

表4示，寒哮型、外寒內(nèi)熱型患兒ACT評(píng)分明顯低于熱哮型(P<0.05)，寒哮型低于外寒內(nèi)熱型(P<0.05)。

表4 不同中醫(yī)證型哮喘患兒ACT評(píng)分比較(分，

2.6 不同中醫(yī)證型患兒血清miR-146a表達(dá)與ACT評(píng)分關(guān)系

圖1～3示，寒哮型患兒血清miR-146a表達(dá)量與ACT評(píng)分呈正相關(guān)(r=0.700，P=0.000)；外寒內(nèi)熱型患兒血清miR-146a表達(dá)量與ACT評(píng)分呈正相關(guān)(r=0.591，P=0.000)；熱哮型患兒血清miR-146a表達(dá)量與ACT評(píng)分呈正相關(guān)(r=0.488，P=0.005)。

圖1 寒哮型患兒血清miR-146a表達(dá)與ACT評(píng)分相關(guān)性

圖2 外寒內(nèi)熱型患兒血清miR-146a表達(dá)與ACT評(píng)分相關(guān)性

圖3 熱哮型患兒血清miR-146a表達(dá)與ACT評(píng)分相關(guān)性

3 討論

哮喘屬于中醫(yī)學(xué)“喘鳴”“喘息”“呷嗽”“喘咳”范疇。《素問(wèn)·陰陽(yáng)別論篇》有云：“陰爭(zhēng)于內(nèi)……起則熏肺，使人喘鳴?！薄吨T病源候論·上氣喉中如水雞鳴候》曰：“肺病令人上氣……喘息不調(diào)，致咽喉……如水雞之鳴也?！痹ね鯃?zhí)中《針灸資生經(jīng)·喘》中首現(xiàn)“哮喘”之名。近代醫(yī)家對(duì)小兒哮喘發(fā)作期辨證分型存在諸多不同觀點(diǎn)。廖芳菊等[9]主張按“寒性哮喘、熱性哮喘、外寒里熱”3個(gè)證型對(duì)急性發(fā)作期哮喘患兒進(jìn)行辨證治療，療效較好。本研究結(jié)果顯示，收治的130例哮喘發(fā)作期患兒中，熱哮型58例(44.62%)，外寒內(nèi)熱型40例(30.77%)，寒哮型32例(24.61%)，與上述研究結(jié)果相似，提示小兒哮喘發(fā)作期以熱哮、外寒內(nèi)熱、寒哮多見。哮喘發(fā)作期患兒存在免疫調(diào)節(jié)失衡現(xiàn)象。目前認(rèn)為，Th1/Th2失衡是哮喘發(fā)病的重要機(jī)制，平衡向Th2遷移，Th2型細(xì)胞因子增多進(jìn)而會(huì)加重氣道炎癥，導(dǎo)致哮喘急性發(fā)作[10]。當(dāng)外界過(guò)敏原進(jìn)入機(jī)體后，過(guò)敏原與IgE抗體結(jié)合，引起肥大細(xì)胞活化，分泌活性介質(zhì)，導(dǎo)致氣道炎癥。穆清爽等[11]發(fā)現(xiàn)，哮喘患者中血清IL-6、嗜酸性粒細(xì)胞、總IgE水平高于健康者。本研究發(fā)現(xiàn)，哮喘患兒血清IL-6、嗜酸性粒細(xì)胞、總IgE水平高于健康兒童，且寒哮型、外寒內(nèi)熱型、熱哮型患兒血清IL-6、總IgE、嗜酸性粒細(xì)胞水平依次降低，提示哮喘患兒發(fā)病可能與氣道炎癥相關(guān)，且不同證型哮喘患兒氣道炎癥程度不同。

miRNA是非編碼小RNA，大量研究證實(shí)miRNA表達(dá)異常與哮喘的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[12]。穆清爽等[13]研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-126在哮喘急性加重期患者血漿中低表達(dá)，并能通過(guò)調(diào)節(jié)Th2優(yōu)勢(shì)轉(zhuǎn)化提高IL-6、嗜酸性粒細(xì)胞及IgE水平，加重患者炎癥反應(yīng)，促進(jìn)病情發(fā)展。miR-146a在多種疾病中異常表達(dá)，有研究報(bào)道其表達(dá)與氣道炎癥性疾病相關(guān)。而miR-146a高表達(dá)可抑制Th1分化，促進(jìn)Th2分化白細(xì)胞介素-4等促炎因子表達(dá)，參與炎癥反應(yīng)[14-15]。Comer等[16]發(fā)現(xiàn)，miR-146a在哮喘患者氣道平滑肌細(xì)胞中表達(dá)水平上調(diào)，且miR-146a能間接調(diào)控IL-6、IL-8等炎性細(xì)胞因子，并不抑制IL-6、IL-8因子產(chǎn)生。Zhang等[17]研究發(fā)現(xiàn)，miR-146a在哮喘患兒血漿中表達(dá)升高，miR-146a過(guò)表達(dá)可下調(diào)其靶基因表皮生長(zhǎng)因子受體進(jìn)而抑制支氣管平滑肌細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡。本研究結(jié)果顯示，哮喘組患兒血清miR-146a表達(dá)高于對(duì)照組，與上述研究結(jié)果相似，提示miR-146a可能與其致病機(jī)制相關(guān)。黃永蓮等[18]發(fā)現(xiàn)，哮喘虛證肺氣虛證型、肺脾兩虛證型、肺腎兩虛證型患者病情依次加重，肺功能隨著病情加重逐漸降低。吳志洪等[19]發(fā)現(xiàn)，miR-146a在不同證型特應(yīng)性皮炎患者皮損標(biāo)本中有顯著差異。本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，熱哮型、外寒內(nèi)熱型、寒哮型患兒血清miR-146a表達(dá)依次升高，提示血清miR-146a表達(dá)與哮喘發(fā)作期不同中醫(yī)證型有關(guān)。通過(guò)血清miR-146a檢測(cè)，可能有助于小兒哮喘發(fā)作期中醫(yī)分型。寒哮型哮喘為外寒邪侵入、內(nèi)寒痰伏肺俞、痰阻氣道、肺氣上逆而致，而兒童肺、脾、腎三臟功能不足可致脾胃虛寒，加重患兒病情，其病情加重可能促進(jìn)血清miR-146a表達(dá)，具體機(jī)制還需進(jìn)一步研究。對(duì)不同中醫(yī)證型患兒ACT評(píng)分研究發(fā)現(xiàn)，寒哮型、外寒內(nèi)熱型患兒ACT評(píng)分低于熱哮型，寒哮型低于外寒內(nèi)熱型，提示寒哮型、外寒內(nèi)熱型哮喘發(fā)作期患兒病情控制較差。最后研究結(jié)果顯示，寒哮型、外寒內(nèi)熱型、熱哮型患兒miR-146a表達(dá)與ACT評(píng)分均呈正相關(guān)，提示哮喘發(fā)作期不同中醫(yī)證型患兒血清miR-146a表達(dá)越高病情控制越差。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)哮喘發(fā)作期患兒血清miR-146a高表達(dá)，miR-146a在不同中醫(yī)證型哮喘患兒血清中表達(dá)量有明顯差異，臨床進(jìn)行血清miR-146a檢測(cè)可能有利于小兒哮喘中醫(yī)分型。本研究對(duì)象較少，僅對(duì)哮喘發(fā)作期患兒進(jìn)行研究，缺乏對(duì)哮喘持續(xù)期、緩解期患兒的研究結(jié)果，還需開展大樣本量、多證型研究，以提高研究的準(zhǔn)確性。