基于Notch信號通路研究銀杏內(nèi)酯B對非酒精性脂肪肝病的影響

余 虹，武俊紫，宋 波*，李 軍

1攀枝花市第二人民醫(yī)院，四川 攀枝花617068；

2云南中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南 昆明650504；

3昆明醫(yī)科大學(xué)附屬第二人民醫(yī)院，云南 昆明650500

非酒精性脂肪肝?。╪on-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是一種臨床較為常見的肝臟疾病。相關(guān)流行病學(xué)研究結(jié)果顯示，NAFLD發(fā)生率逐年升高，在我國城市地區(qū)高達24%，農(nóng)村地區(qū)高達12%，其發(fā)生率已超過病毒性肝炎，成為我國人群發(fā)生率最高的肝臟疾?。?-2］。本病危害較大，控制不佳可引發(fā)脂肪性肝炎、肝纖維化、肝硬化甚至肝癌等，因此需早期進行干預(yù)，抑制疾病進展是目前臨床急需解決的問題之一［3-4］。目前西醫(yī)對于NAFLD的治療主要以降脂為主，代表性藥物為辛伐他汀，雖療效尚可，但副作用較大［5］。中醫(yī)藥治療NAFLD有其獨特優(yōu)勢，治療藥物根據(jù)患者不同證候選擇，主要有柴胡舒肝丸、安絡(luò)化纖丸、雙虎清肝顆粒以及逍遙丸等［6］，但由于其藥理成分復(fù)雜，中藥復(fù)方在國際推廣上較難。銀杏內(nèi)酯B是具有活血化瘀作用的單體藥，其在改善脂質(zhì)代謝方面具有較好的效果［7］，且副作用少，安全性高。有研究發(fā)現(xiàn)，Notch基因過量表達與肝臟脂質(zhì)積累具有相關(guān)性，許多研究以Notch基因為靶點治療NAFLD效果較好［8］。有研究顯示，銀杏內(nèi)酯B的作用靶點之一為Notch信號通路［9-10］，為此本研究基于Notch信號通路研究銀杏內(nèi)酯B干預(yù)NAFLD大鼠模型，以期為銀杏內(nèi)酯B治療NAFLD提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選擇SPF級雄性SD大鼠72只，5～6周齡，體質(zhì)量為160～180 g，由昆明醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供［合格證號：SCXK（滇）K2015-0002］，大鼠購買后飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)動物飼養(yǎng)房，日常飲食和清潔由專業(yè)人員統(tǒng)一負責(zé)，飼養(yǎng)環(huán)境溫度和濕度均由中央空調(diào)統(tǒng)一控制，溫度22～27℃，濕度40%～60%，光照／黑暗：12 h／12 h。

1.2 主要試劑與儀器

TGF-β1試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司）；TNF-α試劑盒（武漢谷歌生物科技公司）；二抗（艾美捷科技有限公司）；引物（武漢谷歌生物科技有限公司）；電子天平（上海精密儀器儀表有限公司，F(xiàn)A1204B型）；pH計（山東德天環(huán)保設(shè)備有限公司，PH-03型）；超低溫冰箱（美國Thermo Forma公司，725型）；低溫高速離心機（上海盧湘儀離心機儀器有限公司，TGL-16.5M型）；紫外-可見分光光度計（上海精密儀器儀表有限公司，UV-8000型）；蛋白電泳儀（Bio-Rad Mini-PROTEAN美國伯樂公司，Tetra Cell型）；實時熒光定量PCR儀（賽默飛世爾科技公司，QuantStudioTM3 System型）；谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、高密度脂蛋白試劑盒（high-density lipoprotein，HDL-C）和低密度脂蛋白試劑盒（low-density lipoprotein，LDL-C）（南京建成生物工程研究所）；Notch-3、Hes-1和甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體（美國Santa Cruz公司）。

1.3 模型制備與評估

1.3.1 非酒精性脂肪肝病模型建立 所有大鼠購買后先適應(yīng)性喂養(yǎng)2周，隨機選取12只作為正常組，給予普通飼料（昆明醫(yī)科大學(xué)動物實驗部提供）喂養(yǎng)；其余60只大鼠為實驗組，給予高脂高糖飼料（主要配方：83.25%基礎(chǔ)飼料、10%豬油、5%蔗糖、1.5%膽固醇和0.25%膽酸鈉）喂養(yǎng)12周，不做其他特殊處理。

1.3.2 非酒精性脂肪肝病模型評估 喂養(yǎng)12周后，正常組隨機選擇2只，實驗組隨機選擇10只處死，收集肝臟組織進行病理學(xué)檢測，判斷是否造模成功，造模成功的標(biāo)準(zhǔn)為肝臟HE染色有明顯大量脂肪空泡［11］。當(dāng)隨機處死的大鼠大部分都有脂肪肝病時即可認為造模成功［12］。

1.4 實驗分組與給藥

1.4.1 實驗分組 造模成功的50只大鼠按照隨機數(shù)字表法分為模型組、辛伐他汀組、低劑量組、中劑量組和高劑量組，每組10只，造模成功后所有組別均停用高脂飼料，給予普通飼料喂養(yǎng)。

1.4.2 給藥 給藥劑量參照“人和動物體表面積折算的等效劑量比率表”進行換算［13］。正常組、模型組均按1 mL／d劑量給予生理鹽水灌胃；辛伐他汀組按2 mg／（kg·d）劑量給予辛伐他?。ū本└Ｔt(yī)藥股份有限公司，生產(chǎn)批號：20180807）灌胃；低劑量組按0.5 mg／（kg·d）劑量給予98%銀杏內(nèi)酯B（成都德思特生物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)批號：170315）灌胃；中劑量組按1.0 mg／（kg·d）劑量給予98%銀杏內(nèi)酯B灌胃；高劑量組按2.0 mg／（kg·d）劑量給予98%銀杏內(nèi)酯B灌胃。每次灌胃前均給予大鼠稱重，盡最大可能保證給藥量準(zhǔn)確。灌胃時，分別將辛伐他汀、銀杏內(nèi)酯B溶解于1 mL生理鹽水中。治療時間為4周。

1.5 取材及樣本處理

1.5.1 取材前準(zhǔn)備 所有大鼠均于最后1次灌胃結(jié)束后當(dāng)天20:00～24:00分批次禁食不禁水12 h，次日依照批次麻醉后取材。

1.5.2 血液樣本采集 采用戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，麻醉后將其固定于解剖板，采用10 mL注射器從腹主動脈抽取血液，血液收集后立即將其置入帶有肝素鈉的抗凝管中備用。

1.5.3 肝臟樣本采集 血液采集后，處死動物，直接取出肝臟組織，將其切成3份，1份置入組織固定液用于病理學(xué)檢測，1份置入RNA保存液中用于相對應(yīng)RNA檢測，最后1份置入超低溫冰箱中用于蛋白表達的檢測。

1.6 指標(biāo)及檢測方法

1.6.1 生化指標(biāo)檢測 采用分光光度法檢測血漿中AST、ALT、LDL-C和HDL-C等生化指標(biāo)；采用ELISA法檢測血漿和肝臟組織中轉(zhuǎn)化生長因子－β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等生化指標(biāo)。血液生化指標(biāo)的檢測全部按照試劑盒提供的說明書進行；肝臟組織中TGF-β1和TNF-α的測定方法為：稱取100 mg肝臟組織，用總蛋白試劑盒提取總蛋白，采用BCA法定量并調(diào)平后，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進行測定。

1.6.2 HE染色方法觀察肝臟組織病理學(xué) 肝臟組織采用生理鹽水洗滌后，將其用石蠟包埋、切片（3～5μm）、脫蠟、酒精脫水、蘇木精和伊紅染色（HE染色），完成后將切片固定于載玻片上，中性樹脂封片，采用普通光學(xué)顯微鏡進行圖像采集，每張切片選取5個不同的視野。NAFLD病理評價采用分級分析法，①0級：0分，脂肪變性細胞＜5%；②1級：1分，肝臟脂肪變性細胞占5%～33%；③2級：2分，肝臟脂肪變性細胞占34%～66%；④3級：3分，肝臟脂肪變性細胞＞67%。

1.6.3 實時熒光定量PCR法檢測肝臟組織中Notch-3和Hes-1 mRNA表達 稱取20 mg肝臟組織，用總RNA試劑盒提取總RNA后，定量后每組各取2μg逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，后行擴增反應(yīng)，擴增條件為：94℃預(yù)變性5 min，95℃變性15 s，56℃退火15 s，72℃延伸30 s，共進行34個循環(huán)，結(jié)果采用2－△△Ct法比較分析。引物序列：Notch-3上游引物為5"-AGTGCCGATCTGGTACAACTT-3"；下游引物為5"-CACTACGGGGTTCTCACACA-3"，產(chǎn)物長度為116 bp；Hes-1上游引物為5"-TCAGCGAGTGCATGA ACGAG-3"，下游引物為5"-CATGGCGTTGATCTGG GTCA-3"，產(chǎn)物長度為119 bp；GAPDH上游引物為5"-GGACTAGCTACTGACCC-TC-3"，下游引物為5"-TACCCTGGCTCTTTGAT-3，產(chǎn)物長度為117 bp。

1.6.4 Western blot法檢測肝臟組織中Notch-3和Hes-1蛋白表達 稱取100 mg肝臟組織，用總蛋白試劑盒提取總蛋白后，BCA法定量并調(diào)平，然后每組各取50μg行SDS-PAGE凝膠電泳，電泳完成后半干轉(zhuǎn)移法將其轉(zhuǎn)移到PVDF膜，轉(zhuǎn)膜完成后采用5%脫脂牛奶封閉2 h，2 h后取出加入一抗過夜，次日取出后加入二抗封閉30 min后取出，洗滌3次后加入發(fā)光液曝光洗片。以所測蛋白的灰度值／GAPDH的灰度值作為所測蛋白的相對表達量。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 23.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料服從正態(tài)分布，數(shù)據(jù)采用（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD－t檢驗。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 干預(yù)后6組生化指標(biāo)比較

見表1。

2.2 HE染色方法檢測肝臟組織病理學(xué)結(jié)果

組織病理學(xué)可見，正常組大鼠肝細胞大小基本均一，細胞核分布相對均勻，切片表面也光滑，幾乎沒有脂肪空泡出現(xiàn)［脂肪變性細胞僅為（0.64±0.12）%］；而模型組則出現(xiàn)有大量脂肪空泡，同時細胞核受到擠壓分布于細胞膜表面［肝臟脂肪變性細胞占到整個肝臟細胞（72.25±18.45）%］；與模型組比較，辛伐他汀組，高、中、低劑量組脂肪空泡數(shù)量明顯降低（辛伐他汀組和銀杏內(nèi)酯B中劑量組和高劑量組肝臟脂肪變性細胞占5%～33%，銀杏內(nèi)酯B低劑量組肝臟脂肪變性細胞占34%～66%），這提示肝臟脂肪浸潤有明顯改善。見圖1和表2。

2.3 Western blot法和實時熒光定量PCR法檢測肝臟組織Notch-3、Hes-1蛋白和mRNA表達結(jié)果

見圖2、表3。

3 討 論

3.1 銀杏內(nèi)酯B可有效改善NAFLD大鼠肝功能和調(diào)節(jié)血脂

祖國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)對肝病有諸多描述，但卻沒有脂肪肝病的概念。根據(jù)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)有關(guān)于“脂肪肝”的病理特征描述，結(jié)合中醫(yī)相關(guān)脈象，中醫(yī)學(xué)將其歸屬“脅痛”“痞滿”“積聚”“瘀血”等病證范疇［14-15］。中醫(yī)學(xué)認為脂肪肝病病位主要在肝、脾，以痰、濁、血、瘀、酒、毒為基本病理因素，病性為本虛標(biāo)實，氣滯痰郁，瘀濕蘊聚肝臟而致本?。?4］。治療原則主要有“清熱解毒”“除濕清熱”“活血化瘀”等，其中以“化瘀”為主要核心。銀杏內(nèi)酯B是銀杏的提取物之一，是血小板活化因子拮抗劑，也是常用的化瘀藥，具有化瘀、降痰及解毒的功效［16-17］。

表1 6組干預(yù)后生化指標(biāo)比較（±s）Table 1 Comparison of biochemical indicators in six groups after intervention（±s）

表1 6組干預(yù)后生化指標(biāo)比較（±s）Table 1 Comparison of biochemical indicators in six groups after intervention（±s）

注：與正常組比較，1）P＜0.05；與模型組比較，2）P＜0.05；與辛伐他汀組比較，3）P＜0.05。Note:Compared with the normal group,1)P＜0.05;Compared with the model group,2)P＜0.05;Compared with the simvastatin group,3)P＜0.05.

組別正常組模型組辛伐他汀組低劑量組中劑量組高劑量組n 10 10 10 10 10 10 AST／（U／L）66.23±6.92 160.78±25.161）78.15±15.212）80.21±12.852）77.69±9.152）75.43±6.182）ALT／（U／L）38.28±4.19 65.78±9.041）45.77±5.172）48.16±6.382）44.38±4.372）44.08±3.982）HDL-C／（mmol／L）3.80±0.50 4.26±0.461）4.23±0.58 4.30±0.45 4.34±0.46 4.35±0.34 LDL-C／（mmol／L）0.26±0.05 1.36±0.351）0.57±0.262）0.60±0.302）0.56±0.292）0.50±0.152）組別正常組模型組辛伐他汀組低劑量組中劑量組高劑量組n TGF-β1／（μg／mL）TNF-α／（mmol／L）10 10 10 10 10 10血液0.73±0.09 1.23±0.141）0.91±0.082）0.82±0.102）3）0.83±0.112）3）0.79±0.082）3）肝臟1.10±0.12 1.89±0.291）1.45±0.122）1.30±0.132）3）1.31±0.122）3）1.27±0.112）3）血液0.73±0.14 1.46±0.291）0.92±0.182）0.80±0.312）3）0.85±0.162）3）0.84±0.142）3）肝臟2.35±0.44 5.37±1.061）3.04±0.652）2.65±0.712）3）2.63±0.472）3）2.71±0.582）3）

圖1 大鼠肝臟HE染色圖（×200）Figure1 HE staining of rat liver（×200）

本研究結(jié)果顯示，正常組肝細胞切片HE染色表面光滑，沒有脂肪顆粒浸潤，而模型組則出現(xiàn)大量的脂肪空泡，銀杏內(nèi)酯B高、中、低劑量組干預(yù)后脂肪空泡數(shù)量明顯降低。此外，與模型組比較，高、中、低劑量組干預(yù)后AST、ALT均明顯降低，血脂LDL-C和肝臟炎癥因子TGF-β1、TNF-α也均明顯降低。這提示，銀杏內(nèi)酯B可有效改善NAFLD大鼠肝功能，調(diào)節(jié)血脂水平和降低炎癥反應(yīng)。這與龍思琴等［18-19］研究結(jié)果一致。

肝臟是代謝糖、脂的主要器官，當(dāng)人體攝入過多糖、脂后，肝臟不能將其完全代謝，可造成脂肪顆粒蓄積于肝臟，積累到一定程度形成脂肪肝病。通過肝臟病理學(xué)可見肝臟有明顯的脂肪空泡［20］。本研究采用銀杏內(nèi)酯B干預(yù)NAFLD大鼠，血漿LDL-C和血脂水平明顯降低，可有效促進肝臟脂肪顆粒代謝向外排出，NAFLD大鼠肝臟脂肪空泡數(shù)量明顯減少，肝臟炎癥反應(yīng)降低，肝臟功能逐步恢復(fù)正常。

表2 6組肝臟組織病理學(xué)評分比較（±s）Table 2 Comparison of the Liver histopathological score in six groups（±s）

表2 6組肝臟組織病理學(xué)評分比較（±s）Table 2 Comparison of the Liver histopathological score in six groups（±s）

注：與正常組比較，1）P＜0.05；與模型組比較，2）P＜0.05。Note:Compared with the normal group,1)P＜0.05;Compared with the model group,2)P＜0.05.

評分／分0.00±0.00 2.98±0.271）1.44±0.132）1.98±0.092）1.72±0.152）1.46±0.122）組別正常組模型組辛伐他汀組低劑量組中劑量組高劑量組n 10 10 10 10 10 10脂肪變性細胞占肝細胞百分比／%0.64±0.12 72.25±18.451）16.87±2.142）42.56±5.782）25.37±4.142）14.28±3.182）

圖2 大鼠肝臟Notch-3和Hes-1蛋白表達圖Figure 2 Expression of Notch-3 and Hes-1 proteins in rat liver

表3 6組干預(yù)后肝臟組織Notch-3和Hes-1蛋白及mRNA比較（±s）Table 3 Comparison of Notch-3，Hes-1 proteins and mRNA of liver tissues in six groups after intervention（±s）

表3 6組干預(yù)后肝臟組織Notch-3和Hes-1蛋白及mRNA比較（±s）Table 3 Comparison of Notch-3，Hes-1 proteins and mRNA of liver tissues in six groups after intervention（±s）

注：與正常組比較，1）P＜0.05；與模型組比較，2）P＜0.05；與辛伐他汀組比較，3）P＜0.05。Note:Compared with the normal group,1)P＜0.05;Compared with the model group,2)P＜0.05;Compared with the simvastatin group,3)P＜0.05.

組別正常組模型組辛伐他汀組低劑量組中劑量組高劑量組n Notch-3 Hes-1 10 10 10 10 10 10蛋白0.30±0.02 0.84±0.061）0.61±0.082）0.67±0.062）0.38±0.072）3）0.36±0.082）3）mRNA 1.02±0.01 2.35±0.131）1.68±0.122）1.72±0.132）1.54±0.122）3）1.47±0.112）3）蛋白0.25±0.03 0.76±0.091）0.38±0.062）0.60±0.052）0.38±0.062）3）0.34±0.042）3）mRNA 1.01±0.01 1.95±0.121）1.62±0.132）1.65±0.112）1.53±0.122）3）1.52±0.112）3）

3.2 銀杏內(nèi)酯B改善NAFLD大鼠肝功能可能與調(diào)節(jié)Notch信號通路有關(guān)

Notch基因?qū)毎L發(fā)育具有重要作用，對肝臟代謝具有獨特作用。Notch基因過度表達會導(dǎo)致脂質(zhì)代謝異常和肥胖等，而這是NAFLD發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵因素。Notch蛋白是一類在發(fā)育過程中與細胞分化相關(guān)的受體蛋白家族成員，其分泌的mRNA轉(zhuǎn)錄并活化后通過調(diào)節(jié)Hes-1蛋白及mRNA表達，上調(diào)固醇調(diào)節(jié)結(jié)合蛋白1c（SREBP1c）活性，增強肝細胞內(nèi)甘油三酯合成，促進NAFLD發(fā)生發(fā)展［21-23］。本研究結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組Notch-3、Hes-1蛋白及其mRNA表達均明顯升高；與模型組比較，中、高劑量銀杏內(nèi)酯B干預(yù)后NAFLD大鼠Notch-3、Hes-1蛋白及其mRNA表達明顯降低。這提示銀杏內(nèi)酯B改善NAFLD大鼠肝功能可能與調(diào)節(jié)Notch信號通路有關(guān)。銀杏內(nèi)酯B通過調(diào)節(jié)Notch信號通路，可抑制Notch-3、Hes-1蛋白及其mRNA的表達，調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝紊亂，減輕肥胖，從而改善NAFLD癥狀。這與李騰騰等［23］以Notch信號通路為靶點觀察銀杏內(nèi)酯B治療腦缺血再灌注損傷，發(fā)現(xiàn)其可以明顯降低Notch蛋白表達的結(jié)果相似。

4 小 結(jié)

銀杏內(nèi)酯B可改善NAFLD大鼠肝功能，調(diào)節(jié)血脂水平，降低炎癥反應(yīng)，而這可能與調(diào)節(jié)Notch信號通路，抑制Notch-3、Hes-1蛋白及其mRNA的表達有關(guān)。下調(diào)Notch信號可能是治療NAFLD患者的候選靶標(biāo)，但還需要進一步研究以證實這個假說，以闡明Notch信號通路與NAFLD之間的關(guān)系。