香菇微衛(wèi)星標記變性聚丙烯酰胺凝膠電泳的應用及正交優(yōu)化

張丹 顏夢秋 張美彥 譚琦 宋春艷 尚曉冬

摘要：變性聚丙烯酰胺凝膠電泳是一種高效鑒定微衛(wèi)星分子標記的方法，廣泛應用于種質鑒定、遺傳連鎖圖譜構建及分子標記輔助育種等研究中。該方法由于操作繁瑣，目前在食用菌領域的應用尚不廣泛。以香菇為研究對象，建立變性聚丙烯酰胺凝膠電泳的檢測流程，并利用正交試驗對檢測流程中涉及的加樣緩沖液與PCR反應液的體積比、95 ℃變性時間、置于冰上冷卻時間、銀染時間、銀染后膠板去離子水洗時間等5個操作節(jié)點進行優(yōu)化。結果表明，加樣緩沖液與PCR反應液體積比為1 ∶2，95 ℃變性2～5 min，置于冰上冷卻15～20 min，銀染7 min，銀染后膠板用去離子水洗5～10 s是正交試驗的較優(yōu)處理組合。試驗建立了香菇微衛(wèi)星標記變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測操作規(guī)程，該操作規(guī)程具有成本低、效率高、易批量化操作等優(yōu)點，對其他食用菌微衛(wèi)星標記的應用具有重要的參考價值。

關鍵詞：香菇;變性聚丙烯酰胺凝膠電泳;微衛(wèi)星標記;正交試驗設計;銀染試驗

中圖分類號：S646.1+20.1 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2021）05-0057-05

微衛(wèi)星標記別稱簡單重復序列（simple sequence repeat，簡稱SSR）標記是目前普遍使用的分子遺傳學標記，具有多態(tài)性高、共顯性、檢測重復性好、基因組中廣泛分布等優(yōu)點。近年來，隨著全基因組測序技術的不斷發(fā)展，SSR標記已廣泛應用于動植物遺傳圖譜的構建、數(shù)量性狀座位（quantitative trait locus，簡稱QTL）定位、分子遺傳多樣性等研究。SSR標記擴增產(chǎn)物的檢測方法主要有熒光標記引物測序法、同位素標記引物的聚丙烯酰胺凝膠電泳法、瓊脂糖凝膠電泳法、變性聚丙烯酰胺凝膠電泳法等，其中變性聚丙烯酰胺凝膠電泳-銀染檢測法被認為是精度最好的鑒定方法。

在香菇分子遺傳學研究中，SSR標記已應用于菌種真實性鑒定、遺傳圖譜構建以及遺傳多樣性分析等研究中。已有的文獻報道表明，目前香菇中SSR標記的檢測多采用瓊脂糖凝膠電泳法或是非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳法，有關變性聚丙烯酰胺凝膠電泳法的報道較少。為進一步推動該方法在食用菌領域的應用，本研究擬采用正交設計對現(xiàn)有變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測流程進行優(yōu)化，以期建立一套高效、低成本、易批量化實踐的香菇SSR標記操作規(guī)程，同時為其他食用菌SSR標記的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2019年3月在上海市農(nóng)業(yè)科學院食用菌研究所開展，供試香菇菌株為國內(nèi)常用栽培品種，共24株（表1），由上海市農(nóng)業(yè)科學院食用菌研究所育種室提供。通過十六烷基三甲基溴化銨（cetyltrimethylammonium bromide，簡稱CTAB）法[10]提取香菇菌絲體的全基因組DNA。

1.2 PCR擴增體系和程序

選用的SSR引物根據(jù)香菇L135菌株的全基因組序列設計，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。引物信息見表2。

PCR反應使用Mycycler Thermal Cycler （Bio-Rad，USA） PCR儀，反應體系為20 μL，包括2 μL 10×Reaction buffer （Promega，without Mg2+），2 μL MgCl2 （Promega，25 mmol/L），0.4 μL dNTP（10 mmol/L），0.2 μL Taq聚合酶 （5 U/μL，Promega公司產(chǎn)品），2 μL 模板DNA （50 ng/μL），正向和反向引物各1 μL （10 μmol/L），以及 11.4 μL ddH2O。

PCR擴增程序：95 ℃預變性5 min;95 ℃變性30 s，55 ℃復性30 s，72 ℃延伸30 s，共30個循環(huán);72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。

1.3 電泳

電泳儀型號為DYY-12（北京六一儀器廠），電泳槽型號為DYCZ-20E（北京六一儀器廠），玻璃膠板尺寸為48 cm×32 cm，采用體積濃度為6%的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離擴增片段，采用穩(wěn)壓為1 000 V，電泳時間為50 min。DNA Marker 為DL500（TaKaRa 公司，日本）。

1.4 樣品的變性處理

在電泳前須將PCR擴增產(chǎn)物進行變性處理，具體方法為將擴增產(chǎn)物與點樣緩沖液按照一定比例進行混合。采用95 ℃高溫處理打開DNA雙鏈，之后迅速置于冰上冷卻，使DNA保持單鏈狀態(tài)。

1.5 銀染及顯色

試驗采用銀染及強堿法顯色，具體流程為 （1） 電泳結束后切斷電源，取下膠板，將附著凝膠的玻璃板放入裝有去離子水的塑料盤中，快速用去離子水漂洗1次。（2） 銀染：將膠板放入1 000 mL質量濃度為0.1%的AgNO3銀染液中浸泡適當時間，之后用去離子水漂洗1次。（3） 顯色：將銀染后的膠板放入1 000 mL的顯色液（質量濃度為1.6%的無水NaOH和體積濃度為0.5%的甲醛）中進行顯色。

1.6 正交試驗設計

經(jīng)反復實踐，變性聚丙烯酰胺凝膠電泳流程有5個操作節(jié)點需優(yōu)化改良，其中PCR擴增產(chǎn)物的變性有3個節(jié)點，即點樣緩沖液添加量、高溫（95 ℃）處理時間、變性產(chǎn)物在冰上冷卻時間;銀染和顯色過程中有2個節(jié)點，即銀染時間和銀染后膠板去離子水漂洗時間。因此，試驗采用L16（45）正交設計對上述5個節(jié)點進行優(yōu)化改良，試驗的因子設置為加樣緩沖液與PCR反應液的體積比、95 ℃變性時間（min）、變性產(chǎn)物冰上冷卻時間（min）、銀染時間（min）、銀染后去離子水漂洗時間（s）。具體試驗設計見表3。

1.7 拍照統(tǒng)計與膠板質量評價

將銀染顯色后的玻璃膠板晾干后置于白熾燈箱上，對不同處理的膠板進行比較評價，使用數(shù)碼相機拍照保存。

采用3個評價指標對各處理的膠板質量進行評價。3個指標分別為膠板整體清晰度、膠板背景色、產(chǎn)物條帶和DNA marker的清晰度，膠板整體清晰度可分為模糊、一般、清晰等3個等級;膠板背景色分為深、一般、淺3個等級;產(chǎn)物條帶和DNA marker的清晰度分為3個等級，即模糊、一般、清晰。上述3個指標各等級依次賦予1、2、3分的得分，得分越高效果越好。評價以白熾燈箱為唯一背景光源，采用人眼觀測投票打分的方式進行，參與測評共34人，以出現(xiàn)次數(shù)最多的得分為該處理膠板質量指標的最終評分。各處理的膠板質量評分情況見表3。

2 結果與分析

2.1 正交試驗各處理電泳及銀染顯色效果的比較

正交試驗的極差分析結果可以闡明各因素不同水平對膠板質量的影響，同時也可以挖掘出重要的影響因子。表4中k表示表3中各因素同一水平對應膠板質量評分的平均值。極差（R）是各水平的平均值中最大值與最小值的差值。極差大說明此因素的不同水平產(chǎn)生的評分差異較大，重要性也越高。由表4可知，對膠板整體清晰度指標而言，最重要的影響因子為銀染時間，其極差為2。膠板整體清晰度的平均值隨著銀染時間的增加呈增大趨勢，說明銀染時間與膠板整體清晰度成正比。

膠板背景色評分的極差分析結果表明，銀染時間越短，銀染后漂洗的時間越長，膠板背景顏色越淺。擴增產(chǎn)物條帶和DNA marker條帶清晰度評分的極差分析結果表明，銀染時間和反應液與緩沖液的體積比對條帶清晰度有較大影響，銀染時間越長條帶的清晰度越高;緩沖液與反應液的體積比為 1 ∶2 時條帶清晰度最好。

2.2 正交試驗各處理的時效性分析

正交試驗中有4個涉及時效性的因素，其中高溫（95 ℃）變性時間設置2、5、8、11 min等4個水平。試驗結果表明，變性時間在2～11 min的范圍內(nèi)均可檢測出目標條帶，從提高試驗效率以及節(jié)能降耗的角度考慮，變性時間設置為2～5 min較為合理。

冰上冷卻時間設置5、10、15、20 min等4個水平，結果表明，冷卻時間在5～20 min的范圍內(nèi)均可檢測出目標條帶，并沒有出現(xiàn)隨著時間的延長擴增產(chǎn)物復性現(xiàn)象（單鏈DNA變?yōu)殡p鏈狀態(tài)）。在實際操作中，擴增產(chǎn)物的變性可在膠板預電泳（將膠板接通電源進行預熱）之前進行，預電泳10～15 min后再進行上樣有利于提高擴增產(chǎn)物在膠板中的整齊度，因此冰上冷卻時間較為合適的選擇為15～20 min。

銀染時間設置2、7、12、17 min等4個水平。正交分析的結果表明，銀染時間與膠板的整體清晰度以及擴增條帶的清晰度呈正比，但與膠板背景色成反比。比較銀染時間各水平的膠板整體清晰度得分可以發(fā)現(xiàn)，2 min處理的平均得分為1.00分，7 min 處理的平均得分為2.50分，12 min處理的平均得分為275分，17 min處理的平均得分為3.00分。綜合膠板清晰度得分和時間成本，銀染7 min較為合理。

銀染后用去離子水漂洗時間設置0、5、10、15 s等 4個水平，極差分析結果表明，銀染后使用去離子水漂洗膠板可降低背景顏色深度。在實際操作中，沒有經(jīng)去離子水漂洗的膠板放入顯色液中時，膠板表面殘留的AgNO3在顯色液中會產(chǎn)生大量黑色沉淀物，其附著在膠板上使膠片背景色加深。同時較多的黑色沉淀物也會影響顯色液的使用效率（1 d內(nèi)進行多次銀染時，顯色液可重復使用）。而用去離子水漂洗時間過久（超過15 s），容易導致膠體在強堿顯色液中從玻璃板上脫落，致使整個試驗失敗。綜合考慮，銀染后用去離子水浸泡膠板5～10 s效果較好。

綜上所述，95 ℃變性2～5 min，置于冰上冷卻15～20 min，銀染7 min，銀染后膠板用去離子水洗 5～10 s，是試驗的較優(yōu)處理組合。

3 結論與討論

SSR標記穩(wěn)定性好、多態(tài)性高且廣泛分布于基因組，目前已應用于遺傳多樣性分析、連鎖圖譜構建以及分子標記輔助育種等研究[11]。食用菌中SSR標記的應用較晚，肖揚等最早在香菇上建立了 SSR-PCR 技術體系，并對種質資源進行了遺傳多樣性分析，該研究采用瓊脂糖凝膠電泳法檢測了SSR標記的擴增產(chǎn)物[7]。由于SSR標記的擴增產(chǎn)物分子量小，常規(guī)的瓊脂糖電泳并不能完全檢測出SSR標記的多態(tài)性，大規(guī)模應用SSR標記仍需使用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳法檢測。

關于聚丙烯酰胺凝膠電泳及其染色方法的應用及改良在動植物中有較多報道，曲魯江等比較了雞基因組中SSR-PCR產(chǎn)物的變性與非變性聚丙烯酰胺-銀染檢測方法，發(fā)現(xiàn)變性聚丙烯酰胺凝膠及銀染方法檢測的條帶較清晰、易于鑒定[4]。李建武等通過對不同染色方法的比較，在馬鈴薯上建立了SSR標記變性聚丙烯酰胺凝膠的快速銀染方法[12]。王愛聽等在玉米上對變性聚丙烯酰胺凝膠電泳和非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳進行比較，認為衛(wèi)星擴增產(chǎn)物在二者上的電泳結果存在差異[13]。在變性膠中微衛(wèi)星擴增產(chǎn)物目的條帶清晰，易于鑒定;在非變性凝膠中表現(xiàn)有較多的非特異性條帶。李立群等在小麥上對SSR標記變性聚丙烯酰胺凝膠電泳方法進行了改進，提高了大規(guī)模SSR分子標記分析的工作效率[14]。王偉等對玉米SSR標記檢測體系進行了優(yōu)化，檢測了貴州51份玉米雜交種的遺傳多樣性，并建立了玉米SSR標記技術操作規(guī)程[15]。

本研究在參考動植物中前人研究的基礎上，建立香菇SSR標記變性聚丙烯酰胺凝膠檢測流程，同時結合香菇SSR-PCR產(chǎn)物檢測的自身特點，采用正交試驗對檢測流程中涉及的加樣緩沖液與PCR反應液的體積比、95 ℃變性時間、置于冰上冷卻時間、銀染時間、銀染后膠板去離子水洗時間等5個操作節(jié)點進行優(yōu)化，結果表明，加樣緩沖液與PCR反應液的體積比為1 ∶2，95 ℃變性時間2～5 min，置于冰上冷卻15～20 min，銀染7 min，銀染后膠板用去離子水洗5～10 s，是正交試驗的較優(yōu)處理組合。

利用改良后的香菇SSR標記變性聚丙烯酰胺凝膠電泳操作流程，筆者進一步選取6對SSR標記引物檢測了24份常用香菇菌種的擴增產(chǎn)物。結果表明，該流程可以高效地檢測出香菇基因組的SSR標記（圖1），可應用于香菇遺傳研究領域。優(yōu)化后的操作流程可為其他大型真菌SSR標記的應用提供參考。

參考文獻：

[1]洪彥彬，梁炫強，陳小平，等. 花生栽培種SSR遺傳圖譜的構建. 作物學報，2009，35（3）：395-402.

[2]匡 猛，楊偉華，許紅霞，等. 中國棉花主栽品種DNA指紋圖譜構建及SSR標記遺傳多樣性分析. 中國農(nóng)業(yè)科學，2011，44（1）：20-27.

[3]邢 冰，董誠明，魏 碩，等. 懷菊轉錄組中SSR位點信息分析. 江蘇農(nóng)業(yè)科學，2020，48（11）：57-60.

[4]曲魯江，李顯耀，杜志強，等. 微衛(wèi)星PCR產(chǎn)物變性與非變性PAGE-銀染檢測方法的比較. 遺傳，2004，26（4）：522-524.

[5]張春雷，佟廣香，匡友誼，等. 微衛(wèi)星產(chǎn)物變性與非變性PAGE-銀染方法比較. 水產(chǎn)學雜志，2010，23（1）：11-14.

[6]巫 萍，章爐軍，張 丹，等. 利用SSR標記鑒定香菇單核體及雜交后代. 微生物學通報，2016，43（2）：444-455.

[7]肖 揚，李 黎，吳 茜，等. 香菇SSR-PCR技術體系的優(yōu)化及其在遺傳多樣性分析中的初步應用. 中國農(nóng)學通報，2009，25（2）：20-24.

[8]葉 翔，黃晨陽，陳 強，等. 中國主栽香菇品種SSR指紋圖譜的構建. 植物遺傳資源學報，2012，13（6）：1067-1072.

[9]張 丹，巫 萍，章爐軍，等. 基于香菇全基因組序列開發(fā)的部分SSR標記多態(tài)性分析與品種鑒定初探. 食用菌學報，2012，19（4）：1-10.

[10]Kuhad R C，Kapoor R K，Lal R. Improving the yield and quality of DNA isolated from white-rot fungi. Folia Microbiologica，2004，49（2）：112-116.

[11]楊亞桐，董安憶，劉松濤，等. 基于SSR分子標記的糯玉米遺傳多樣性研究. 江蘇農(nóng)業(yè)科學，2020，48（2）：83-86.

[12]李建武，李 寧. SSR標記變性聚丙烯酰胺凝膠快速銀染方法的建立. 中國馬鈴薯，2015，29（3）：136-140.

[13]王愛聽，李永生，穆延召，等. 玉米微衛(wèi)星PCR產(chǎn)物變性與非變性PAGE-銀染法的比較分析. 玉米科學，2013，21（3）：48-51.

[14]李立群，王 培，王小利，等. SSR標記變性聚丙烯酰胺凝膠電泳方法改進. 安徽農(nóng)業(yè)科學，2012，40（34）：16541-16544.

[15]王 偉，楊文鵬，關 琦，等. 玉米SSR分子標記技術操作規(guī)程的優(yōu)化. 安徽農(nóng)業(yè)科學，2008，36（11）：4459-4464，4493.