貯藏期UHT奶中蛋白質(zhì)組成結(jié)構(gòu)及其糖基化的變化

李星，顧雨香，任青兮，陳浩然，關(guān)凱方，劉海燕，李啟明，馬鶯

（1.哈爾濱工業(yè)大學(xué)化工與化學(xué)學(xué)院，哈爾濱150090；2.新控國(guó)際健康管理有限公司，成都610044；3.乳品營(yíng)養(yǎng)與功能四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都610000；4.新希望乳業(yè)股份有限公司，成都610063）

0 引 言

UHT奶經(jīng)過135℃以上不少于1 s的超高溫瞬時(shí)滅菌，完全破壞乳中可以生長(zhǎng)的微生物和芽孢，結(jié)合無(wú)菌灌裝技術(shù)，具有長(zhǎng)期常溫貯存（6個(gè)月），銷售攜帶方便，可遠(yuǎn)距離運(yùn)輸?shù)葍?yōu)點(diǎn)[1]，在液體奶市場(chǎng)中占據(jù)主導(dǎo)地位。UHT奶在貯藏過程中經(jīng)常出現(xiàn)品質(zhì)和風(fēng)味劣變問題，如蛋白水解[2-3]、膠凝（age-gelation）[4-6]、沉降（sedimentation）[7]、苦味產(chǎn)生等[3]，對(duì)UHT奶的生產(chǎn)造成困擾。本研究針對(duì)UHT奶在貯藏過程中感官和流變特性的改變，探究乳蛋白在貯藏過程中組成分布改變、乳蛋白的水解和糖基化修飾，為UHT奶的科學(xué)生產(chǎn)和貯藏提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

UHT奶經(jīng)過141℃/2 s間接加熱殺菌。殺菌后無(wú)菌灌裝，在25℃恒溫箱中貯藏6個(gè)月，每月取樣。

牛 乳蛋白標(biāo) 準(zhǔn) 品：αs-酪蛋 白（αs-CN），lot C-6780；β-酪蛋白（β-CN），lot C-6950；κ-酪蛋白（κ-CN），lot C-0406；β-乳 球 蛋 白（β-lg），lot L-3908；α-乳白蛋白（α-la），lot L-5385；纖溶酶活試劑盒，三氟乙酸（TFA），乙腈，超純水購(gòu)于Sigma-Aldrich公司（St.Louis,MO,USA）。其他試劑都為分析純。

1.2 菌落總數(shù)及纖溶酶測(cè)定

參考Wehr等[8]的方法，對(duì)原乳及其UHT奶樣品中菌落總數(shù)測(cè)定進(jìn)行測(cè)定。纖溶酶（plasmin）酶活通過三明治法ELISA法試劑盒進(jìn)行測(cè)定，利用纖溶酶水解合成底物（Suc-Ala-Phe-Lys-AMC）而釋放熒光標(biāo)記物AMC，從而建立纖溶酶含量與熒光強(qiáng)度線性關(guān)系。激發(fā)波長(zhǎng)為450 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為360 nm。

1.3 氮分布測(cè)定

參照李海梅等人的方法[9]，采用凱氏定氮法測(cè)定乳中總氮（TN）、非蛋白氮（NPN）。乳中非酪蛋白氮（NCN）的測(cè)定參照Michael等所述的方法[10]。采用醋酸沉淀樣品中的酪蛋白，上清液中的非酪蛋白含量采用凱氏定氮法測(cè)定。乳中氮分布按下式計(jì)算，乳中每種蛋白質(zhì)的含量在測(cè)得的NPN和NCN最終乘上系數(shù)6.38。乳清蛋白氮（WPN）和酪蛋白氮（CN）的計(jì)算方法如下：

1.4 酪蛋白膠束粒徑及zeta電位測(cè)定

利用動(dòng)態(tài)光散射原理（DLS）測(cè)定酪蛋白膠束的粒徑。參考Li等的方法[11]，脫脂乳用超純水稀釋10倍后對(duì)其進(jìn)行粒徑及zeta電位測(cè)定，散射角為173度，測(cè)試模式為自動(dòng)模式，分析模式為蛋白分析。

1.5 牛乳流變性測(cè)定

通過流變儀對(duì)樣品流變學(xué)特征進(jìn)行測(cè)試：巴氏奶測(cè)定溫度為4℃，UHT奶測(cè)定溫度為25℃。剪切率由0.01到100 s-1，共采集41個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)。每個(gè)樣品平行測(cè)定3次。牛乳作為非牛頓流體，簡(jiǎn)單的黏度這一指標(biāo)并無(wú)法說(shuō)明其流變特性[12-14]。采用“power law”模型來(lái)描述其流變特性（R2＞0.99）。

τ為剪切應(yīng)力（Pa），γ為剪切速率（s-1），K為黏度系數(shù)（Pa·Sn），n為流動(dòng)行為指數(shù)（無(wú)量綱）。當(dāng)n=1時(shí)，該流體為牛頓流體；當(dāng)n＜1時(shí)，該流體為剪切變稀流體。

1.6 牛乳色澤測(cè)定

通過色差儀對(duì)樣品色澤進(jìn)行測(cè)試。標(biāo)準(zhǔn)白板校準(zhǔn)后取一定量的樣品進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)樣品測(cè)定3次取平均值。以總色澤值E表示色澤的變化。

L為白度，0為黑，100為白；a為紅綠值，＞0為紅，＜0為綠；b為黃藍(lán)值，＞0為黃，＜0為藍(lán)。

1.7 乳蛋白在膠束相和乳清相分布

1.7.1樣品制備

取25 mL乳樣用超速離心機(jī)進(jìn)行超高速離心（90 000g，40 min，25℃），分別收集上清液和下層凝膠定容于25 mL。上清液為乳清相，下層凝膠為酪蛋白膠束相。分別取1 mL脫脂乳、膠束相、乳清相用3倍裂解液（6 mol/L GdnHCl，0.1 mol/L Bis-Tris和5.37 mmol/L檸檬酸鈉，p H 7）溶解稀釋，經(jīng)孔徑0.45μm的纖維素濾膜過濾后，直接上機(jī)分析。

1.7.2高效液相色譜測(cè)定乳蛋白

參考李海梅等人方法并改進(jìn)[9]，采用反向高效液相色譜法測(cè)定樣品中蛋白含量。色譜柱為Jupiter C8 column(250 mm×4.6 mm,300?-sized pores,5μm sized particles)。流動(dòng)相A為含0.1%(體積分?jǐn)?shù))TFA的超純水溶液，流動(dòng)相B為含0.1%TFA的乙腈溶液；柱溫為25℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為218 nm；進(jìn)樣量為20μL；流速為0.8 mL/min；梯度洗脫程序:0～40 min B液濃度從30%升到50%；40～42 min B液濃度從50%升到100%；42～43 min B液濃度為100%；43～46 min B液濃度從100%降到30%，最后用初始濃度30%B洗脫5 min。洗脫時(shí)間（包含柱平衡時(shí)間）共計(jì)51 min。

1.8 蛋白糖基化位點(diǎn)測(cè)定

1.8.1樣品制備

脫脂牛乳樣品用超純水10倍稀釋，取100 mg稀釋樣品溶于200μL 100 mmol/L NH4HCO3溶液中，析出蛋白復(fù)溶于裂解液（7 mol/L尿素，2 mol/L硫脲，50 mmol/L DTT和50 mmol/L Tris）中，25℃孵育18 h。蛋白通過甲醇氯仿溶液沉淀并復(fù)溶于50μL 100 mmol/L NH4HCO3溶液中。加入20μL 150 mmol/L碘乙酰胺溶液，混勻后于25℃避光孵育30 min。加入5μg測(cè)序級(jí)胰蛋白酶（Promega）于37℃過夜消化。冷卻至室溫后過3 ku濾膜，制得肽段溶液。

1.8.2 UHPLC-MS-MS測(cè)定蛋白肽

參考Liu等人的方法并改進(jìn)[15]，待測(cè)肽段溶液采用超高效液相色譜與靜電場(chǎng)軌道離子阱質(zhì)譜聯(lián)用（UHPLC-Q-Orbitrap，Thermo Fisher Scientific,MO,USA）分析。10μL樣品上樣于C18色譜柱（Thermo Scientific Easy Column,3μm,100 mm×75μm），流動(dòng)相A為0.1%甲酸水溶液，流動(dòng)相B為0.1%甲酸的84%乙腈溶液；梯度條件為：0～50 min B液濃度0%～35%，50～55 min B液濃度35%～100%，55～60 min B液濃度為100%。質(zhì)譜參數(shù)如下：噴霧電壓：2.2 k V；毛細(xì)管溫度：200℃；質(zhì)譜掃描方式為Full MS（top10）模式；質(zhì)譜軸范圍：300～1 800 m/z；目標(biāo)AGC值：3e6；最大注入時(shí)間：10 ms。

1.9 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)庫(kù)搜索采用MaxQuant software version 1.3.0.5。修飾化位點(diǎn)為：lactulosyllysine on Lys(+324.105647),fructosyllysine on Lys(+162.052824),Nε-carboxymethy llysine(CML)on Lys(+58.005479)。修飾化位點(diǎn)的相對(duì)定量是以對(duì)照組是以原乳中各修飾化位點(diǎn)信號(hào)強(qiáng)度為1，巴氏奶和UHT奶與其的比值作為分值。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理及圖表的制作使用Origin 9.0軟件，顯著性分析使用SPSSStatistics 19.0軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 UHT奶貯藏過程中基本性質(zhì)的變化

UHT奶在貯藏過程中p H，菌落總數(shù)，纖溶酶含量，總蛋白氮（TN），非蛋白氮（NPN），乳清蛋白氮（WPN）和酪蛋白氮（CN）變化如表1所示。結(jié)果表明：UHT奶在6個(gè)月的常溫貯藏過程中，p H從6.88降低到6.68，TN含量變化不顯著（P＞0.05），CN從4.53 g/L下降到3.88 g/L，WPN從0.66 g/L下降到0.53 g/L，NPN從0.27 g/L增加到1.74 g/L。UHT奶在貯藏過程中，菌落總數(shù)在長(zhǎng)期貯藏中變化并不顯著（P＞0.05）。纖溶酶含量呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)。

表1 貯藏過程中UHT奶pH，總蛋白氮，非蛋白氮，乳清蛋白氮，酪蛋白氮，菌落總數(shù)和纖溶酶含量變化

非蛋白氮含量發(fā)生了增長(zhǎng)，說(shuō)明在貯藏過程中乳蛋白都發(fā)生了一定程度的水解。UHT工藝相對(duì)較強(qiáng)的加熱強(qiáng)度，使得只有28%的纖溶酶存在于UHT奶，這與之前的報(bào)道結(jié)果（30%～40%存在于UHT奶中）基本一致[16]。但該加熱強(qiáng)度對(duì)纖溶酶原及其激活劑并沒有影響，相反導(dǎo)致纖溶酶抑制劑失活。因此，在常溫貯藏0～4個(gè)月過程中，纖溶酶含量逐漸上升。而在4個(gè)月之后，纖溶酶含量產(chǎn)生一定程度的下降，原因目前尚不清楚，可能是因?yàn)榈鞍椎乃獾纫蛩卦斐衫w溶酶含量產(chǎn)生下降。

2.2 酪蛋白膠束平均粒徑和zeta電位變化

采用動(dòng)態(tài)光散射（DLS）方法測(cè)定貯藏過程中牛乳酪蛋白膠束粒徑和Zeta電位，結(jié)果如圖1所示。原乳中酪蛋白膠束平均粒徑為～189 nm。經(jīng)過UHT工藝后酪蛋白膠束平均粒徑增加了～26 nm。在6個(gè)月常溫貯藏中，平均粒徑從215 nm增大到296 nm。同時(shí)酪蛋白膠束的zeta電位發(fā)生顯著增大（P＜0.05）。

圖1 貯藏期間UHT奶中膠束平均粒徑及zeta電位的變化

熱處理會(huì)導(dǎo)致乳清蛋白的變性，變性的乳清蛋白會(huì)結(jié)合到酪蛋白膠束表面，進(jìn)而使其粒徑增大[17]。常溫長(zhǎng)期貯藏過程中酪蛋白粒徑和zeta電位增大，說(shuō)明蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，穩(wěn)定性下降，蛋白相互作用程度更多強(qiáng)烈，使乳中發(fā)生更顯著的蛋白團(tuán)聚、膠凝現(xiàn)象，這種蛋白團(tuán)聚會(huì)影響膠束光散射特性使粒徑測(cè)定結(jié)果增大。

2.3 UHT奶在貯藏期中流變性的變化

黏度系數(shù)K反映流體的表觀黏度，而n反映流體的剪切能力，n值越大，說(shuō)明流體呈現(xiàn)出越強(qiáng)的剪切變稠能力。對(duì)貯藏期UHT奶的流變特性進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如圖2所示。UHT奶在加熱和貯藏過程中黏度系K數(shù)逐漸增大，流動(dòng)行為指數(shù)n逐漸降低。

圖2 貯藏過程中巴氏奶和UHT奶的黏度系數(shù)和流動(dòng)行為指數(shù)的變化

熱處理后K值增大是因?yàn)闊崽幚砗笞冃缘娜榍宓鞍捉Y(jié)合在膠束表面增加了膠束粒徑，同時(shí)熱誘導(dǎo)聚合物的形成共同導(dǎo)致了K的增大。而在貯藏過程中，膠束粒徑增大，蛋白團(tuán)聚等原因共同造成了K的增大[18]。而n＜1說(shuō)明液體奶是剪切變稀型流體，隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)出更明顯的剪切變稀能力，說(shuō)明整個(gè)液態(tài)奶體系穩(wěn)定性趨于下降。這與貯藏過程酶的水解，膠束呈現(xiàn)更加松散結(jié)構(gòu)有著必然關(guān)系[5]。

2.4 UHT奶和巴氏奶貯藏過程乳蛋白組分的變化

采用HPLC測(cè)定貯藏過程中每種蛋白組分含量（見表2）。UHT奶在貯藏過程中，酪蛋白和乳清蛋白都發(fā)生不同程度的水解，κ-CN從4.00 g/L下降到3.64 g/L，αs-CN從14.44 g/L下降到13.30 g/L，β-CN從10.30 g/L下降到5.64 g/L，β-lg從3.86 g/L下降到3.13 g/L，α-la從1.42 g/L下降到1.14 g/L。其中β-CN最為顯著（β-CN含量減少45%）。

蛋白水解的原因除熱處理造成少量蛋白水解外[19]，主要是因?yàn)閮?nèi)源性和外源性酶對(duì)乳蛋白的水解[5]。纖溶酶作為主要的內(nèi)源性酶，傾向于水解β-CN，其次為αs-CN，對(duì)κ-CN基本不水解[20]。UHT奶中含有0.8 mg/L的纖溶酶在室溫條件下貯藏6周會(huì)導(dǎo)致60%以上的β-CN水解[21]。而存活于UHT奶中的耐熱菌熒光假單胞菌分泌的AprX酶傾向于水解αs-CN，β-CN和κ-CN[21]，Zhang[21]等人研究發(fā)現(xiàn)UHT奶中含有10 mg/L的AprX酶在室溫條件下貯藏6周會(huì)導(dǎo)致κ-CN水解80%，αs1-CN水解20%，β-CN水解15%。UHT奶中纖溶酶含量和菌落總數(shù)都相對(duì)較低，因此UHT奶在6個(gè)月常溫貯藏中κ-CN含量減少9%，αs-CN減少8%，β-CN減少45%。

表2 UHT奶中各主要蛋白在貯藏過程中含量變化

2.5 乳蛋白在膠束相和乳清相中的分布

采用RP-HPLC測(cè)定了原乳和貯藏期內(nèi)UHT奶和巴氏奶中酪蛋白和乳清蛋白組分在膠束相和乳清相中的分布，結(jié)果如圖3所示。熱處理后，更多的酪蛋白進(jìn)入乳清相中，其中κ-CN最為顯著（34%κ-CN從膠束相進(jìn)入乳清相），而乳清蛋白在膠束相中的比例升高（30%β-lg進(jìn)入膠束相）。在常溫貯藏過程中，αs-CN，β-CN在兩相的分布變化并不顯著，κ-CN，β-lg，α-la在膠束相中比例不斷增大（κ-CN從65%增大到80%，β-lg從32%增大到50%，α-la從20%增大到38%）。蛋白分布的改變主要集中在前2個(gè)月。

熱處理會(huì)引起乳清蛋白變性且與κ-CN通過二硫鍵結(jié)合形成κ-CN/乳清蛋白熱誘導(dǎo)聚合物，其在膠束表面和乳清中皆有分布[22]。在貯藏過程中，部分變性的乳清蛋白和從膠束上解聚κ-CN重新結(jié)合在膠束表面。液相測(cè)的κ-CN和乳清蛋白在膠束相中的增加量比例都約為1:2.5，這與乳清相中熱誘導(dǎo)聚合物中κ-CN/乳清蛋白的比例基本一致[23-24]，意味著κ-CN和乳清蛋白可能是以乳清中游離的熱誘導(dǎo)聚合物的形式重新結(jié)合到膠束表面。

2.6 UHT奶貯藏過程中色澤變化

色澤是反映牛乳在加工貯藏過程中美拉德反應(yīng)程度最直接的指標(biāo)。在加工貯藏中，UHT奶色澤發(fā)生了顯著變化（P＜0.05）（如圖4）。UHT奶的色澤E值增大，是由于乳清蛋白變性程度較大，在乳清相中形成大量熱誘導(dǎo)聚合物，熱誘導(dǎo)聚合物對(duì)光線反射率增強(qiáng)，從而使UHT奶的色澤E值增大[25]。但是在UHT奶貯藏過程中，色澤E值逐漸降低，說(shuō)明UHT奶在長(zhǎng)期貯藏過程中發(fā)生非酶褐變，即美拉德反應(yīng)。

2.7 乳蛋白乳糖基化位點(diǎn)

通過LC-MSMS對(duì)乳蛋白中乳糖基化位點(diǎn)進(jìn)行測(cè)定，通過與原乳中各位點(diǎn)的信號(hào)強(qiáng)度比較，對(duì)乳糖基化位點(diǎn)進(jìn)行相對(duì)定量測(cè)定，如表3和表4所示。熱處理后主要乳蛋白都產(chǎn)生不同程度的乳糖基化，酪蛋白乳糖基化的位點(diǎn)明顯多于乳清蛋白，αs1-CN修飾位點(diǎn)最多（4個(gè)）。αs2-CN的Lys173和κ-CN的Lys46位點(diǎn)含量變化最為顯著，說(shuō)明這兩個(gè)位點(diǎn)對(duì)熱強(qiáng)度變化最為敏感，是潛在的熱強(qiáng)度指示物。在貯藏過程中，糖基賴氨酸和CML含量都隨著貯藏時(shí)間而逐漸增大，這意味著美拉德反應(yīng)在貯藏過程中繼續(xù)產(chǎn)生，這與色澤變化結(jié)果相一致。

圖3 貯藏過程中UHT奶中5種主要蛋白在膠束相和乳清相中的分布（%）

圖4 貯藏過程中液體奶色澤變化

表3 貯藏過程中Nε-羧甲基賴氨酸（CML）的相對(duì)含量*

表4 貯藏過程中半乳糖基賴氨酸的相對(duì)含量*

3 結(jié) 論

UHT奶中纖溶酶含量增大而菌落總數(shù)變化并不顯著。在內(nèi)外源酶的作用下主要蛋白都發(fā)生不同程度水解，因而非蛋白氮含量增大。酪蛋白膠束平均粒徑在貯藏過程增大81 nm，zeta電位逐漸降低，說(shuō)明膠束穩(wěn)定性逐漸下降。在貯藏過程中UHT奶黏度系數(shù)K逐漸增大，流動(dòng)行為指數(shù)n逐漸降低，意味著牛乳隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)表觀黏度增大，且呈現(xiàn)出更明顯的剪切變稀能力。通過HPLC對(duì)乳蛋白在膠束相和乳清相中的分布進(jìn)行定量分析：熱處理后，UHT奶中34%的κ-CN進(jìn)入乳清相。而貯藏過程中膠束相中κ-CN，β-lg，α-la比例不斷增大，其中15%的κ-CN，18%的β-lg，18%的α-la進(jìn)入膠束相。這些蛋白可能是以熱誘導(dǎo)聚合物的形式重新結(jié)合到膠束表面，導(dǎo)致粒徑增大。貯藏過程中UHT奶色澤逐漸降低，半乳糖基賴氨酸和CML含量不斷增加，說(shuō)明UHT奶在長(zhǎng)期貯藏過程中美拉德反應(yīng)持續(xù)進(jìn)行。