頂空固相微萃取/氣質(zhì)聯(lián)用（HS-SPME/GC-MS）對(duì)奶牛大腸桿菌性乳腺炎診斷方法的建立

武守艷，董春光，楊麗華，韓文儒，劉文俊，陳劍波，韓一超

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧醫(yī)研究所，太原030032）

0 引 言

固相微萃取(solid-phase microextraction,SPME)技術(shù)是20世紀(jì)90年代興起的一項(xiàng)新穎的樣品前處理與富集技術(shù)，是在固相萃取技術(shù)上發(fā)展起來(lái)的一種微萃取分離技術(shù)，是一種集采樣，萃取，濃縮和進(jìn)樣于一體的無(wú)溶劑樣品微萃取新技術(shù)。固相微萃取技術(shù)幾乎可以用于氣體、液體、生物、固體等樣品中各類揮發(fā)性或半揮發(fā)性物質(zhì)的分析。

奶牛大腸桿菌性乳房炎是奶牛的常見(jiàn)多發(fā)性疾病，嚴(yán)重影響奶牛養(yǎng)殖業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益[1]。細(xì)菌揮發(fā)性代謝產(chǎn)物是細(xì)菌代謝產(chǎn)物的重要組成部分，與細(xì)菌生命活動(dòng)和細(xì)菌生長(zhǎng)數(shù)列密切關(guān)聯(lián)，是細(xì)菌與周圍各種生物進(jìn)行交流的重要信息素[2]。大多數(shù)細(xì)菌釋放的揮發(fā)性代謝物都具有微生物種屬特異性[3-4]，所以，細(xì)菌揮發(fā)性代謝產(chǎn)物作為一種新的檢測(cè)靶標(biāo)成為了診斷細(xì)菌感染的有效方法[5-6]。應(yīng)用頂空固相微萃取/氣質(zhì)聯(lián)用（HS-SPME/GC-MS）技術(shù)分析大腸桿菌污染鮮牛乳產(chǎn)生的特征性揮發(fā)代謝產(chǎn)物組，為奶牛大腸桿菌性乳房炎的早期診斷方法的建立提供理論基礎(chǔ)。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 材料與試劑

全脂巴氏殺菌乳，市售；營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC25922，購(gòu)自中國(guó)獸藥監(jiān)察所；無(wú)菌發(fā)酵管，實(shí)驗(yàn)室自制；無(wú)菌頂空進(jìn)樣瓶、20 mL裝有倒立發(fā)酵管的營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)室自制。

1.2 儀器與設(shè)備

TRACE 1300ISD型（GC-MS）氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國(guó)Thermo公司；SPME手柄及50/30 um DVB/CAR/PDMS(二乙基苯/碳分子篩//聚二甲基硅氧烷)萃取頭。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1鮮奶的無(wú)菌檢驗(yàn)

在無(wú)菌條件下取市售的鮮牛奶1 mL，轉(zhuǎn)移至20 mL含倒立發(fā)酵管的營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基試管中，加蓋密封，振蕩混勻，排盡倒立管中的空氣，試驗(yàn)設(shè)4個(gè)平行管，然后置于37℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

1.3.2菌液的制備

取-80℃保存的大腸桿菌接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24 h后可見(jiàn)生長(zhǎng)良好的凸起、光滑、濕潤(rùn)、乳白色、邊緣整齊或不太整齊的中等偏大菌落。

利用0.5號(hào)麥?zhǔn)媳葷峁苤苽?.5×108CFU/mL的大腸桿菌菌液，經(jīng)梯度稀釋后得到1.5×107CFU/mL的大腸桿菌菌液備用。

1.3.3待檢樣品的制備

用無(wú)菌移液管移取9 mL鮮奶加入1 mL濃度為1.5×107CFU/mL大腸桿菌菌液，制備成1.5×106CFU/m L的大腸桿菌污染的牛奶樣品，以同樣的方法制備1.5×105CFU/mL、1.5×104CFU/mL、1.5×103CFU/mL四個(gè)梯度濃度大腸桿菌污染的牛奶樣品。

分別用4個(gè)無(wú)菌移液管移取3 mL上述大腸桿菌污染的牛奶樣品置于無(wú)菌頂空進(jìn)樣瓶中，每個(gè)濃度做3個(gè)平行管，同時(shí)用1個(gè)無(wú)菌移液管移取3 mL無(wú)菌鮮牛奶置于無(wú)菌頂空進(jìn)樣瓶中作為空白對(duì)照。

空白對(duì)照于4℃保存，菌液污染的牛奶均在37℃下培養(yǎng)24 h，然后同時(shí)應(yīng)用HS-SPME/GC-MS技術(shù)進(jìn)行測(cè)定。

1.3.4 HS-SPME/GC-MS檢測(cè)條件

萃取條件：45℃加熱10 min，吸附20 min，解吸附5 min。

進(jìn)樣：把SPME緩慢插入GC-MS進(jìn)樣口進(jìn)樣，解吸5 min。

進(jìn)樣口溫度270℃，分流比10∶1，載氣為氦氣，流速1 m L/min，色譜柱Thermo（30 m×0.25 mm×0.25μm），升溫程序：40℃保持3 min，5℃/min升到150℃，10℃/min升到250℃，保持5 min，整個(gè)程序40 min。質(zhì)譜條件：EI離子源，離子源溫度：280℃，傳輸線溫度：280℃，掃描質(zhì)量范圍：45～500 amu。

2 結(jié) 果

2.1 鮮奶無(wú)菌檢驗(yàn)結(jié)果

鮮奶置于37℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，結(jié)果可見(jiàn)4支試管的倒立管中均無(wú)氣泡產(chǎn)生，證明鮮奶樣品無(wú)細(xì)菌污染。

2.2 HS-SPME/GC-MS檢測(cè)結(jié)果

采用頂空固相微萃取氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(HS-SPME/GC-MS)技術(shù)檢測(cè)的不同濃度大腸桿菌污染的牛奶和空白鮮牛奶的揮發(fā)性物質(zhì)的圖譜見(jiàn)圖1～5。

圖1 空白鮮牛奶的揮發(fā)性代謝產(chǎn)物GC-MS譜圖

圖2 大腸桿菌（1.5×106 CFU/mL）污染的鮮牛奶揮發(fā)性代謝產(chǎn)物GC-MS譜圖

圖3 大腸桿菌（1.5×105 CFU/mL）污染的鮮牛奶揮發(fā)性代謝產(chǎn)物GC-MS譜圖

圖4 大腸桿菌（1.5×104 CFU/mL）污染的鮮牛奶揮發(fā)性代謝產(chǎn)物GC-MS譜圖

圖5 大腸桿菌（1.5×103 CFU/mL）污染的鮮牛奶揮發(fā)性代謝產(chǎn)物GC-MS譜圖

從上圖可以看出，大腸桿菌污染的鮮牛奶譜圖與空白鮮牛奶的譜圖中的峰高度不同且有新峰出現(xiàn)，說(shuō)明兩組的揮發(fā)性代謝產(chǎn)物具有一定的差異。且隨著感染細(xì)菌濃度的降低,產(chǎn)生的揮發(fā)性代謝產(chǎn)物的量也隨之減少。

應(yīng)用NIST MSSearch 2.0質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)的質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算機(jī)檢索比對(duì)，并對(duì)檢索結(jié)果進(jìn)行解析，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 大腸桿菌污染的牛奶和空白鮮牛奶的揮發(fā)性物質(zhì)差異

從表中可知，空白鮮牛奶組和大腸桿菌污染的牛奶組共同的揮發(fā)性物質(zhì)有2-庚酮、2-壬酮、2-十一酮；空白鮮牛奶組特有的揮發(fā)性物質(zhì)為角鯊烯；大腸桿菌污染的牛奶組特有的揮發(fā)性物質(zhì)為乙醇、乙酸、苯并噻唑、正辛酸、正癸酸。

3 討 論

本試驗(yàn)結(jié)果大腸桿菌污染鮮奶產(chǎn)生的乙酸和乙醇都是在大腸桿菌發(fā)酵時(shí)代謝葡萄糖產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，反 應(yīng) 方 程 式 為：C6H12O6→2C2H5OH+2CO2，C6H12O6→2CH3CH2OH+2CO2。辛酸和癸酸的產(chǎn)生與試驗(yàn)牛奶樣品的來(lái)源有關(guān)，市售巴氏殺菌牛奶中還添加了一些食品添加劑，該牛奶的成分與直接從奶牛身體擠出來(lái)的牛奶會(huì)有一些不同。苯并噻唑的產(chǎn)生推測(cè)在大腸桿菌發(fā)酵時(shí)利用牛奶中的糖和氨基酸產(chǎn)生的中間代謝產(chǎn)物通過(guò)兩個(gè)合成路線合成的，第一是二氨基苯硫醇+乙氧基乙醛二乙基乙縮醛→苯并噻唑，第二是乙氧基乙醛二乙基乙縮醛→苯并噻唑。

從試驗(yàn)結(jié)果可以看出，大腸桿菌污染的牛奶與無(wú)菌牛奶揮發(fā)性代謝物有明顯的差異，大腸桿菌污染的牛奶可以產(chǎn)生乙醇、乙酸、苯并噻唑、正辛酸、正癸酸這些特異性物質(zhì)，可用于檢測(cè)大腸桿菌污染的牛奶。

固相微萃取(solid-phase microextraction,SPME)技術(shù)是20世紀(jì)90年代興起的一項(xiàng)新穎的樣品前處理與富集技術(shù)，頂空(固相微萃取)技術(shù)的特點(diǎn)是對(duì)于一些揮發(fā)性組分以及半揮發(fā)性組分靈敏度較好，能得到穩(wěn)定可靠地定性定量結(jié)果；對(duì)于一些含量較低，低揮發(fā)性的組分來(lái)說(shuō)，固相微萃取技術(shù)能有效的起到一個(gè)富集的作用?，F(xiàn)已在環(huán)境、生物、工業(yè)、食品、臨床醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的各個(gè)方面得到廣泛的應(yīng)用，該技術(shù)應(yīng)用前景廣泛。

頂空(固相微萃取)技術(shù)的基本原理簡(jiǎn)單來(lái)講，頂空就是一種進(jìn)樣方式。將待測(cè)樣本置于一恒溫密閉容器中，通過(guò)加熱升溫使得揮發(fā)性組分從樣本中揮發(fā)出來(lái)，在頂空瓶里面的氣液(氣固)兩相中達(dá)到熱力學(xué)平衡之后，直接抽提頂部氣體打入氣相色譜質(zhì)譜儀器中進(jìn)行分離分析，從而進(jìn)行一些揮發(fā)性或者氣味物質(zhì)的檢測(cè)的原理。固相微萃取技術(shù)的作用就是在抽提氣體樣本的時(shí)候采用涂有固定相的熔融石英纖維來(lái)進(jìn)行吸附、富集，然后再解吸進(jìn)樣的這樣一個(gè)原理；頂空(固相微萃取)技術(shù)主要用于氣體，液體或者固體樣本中揮發(fā)性組分或者半揮發(fā)性組分，氣味物質(zhì)，香味物質(zhì)的檢測(cè)。

微生物的揮發(fā)性代謝產(chǎn)物是微生物代謝產(chǎn)物的重要組成部分，是人類了解微生物生命活動(dòng)本質(zhì)規(guī)律的重要窗口,也是提高微生物利用價(jià)值的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。近年來(lái)隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，奶牛乳房炎的診斷技術(shù)不斷發(fā)展，因此，基于細(xì)菌揮發(fā)性代謝產(chǎn)物具有微生物種屬特異性這一特征，本實(shí)驗(yàn)研究為開辟奶牛細(xì)菌性乳房炎新型診斷技術(shù)提供了堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)，使得頂空固相微萃取/氣質(zhì)聯(lián)用（HS-SPME/GC-MS）技術(shù)在疾病診斷中得到廣泛的應(yīng)用。