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    補腎健骨類中藥活性成分對高糖誘導(dǎo)成骨細胞的保護作用及機制研究*

    2021-04-22 10:13:04王緒平黃孝聞王娜妮張子玥
    浙江中醫(yī)雜志 2021年4期
    關(guān)鍵詞:補骨脂藿苷高糖

    王緒平 張 揚# 黃孝聞 王娜妮 張 麗 張子玥 壽 旦

    1 浙江省中醫(yī)藥研究院 浙江 杭州 310007

    2 浙江中醫(yī)藥大學 浙江 杭州 310053

    3 上海財經(jīng)大學浙江學院 浙江 金華 321013

    糖尿病性骨質(zhì)疏松癥(DOP)是糖尿病并發(fā)骨量減少,易骨折的疾病,近年發(fā)病率呈上升趨勢。目前DOP的治療存在療效不確切、藥物不良反應(yīng)等問題[1]。因此尋找安全有效的DOP治療藥物具有重要價值和現(xiàn)實意義。

    中醫(yī)學認為DOP屬于“消渴”“骨痿”范疇,補腎固本是其治療大法[2]。補腎健骨類中藥淫羊藿、骨碎補、補骨脂、菟絲子、女貞子等是治療該癥的中藥,文獻資料表明該類中藥具有促進骨愈合的作用[3,4]。有關(guān)DOP的研究表明,高濃度葡萄糖對成骨細胞的增殖、分化和礦化產(chǎn)生明顯的抑制作用[5,6]。胰島素受體底物(IRS1)作為調(diào)節(jié)β細胞功能的重要信號分子,通過PI3K通路調(diào)節(jié)胰島素分泌[7]。PI3K/AKT通路也與骨代謝關(guān)系密切。胰島素依賴型糖尿病通過抑制AKT,減弱骨形成[8]。

    本研究擬拓展對補腎健骨類中藥在骨類疾病中的作用研究,通過建立高糖誘導(dǎo)的成骨細胞模型,檢測IRS1表達,闡明淫羊藿苷等補腎健骨類中藥活性成分保護高糖誘導(dǎo)成骨細胞的作用機制,為中藥在DOP的研發(fā)方面提供研究基礎(chǔ)。

    1 儀器與試劑

    1.1 實驗動物:新生大鼠由浙江省中醫(yī)藥研究院動物房提供,購于浙江省動物實驗中心,動物實驗許可證號:SYXK(浙)20190010。

    1.2 儀器:311型二氧化碳細胞培養(yǎng)箱(Thermo Scientific,USA);ECLIPSE Ti型倒置熒光顯微鏡(Nikon,Japan);microfuge 20R小型高速冷凍離心機(BECKMAN COULTER);Spectra Max 190全波長酶標儀(Molecular Devices,USA);NEST細胞培養(yǎng)板培養(yǎng)皿(無錫耐思生物科技有限公司);AE240電子天平(Switzerland);超低溫冰箱(Thermo,USA);超低溫冰箱(Thermo,USA);美國ABI RT-PCR儀。

    1.3 藥品及試劑:柚皮苷(中國藥品生物制品檢定所,批號:110722-201910);補骨脂二氫黃酮(寶雞市辰光生物科技有限公司,批號:20191103);淫羊藿苷對照品(中國藥品生物制品檢定所,批號:110703-201809);DMEM培養(yǎng)基(吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司,批號:1712201806);胎牛血清(Gibco,批號:1907133);MTT細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司,批號:20180828);DMSO(VETEC,批號:WXBC1590V);胰蛋白酶、Ⅱ型膠原蛋白酶均購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。β-actin、IRS1、AKT、Runx2引物合成,生工生物工程(上海)股份有限公司;BioRT cDNA First Strand Synthesis Kit(杭州博日科技有限公司,批號:20190601);BioEasy SYBR Green I Real Time PCR Kit(杭州博日科技有限公司,批號:20190902);AKT抗體(批號:ab66138)、Runx2抗體(批號:ab76956)、GAPDH抗體(批號:ab181602)、辣根酶標記山羊抗兔IgG(批號:ab6721)及山羊抗鼠IgG(批號:ab8245)(英國Abcam公司)。

    2 方法

    2.1 原代大鼠成骨細胞培養(yǎng):將新生24h內(nèi)的Wistar大鼠,引頸處死,75%酒精消毒。無菌操作取顱蓋骨。將顱蓋骨置于含DMEM液的培養(yǎng)皿中,盡量去除顱蓋骨上的骨膜、血管及結(jié)締組織,DMEM液反復(fù)洗滌至骨片發(fā)白。將骨片置于0.25%胰蛋白酶-EDTA液中,用剪刀剪成1mm×1mm×1mm的組織塊。先后用0.25%胰蛋白酶-EDTA液與0.1%Ⅱ型膠原酶37℃水浴消化。離心棄上清,DMEM液重懸,離心棄上清。用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液重懸,吹打均勻,接種至培養(yǎng)瓶中。37℃、5% CO2條件下培養(yǎng),每3d換液1次。待細胞長滿后,用0.25%胰蛋白酶-EDTA 液消化傳代接種適宜的實驗器皿中,37℃、5% CO2條件下培養(yǎng),用倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)及生長狀況,收集細胞進行后續(xù)實驗。

    2.2 實驗分組與給藥:取第3代生長良好的大鼠成骨細胞,以1×105接種于96孔板,實驗分4組:空白組、葡萄糖高劑量組(45mmol/L)、葡萄糖中劑量組(30mmol/L)和葡萄糖低劑量組(20mmol/L)。培養(yǎng)24h充分貼壁后,各組更換不同濃度葡萄糖培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng)24h,48h,72h后測定。

    精確稱取相應(yīng)對照品柚皮苷、補骨脂二氫黃酮、淫羊藿苷,用PBS液配成0.3mg/ml,臨用前用DMEM培養(yǎng)液進行梯度稀釋,0.22μm濾器除菌,4℃保存?zhèn)溆?。取上述實驗中葡萄糖誘導(dǎo)的成骨細胞最佳濃度為高糖成骨細胞模型。分別加入前期預(yù)實驗結(jié)果中最佳濃度的柚皮苷、補骨脂二氫黃酮、淫羊藿苷對照品。

    2.3 MTT法測定成骨細胞活性:取生長良好的大鼠成骨細胞,以1×105接種于96孔板中,實驗分為5組:空白組、葡萄糖組、柚皮苷組、補骨脂二氫黃酮組和淫羊藿苷組,各組分別加入相應(yīng)培養(yǎng)液作用24h、48h、72h后,采用MTT法測定各組不同培養(yǎng)時間的成骨細胞活力,按照公式計算細胞存活率:細胞存活率=(A實驗組/A對照組)×100%。

    2.4 RT-PCR檢測成骨細胞PI3K、IRS1、Runx2的mRNA表達水平:大鼠成骨細胞接種于6孔板中,實驗分為5組:空白組、模型組(加入30mmol/L的葡萄糖)、柚皮苷組、補骨脂二氫黃酮組及淫羊藿苷組。柚皮苷組、補骨脂二氫黃酮組、淫羊藿苷組分別選取前期實驗中最佳給藥濃度進行給藥,各組分別加入相應(yīng)培養(yǎng)液作用24h,用Trizol法提取總RNA,按照試劑盒說明進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和實時熒光定量PCR檢測。以β-actin為內(nèi)參基因,采用ΔΔCt法進行分析,PCR引物序列見表1。

    表1 實時熒光定量PCR引物序列

    2.5 Western Blot檢測成骨細胞AKT、IRS1、Runx2蛋白表達的影響:大鼠成骨細胞按“2.1”和“2.4”培養(yǎng)細胞,并給藥,給藥后48h收集各組細胞,裂解并提取總蛋白。用BCA法測定樣本蛋白濃度,各組取20μg蛋白進行電泳,室溫下,半干法轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,封閉液封閉。封閉后與1∶1000稀釋的一抗(AKT、IRS1、Runx2、GAPDH抗體)4℃孵育過夜。次日加相應(yīng)二抗室溫下孵育1h,PBST洗滌PVDF膜3次,每次5min,BioRad系統(tǒng)曝光。收集條帶用“Image Lab”軟件量化。

    2.6 統(tǒng)計學處理:實驗數(shù)據(jù)和資料用均數(shù)±標準差表示,采用SPSS 20.0統(tǒng)計學軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析,采用配對t檢驗(a=0.05),比較各組間實驗結(jié)果,并進行差異分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

    3 結(jié)果

    3.1 高糖誘導(dǎo)的成骨細胞形態(tài)學觀察:倒置顯微鏡下可見,正常成骨細胞接種后懸浮在培養(yǎng)液中,形態(tài)為圓形透亮的小顆粒,4h后即可見部分細胞貼壁,并開始逐步伸展。24h后活細胞逐漸伸出偽足樣的突起,形態(tài)多不規(guī)則,胞漿豐富,胞核較圓,輪廓清晰。48h后可見主要為梭形,5d左右貼滿瓶壁,不規(guī)則排列。約14d左右開始形成礦化結(jié)節(jié),可逐漸增大,呈簇狀。高糖環(huán)境下成骨細胞形態(tài)與空白對照組的細胞比較,模型組的細胞經(jīng)高糖作用7天后細胞數(shù)目明顯減少,胞體收縮,突起變短,細胞核縮小,不規(guī)則。見圖1。

    圖1 不同培養(yǎng)時間和高糖誘導(dǎo)的原代大鼠成骨細胞形態(tài)圖

    3.2 高糖作用對成骨細胞增殖的影響:高糖對成骨細胞存活率的影響見表2。由表2可知,葡萄糖高、中、低劑量組分別作用于成骨細胞24h后,與空白對照組比較,細胞活性均顯著增加,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。作用成骨細胞48h后,模型組的細胞活性下降,其中葡萄糖中劑量組下降最大。

    表2 高糖對成骨細胞存活率的影響(±s)

    表2 高糖對成骨細胞存活率的影響(±s)

    注:與空白對照組比較,#P<0.05,##P<0.01。

    劑量(mmol/L)組別空白對照組葡萄糖低劑量組葡萄糖中劑量組葡萄糖高劑量組72h 0.310±0.038 0.216±0.081#0.163±0.020##0.179±0.027##5.5 20.0 30.0 45.0 24h 0.165±0.018 0.286±0.081##0.233±0.061#0.215±0.042#吸光度(OD值)48h 0.267±0.028 0.248±0.017 0.209±0.020#0.240±0.032#

    在高糖作用成骨細胞72h后,模型組的細胞活性繼續(xù)下降,各劑量組與正常成骨細胞活性的空白對照組比較,有顯著性差異(P<0.05),其中葡萄糖中劑量組下降最大。結(jié)果表明,成骨細胞在高糖環(huán)境下其細胞活力隨葡萄糖作用時間及濃度的變化而變化,其中葡萄糖中劑量組對細胞損傷最大,故后續(xù)試驗選用葡萄糖30mmol/L給藥,即為模型組。

    3.3 補腎健骨中藥活性成分促進高糖誘導(dǎo)成骨細胞的增殖作用:由表3可知,高糖作用48h、72h后與空白對照組相比吸光度(OD值)均顯著降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01),顯示模型組細胞生長活力下降。淫羊藿苷給藥48h后,與模型組比較OD值均顯著增加,顯示給藥組細胞生長活力上升(P<0.05,P<0.01),柚皮苷、補骨脂二氫黃酮組細胞增殖不明顯。提示淫羊藿苷能改善葡萄糖對成骨細胞生長的抑制作用。

    表3 3種成分對高糖成骨細胞存活率的影響(±s)

    表3 3種成分對高糖成骨細胞存活率的影響(±s)

    注:空白對照組比較,#P<0.05,##P<0.01;與模型組比較,*P<0.05,**P<0.01。

    組別空白對照組模型組柚皮苷組補骨脂二氫黃酮組淫羊藿苷組吸光度(OD值)72小時0.345±0.023 0.163±0.020##0.157±0.004 0.168±0.029 0.185±0.021劑量(mg/ml)—5.4000 0.0580 0.0324 0.0677吸光度(OD值)24小時0.169±0.019 0.216±0.032#0.185±0.026 0.206±0.072 0.203±0.038吸光度(OD值)48小時0.260±0.045 0.1819±0.033##0.193±0.010 0.203±0.011 0.221±0.014*

    3.4 中藥活性成分對高糖成骨細胞IRS1、AKT、Runx2的mRNA表達的影響:與空白對照組比較,模型組AKT、IRS1的mRNA的表達水平下降(P<0.05,P<0.01),與模型組比較,中藥活性成分柚皮苷、補骨脂二氫黃酮、淫羊藿苷均可上調(diào)AKT、IRS1、Runx2的mRNA表達(P<0.05,P<0.01),結(jié)果如表4所示。

    表4 3種成分對AKT、IRS1、Runx2的mRNA表達量的影響(±s)

    表4 3種成分對AKT、IRS1、Runx2的mRNA表達量的影響(±s)

    注:與空白對照組比較,#P<0.05,##P<0.01;與模型組比較,*P<0.05,**P<0.01。

    組別空白對照組模型組柚皮苷組補骨脂二氫黃酮組淫羊藿苷組Runx2 1.00±0.00 0.79±0.02#1.22±0.09*1.65±0.11*1.89±0.88*劑量(mg/ml)—5.4000 0.0580 0.0324 0.0677 AKT 1.00±0.00 0.84±0.07#2.27±0.30*1.56±0.21*1.65±0.13*IRS1 1.00±0.00 0.672±0.05##3.706±0.13**1.292±0.03**5.099±0.68*

    3.5 中藥活性成分對高糖成骨細胞AKT、IRS1、Runx2蛋白表達的影響:結(jié)果見圖2,與空白對照組比較,模型組細胞AKT、IRS1、Runx2的蛋白表達均顯著降低(P<0.05)。與模型組比較,中藥活性成分柚皮苷組、補骨脂二氫黃酮、淫羊藿苷組均能提高AKT、IRS1、Runx2的蛋白表達水平(P<0.05)。

    圖2 各組AKT、IRS1、Runx2蛋白水平表達情況

    4 討論

    項目組前期藥物篩選的研究提示,補腎健骨中藥骨碎補、補骨脂、淫羊藿中的有效成分柚皮苷、補骨脂二氫黃酮和淫羊藿苷,具有促進成骨細胞增殖作用。文獻顯示,上述3種成分均具有促進骨愈合的作用,能促進成骨細胞增殖和分化[8-11]。本研究結(jié)果表明,成骨細胞在高糖介入的環(huán)境中,其細胞活力隨葡萄糖作用時間及濃度的變化而變化,作用24h細胞活力增加,48h、72h細胞活力下降,細胞增殖呈先揚后抑趨勢。在高糖誘導(dǎo)的模型細胞中加入3種活性成分,結(jié)果提示淫羊藿苷能顯著增強高糖成骨細胞活力。

    有研究表明,骨質(zhì)疏松癥的相關(guān)信號通路中,BMPSmads、PI3K/AKT等信號通路主要作用于成骨細胞,促進骨形成[12,13]。BMP-Smads信號通路是成骨細胞增殖相關(guān)的關(guān)鍵及經(jīng)典通路,進入核內(nèi),激活Smad1/5/8,啟動磷酸化轉(zhuǎn)錄因子Runx2,上調(diào)特異性成骨細胞產(chǎn)物,促進骨基質(zhì)合成及礦化反應(yīng)[14,15]。

    本研究證實,我們選取的3種補腎中藥活性成分可調(diào)控高糖誘導(dǎo)下成骨細胞中的ISR1/AKT/Runx2信號通路,從而影響高糖介入環(huán)境下的大鼠成骨細胞。本實驗探究補腎健骨中藥有效成分保護高糖誘導(dǎo)成骨細胞的作用機制,為臨床防治DOP新藥的研發(fā)提供一定的理論基礎(chǔ)。

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