紅花桑寄生葉黃酮提取及其抗氧化性研究

陳志杰

(閩西職業(yè)技術(shù)學(xué)院 福建龍巖 364000)

黃酮類化合物具有多種顯著的生理活性因而有著重要的藥用價值。黃酮類化合物不僅可以防治心血管疾病，還有止咳、祛痰、抗菌的作用。目前國內(nèi)研究還發(fā)現(xiàn)黃酮具有高效的抗自由基和抗氧化的作用，可以清除體內(nèi)有害的氧化自由基并減少其對機(jī)體的損害，可以提高機(jī)體免疫能力，具有一定的抗癌能力[1]。

因而，黃酮作為一種天然的抗氧化性物質(zhì)，近年來受到國內(nèi)外廣泛關(guān)注。由于人工合成的抗氧化劑具有潛在的毒性和致癌作用，尋找天然的抗氧化劑已經(jīng)成為研究熱點(diǎn)，其中尋找合適的植物來源一直是科技工作者關(guān)注的問題。

紅花桑寄生(Scurrulaparasitica)是桑寄生科梨果寄生屬半寄生植物。在福建境內(nèi)，紅花桑寄生產(chǎn)于詔安、尤溪、廈門、同安、永春、南靖、福州、永泰、南平及連城等地，常寄生于銀杏、石榴、夾竹桃、桑、皂莢、樸樹、泡桐、女貞、沙梨、桂花及欒樹等30余種植物的樹上[2]，其野生資源豐富。前期的研究表明紅花桑寄生葉中含有豐富的黃酮醇類物質(zhì)[3]。為此，作者以福建產(chǎn)的紅花桑寄生的葉子為研究對象，提取紅花桑寄生葉黃酮(SpLF)，并以豬油作為氧化基質(zhì)研究探討SpLF的抗氧化活性以及它與其它抗氧化性的協(xié)同作用，旨在為紅花桑寄生葉黃酮的開發(fā)利用提供科學(xué)資料。

1 材料和方法

1.1 材料

樣品：采自寄生于夾竹桃樹枝上的紅花桑寄生葉片，經(jīng)烘干、粉碎后備用。

豬油：新鮮板油熬制，過濾后存于冰箱冷凍層備用。

1.2 主要試劑：2,6-二叔丁基對甲酚(簡稱BHT，化學(xué)純)、茶多酚(簡稱TP、福州日冕科技公司提供)、槲皮素(簡稱QC，上海試劑二廠)、乙醇、石油醚、冰醋酸、三氯甲烷、硫代硫酸鈉、碘化鉀、硫代巴比妥酸、氫氧化鈉、聚酰胺、可溶性淀粉、檸檬酸(CA)、維生素C(VC)等均為分析純。

1.3 主要儀器：752型紫外可見分光光度計、離心機(jī)、粉碎機(jī)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器、烘箱、恒溫水浴鍋、電子天平、二用紫外分析儀。

1.4 實驗方法

1.4.1 紅花桑寄生葉黃酮SpLF的制備

黃酮粗提液的制備：稱取一定量的葉粉末加入適量乙醇(體積分?jǐn)?shù)為80%～85%)于90 ℃水浴回流提取3次，每次2 h。經(jīng)抽濾得濾液，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮得浸膏。浸膏與少量聚酰胺粉拌合，烘干，以石油醚(沸程60～90 ℃)為溶液，用索式提取法去除浸膏的葉綠素等親脂性雜質(zhì)。

聚酰胺柱層析初步純化SpLF：用濕法裝柱，按每20 g聚酰胺粉上樣0.2～0.5 g葉粉末，含25～40 g聚酰胺粉末(200目)，分別用濃度體積分?jǐn)?shù)30%、60%、75%、90%、100%的乙醇進(jìn)行分段洗脫。各管洗脫液取0.5 mL，控制PH5.5左右，加0.1 mL的體積分?jǐn)?shù)10% AlCl3溶液，顯色10 min后，在UV下于510 nm處[4]觀察，合并在不同時間段洗脫出的具黃(綠)色斑點(diǎn)的洗脫液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮得浸膏，經(jīng)真空干燥得SpLF，計算SpLF得率為4.65%左右。

SpLF得率=m/M

其中m=干燥的黃酮粉質(zhì)量；M=紅花桑寄生葉質(zhì)量。

1.4.2 總黃酮含量的測定

采用三氯化鋁室溫顯色法[5]，步驟如下：配制1 mg/mL SpLF溶液，取2.5 mL上述溶液，加入10 mL 0.1mol/L三氯化鋁-甲醇溶液，充分振搖后，在λ 420 nm處測定A值，并以一系列標(biāo)準(zhǔn)濃度的蘆丁作標(biāo)樣，制定標(biāo)準(zhǔn)曲線，從回歸方程中計算總黃酮含量。

表1 SpLF協(xié)同增效因素水平表 %

1.4.3 SpLF對豬油抗氧化性實驗

1.4.3.1 豬油油樣的制備

取新鮮的熬制豬油50 g，共9份，其中一份作空白對照(CK)，其余8份分別加入豬油量的體積分?jǐn)?shù)為0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%的SpLF和體積分?jǐn)?shù)各為0.02%的BHT、TP、QC，置于(65±1)℃的恒溫箱中進(jìn)行抗氧化性試驗，每2天測1次各樣品中的POV值。

1.4.3.2 SpLF抗氧化協(xié)同增效試驗

按三因素三水平設(shè)置9個實驗組(見表1)，各加50 g豬油，其中一份作空白對照(CK)，置于(65±1)℃的恒溫箱中進(jìn)行抗氧化性試驗，每2天測1次各樣品中的POV值。

1.4.3.3 POV值的測定[6-7]

POV值是測定油脂酸敗氧化的重要指標(biāo)之一[8]。稱取2～3 g的油樣，置于250 mL碘量瓶中，加入20 mL冰醋酸與三氯甲烷混合液(V∶V=3∶2)，然后加入1mL飽和碘化鉀溶液，立即加塞搖勻，置于暗處5 min。之后加50 mL水稀釋，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%淀粉為指示劑。在不同日期用不同濃度的硫代硫酸鈉溶液進(jìn)行滴定，直到溶液顏色完全變白色澄清為止。并做空白實驗對照(CK)。

POV值(%)=C×(V1-V2)×0.1269×100/M

式中：C=硫代硫酸鈉溶液的濃度(mol/L)

V1=油樣消耗硫代硫酸鈉溶液的體積(mol)

V2=空白消耗硫代硫酸鈉溶液的體積(mL)

M=樣品質(zhì)量(g)

1.4.3.4 MDA值的測定[6-7]

取油樣各1mL，分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%三氯乙酸1 mL，混勻放置20 min，再加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.28%硫代巴比妥酸2 mL搖勻，沸水浴15 min，加入5 mL三氯甲烷，靜置分層，取上清液于532 nm下比色。

抑制率=(Ack-At)/Ack

式中：Ack為處理油脂在532nm下的吸光值；At為對照油脂在532 nm下的吸光值。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同洗脫濃度對SpLF得率的影響

為了驗證乙醇洗脫濃度對SpLF得率的影響，設(shè)計了單因素試驗，重復(fù)進(jìn)行5次試驗并進(jìn)行方差分析。

表2 洗脫液不同濃度下的SpLF得率/%

從表2可以看出，乙醇洗脫液濃度為體積分?jǐn)?shù)75%時，SpLF得率最高，平均可得4.65%。乙醇濃度較低時，得率也較低，因為低濃度乙醇洗脫能力較差，但是乙醇濃度高于75%后，得率反而開始降低，一方面因為高濃度的乙醇分子使黃酮葉細(xì)胞壁上的蛋白質(zhì)發(fā)生變性凝固，使細(xì)胞內(nèi)的黃酮類物質(zhì)難以進(jìn)一步溶出，另一方面過高的滲透壓會使黃酮葉中的其它雜質(zhì)溶出，反而使黃酮得率降低[9]。從表3的方差分析可以看出，乙醇濃度對SpLF得率具有極顯著的影響，進(jìn)一步驗證了之前的SpLF得率數(shù)據(jù)的可靠性。

表3 方差分析表

2.2 SpLF標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

以一系列標(biāo)準(zhǔn)濃度的蘆丁作標(biāo)樣，三氯化鋁室溫顯色法[5]，制定標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為y=1.9391x+0.0004，R2=0.9998(結(jié)果見表4、圖1)。

表4 標(biāo)準(zhǔn)蘆丁與吸光度(AlCl3顯色法)

圖1 蘆丁AlCl3顯色法A420 nm標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 SpLF對豬油的抗氧化效果

本文的主要目的是研究來源于紅花桑寄生的葉黃酮(SpLF)是否可作為高效的天然抗氧化物質(zhì)。為此，作者以豬油為氧化基質(zhì)測定SpLF是否可以防止豬油被氧化，然后測定其與其它抗氧化劑的協(xié)同抗氧化作用。

2.3.1 SpLF對豬油抗氧化作用

SpLF的抗氧化性可以用通過測定豬油的POV值來表示，越低的POV值表示抗氧化物活性越強(qiáng)。表5顯示，豬油中添加了不同濃度的SpLF放置12 d后，其POV值均比未添加抗氧化劑的對照樣品低，說明SpLF具有一定的抗氧化作用，且隨添加量增加其抗氧化活性增強(qiáng)。 但是與其它已知抗氧化物質(zhì)BHT、茶多酚(TP)、槲皮素(QC)比較后，發(fā)現(xiàn)SpLF的抗氧化性明顯低于BHT、TP、QC等對豬油的抗氧化活性。因此紅花桑寄生葉黃酮SpLF對豬油體系的抗氧化活性作用有限，原因可能與其在豬油中的溶解性有關(guān)。

表5 不同SpLF添加量的抗氧化實驗效果(POV值/%)

2.3.2 SpLF的抗氧化協(xié)同效應(yīng)

為了進(jìn)一步研究SpLF的抗氧化功能，本文探討其與已知抗氧化劑的協(xié)同作用。采用3因素3水平正交試驗，在不同時間段，對不同組別測定POV值。表6表明，在對豬油的協(xié)同抗氧化作用中，幾個因素之間的重要性分別是SpLF> BHT> VC，協(xié)同抗氧化的最佳組合是0.02% SpLF+0.03% BHT+0.02% VC，用該組合重復(fù)進(jìn)行試驗，其第10天的POV值只有1.263，對比空白組及其他組，顯示出較強(qiáng)的協(xié)同抗氧化作用。從表7的方差分析中可以看出，三因素之間都還達(dá)不到顯著差異水平，所以無需進(jìn)行多重實驗。

表6 SpLF抗氧化的協(xié)同效應(yīng) L9(34)正交試驗

表7 正交試驗結(jié)果方差分析

2.3.3 SpLF對豬油脂質(zhì)過氧化的抑制作用

MDA是生物膜中多不飽和脂肪酸法師過氧化作用的最終產(chǎn)物之一，其含量可反映脂質(zhì)過氧化作用的程度[10]，為了進(jìn)一步研究SpLF對脂質(zhì)過氧化的抑制作用， 本文繼續(xù)測試了SpLF對豬油脂質(zhì)的MDA生成量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)SpLF對豬油脂質(zhì)過氧化作用有一定的抑制作用，且隨著SpLF添加量的增多，豬油脂質(zhì)中MDA生成量相應(yīng)降低，過氧化抑制率相應(yīng)升高，其結(jié)果與其POV值的結(jié)果相一致。

表8 SpLF對豬油MDA生成量及抑制率的測定

3 結(jié)論

本研究表明了福建產(chǎn)的紅花桑寄生葉中含豐富的黃酮類化合物，對豬油為氧化基質(zhì)的底物有一定的抗氧化活性，且隨添加量的增加而加強(qiáng)；同時與VC、BHT有一定的協(xié)同增效作用。但總體抗氧活性明顯低于BHT、茶多酚及槲皮素的抗豬油氧化作用。原因可能與SpLF在豬油的溶解性有關(guān)，也導(dǎo)致其清除自由基的能力略低于抗壞血酸[11]。今后可嘗試選擇其他氧化基質(zhì)，如小鼠肝、腎等進(jìn)行脂質(zhì)過氧化作用分析，以綜合評價該葉黃酮的抗氧化作用及清除自由基的能力。今后還需要對SpLF的其他重要的藥用價值進(jìn)行更加系統(tǒng)研究?？傊?，本研究為更好地開發(fā)紅花桑寄生的葉黃酮的藥用價值和工業(yè)價值提供了科學(xué)指導(dǎo)。