電針治療脊髓損傷動物實驗研究進展*

孫忠人，盧英琦，胡其回，張 淼，尹洪娜△

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱150001）

脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）是世界范圍內常見的具有高度致死性和致殘性的中樞神經系統(tǒng)疾病[1]，包括原發(fā)性機械損傷和由復雜病理生理改變介導的繼發(fā)性損傷。據(jù)統(tǒng)計，每年SCI全球發(fā)病人數(shù)高達25～50萬[2]。目前SCI主要治療方法包括手術、藥物、激素治療、行為治療、物理治療等[3-6]，但由于這些療法存在潛在并發(fā)癥以及本病復雜的病理生理學特點，使越來越多脊髓損傷患者開始選擇針灸等替代療法[7]。

SCI分子和生化改變與水腫、缺血、細胞凋亡、微循環(huán)障礙、膠質瘢痕形成、炎癥反應等密切相關[8-9]，對損傷后的微環(huán)境造成嚴重的后果，而這對中樞神經系統(tǒng)再生過程至關重要。既往臨床研究表明，電針作為針灸特色療法的一種，在對脊髓損傷及其并發(fā)癥治療中，包括運動障礙、神經性疼痛、痙攣、脊髓空洞癥等，療效顯著，有助于患者遠期神經和功能恢復[10-13]，為臨床應用提供了循證依據(jù)。日前，業(yè)內在探討電針對脊髓損傷潛在分子機制的影響方面，爭論激烈，各種假說林立紛繁，動物實驗系驗證其具體發(fā)病機理的關鍵鎖鑰?，F(xiàn)通過對電針治療脊髓損傷動物實驗研究文獻總結分析，探求電針療法作用靶點，為臨床診治、選穴提供穩(wěn)固依據(jù)，并對電針治療SCI的機制研究進行展望。

1 資料與方法

1.1 檢索方式 選用近5年中國知識資源總庫（中國知網，CNKI）、萬方數(shù)據(jù)、維普網及 PubMed、Web of Science中發(fā)表的有關單純電針為主要治療方案治療脊髓損傷動物模型方面的實驗研究文獻。在檢查篩選時，采用主題詞和自由詞結合的檢索方式。中文檢索詞分別為“脊髓損傷”“截癱”“電針”“電針療法”“動物模型”“實驗研究”等，英文檢索詞為“spinal cord injury”“paraplegia”“electroacupuncture”“animal model”“experimental study”等。

1.2 納入標準 ①文獻發(fā)表年限為2016年6月1日至2021年4月1日；②研究類型為動物實驗研究文獻，文種限中文、英文；③干預措施為單純電針的治療方式為主療法。

1.3 排除標準 ①個人經驗總結、研究進展、文獻綜述、臨床實驗的文獻；②全文不完整文獻；③沒有采用電針治療或存在2種以上干預措施的文獻；④碩博士學位論文及會議論文；⑤無具體觀察指標；⑥重復發(fā)表的臨床研究，納入文獻質量較高的1篇；⑦采用功能性核磁共振、正電子發(fā)射計算機斷層顯像（PET）的方法觀察針刺治療脊髓損傷動物模型效應的文獻。

1.4 文獻篩選結果 根據(jù)上述檢索詞檢索后共得到相關文獻422篇，剔除不相干和重復文獻139篇后，依據(jù)納排標準對剩余文獻進行詳細閱讀總結后，共納入23篇相關文獻，其中中文17篇，英文6篇。

2 結果

經研究結果統(tǒng)計顯示，電針治療SCI動物實驗研究腧穴配伍頻率最高的為大椎-命門及夾脊穴，出現(xiàn)頻次前兩位的分別為大椎、夾脊穴。針刺干預SCI作用機制主要為抑制炎癥反應、改善微循環(huán)、抑制細胞凋亡、促進髓鞘再生作用等方面。結果見表1。

表1 針灸治療SCI的動物實驗研究匯總

3 電針治療脊髓損傷作用機制

3.1 電針抑制炎癥反應 SCI中的炎癥反應具有雙向保護和損傷作用，波及到神經與免疫兩大系統(tǒng)[37]，受微環(huán)境局部軸突再生和損傷神經元修復限制、血-脊髓屏障破壞、外周血白細胞與先天免疫細胞（小膠質和星形膠質細胞）共同作用，在數(shù)小時內上調TNF-α、IL-1β、IL-6 等促炎因子濃度，這些介質對中樞神經系統(tǒng)細胞產生細胞毒作用，導致小膠質細胞和巨噬細胞脫髓鞘和神經元丟失[38-39]。電針夾脊穴可以調控嘌呤受體P2X7（P2X7R）和核苷酸結合寡聚化結域樣受體蛋白3（NLRP3）炎癥小體表達，進而阻斷炎癥因子IL-1β和IL-18釋放[14]，調節(jié)高遷移率族蛋白B1（HMGB1）、Toll樣受體 4（TLR4）水平[17]，下調 Caspase-1、IL-1β、IL-18 表達[24]。NLRP3 炎癥小體作為一種胞漿蛋白復合物，在神經元、小膠質細胞和星形膠質細胞中均有表達[40]，抑制NLRP3激活可控制神經炎癥，減輕線粒體功能障礙，P2X7R是激活NLRP3最有效的因子之一，同時與Caspase-1、IL-1釋放密切關聯(lián)[41]，阻斷P2X7R-NLRP3炎癥信號通路，為脊髓繼發(fā)性損傷恢復提供治療新靶點。HMGB1在SCI后從壞死細胞被動釋放，血清和胞漿濃度明顯上升，并通過晚期糖基化終末產物受體-核因子κB（RAGE-NF-κB）信號通路，將小膠質細胞極化為促炎表型[42]，引起下游炎性因子釋放。TLR4作為Toll樣受體中與HMGB1最密切因子，會誘導NF-κB和環(huán)氧化酶-2（COX-2）水平上調[43]，抑制 HMGB1/TLR4可發(fā)揮抗炎、保護神經功效。電針大椎、腰陽關、雙側次髎、足三里可抑制胞漿型磷脂酶A2（c PLA2）、降低前列腺素 E（PGE）含量[29]。c PLA2和 PGE是Nogo/NgR和下游Rho/Rock的前炎癥反應因子，可加速促炎反應。

3.2 電針改善微循環(huán)，促進營養(yǎng)因子分泌 成年中樞神經系統(tǒng)脊髓損傷后，軸突不可再生，這歸因于血管周圍功能、結構損傷的互相影響[44]，及周圍局部環(huán)境既缺乏生長促進因子、又包含許多生長抑制因子。即使軸突再生，也很難與正確的突觸后神經元鏈接，進而恢復正常功能。理想的再生環(huán)境包含高濃度神經生長因子的存在，這些因子能克服抑制影響，引導軸突到達適當靶點，并對非受損群體無負面影響。神經生長因子家族包括神經生長因子（NGF）、腦源性神經營養(yǎng)因子（BDNF）和神經營養(yǎng)素3（NT-3）3類。均可與原肌球蛋白受體激酶（Trk）受體和泛神經營養(yǎng)素（P75NTR）受體結合[45]，激活或上調下游信號通路如磷脂酰肌醇 3-激酶（PI3K）/蛋白激酶 B（AKT）、磷脂酶 C-γ（PLC-γ）、GTP 結合蛋白（RAS）/絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）等[46]，在神經元存活、軸突生長及突觸可塑性中占據(jù)重要地位。電針百會、風府、命門、大椎能上調BDNF、NT-3mRNA及蛋白水平[20]。電針肝俞、脾俞可促進SCI后BDNF、NGF和NT-3表達，增強運動功能恢復[27]。電針長強穴可調控NGF和BDNF水平[30]。BDNF與TrkB受體結合對損傷神經元有保護和促生長作用，促進軸突再髓鞘形成[47]，并在一定程度上減輕谷氨酸誘導細胞凋亡[48]。NGF能維持和促進神經元存活，并誘導感覺神經元軸突的生長[49]。電針大椎、命門可上調NT-3水平，對脊髓周圍環(huán)境有保護作用[35]。NT-3與TrkC受體高親和[50]，可防止神經軸突退化，促進神經發(fā)育再生。通過電針脊中、至陽、腰俞、長強四穴可激活CGRP/αCaMKII/NT-3信號通路，觸發(fā)NT-3合成及分泌，增強脊髓內源生長能力，加強軸突再生[18]。

但由于SCI繼發(fā)損傷會造成大量神經元死亡，僅僅依靠神經營養(yǎng)因子自身表達很難發(fā)揮最優(yōu)效果，需要對神經營養(yǎng)因子進行有效調控。抑制軸突生長髓鞘相關抑制因子（MALs），主要包括軸突生長抑制因子（Nogo）、髓鞘相關糖蛋白（MAG）和少突膠質細胞髓鞘糖蛋白（OMgp）3類[51]，其受體NgR含量的增多有助于神經恢復，減輕炎癥。電針夾脊穴可促進NgR表達，提高巨噬細胞吞噬能力[25]。此外，電針伏兔、足三里可以上調缺氧誘導因子1α、血管內皮生長因子的mRNA及蛋白的表達，為構建良好的血氧微環(huán)境提供依據(jù)[26]。

3.3 電針抑制細胞凋亡，增強神經修復 細胞凋亡會造成損傷脊髓功能障礙，探索細胞凋亡特異性分子途徑有利于脊髓損傷的治療和恢復。

3.3.1 調節(jié)內質網應激和自噬 內質網應激（ERS）是凋亡關鍵性途徑之一。內質網主要包括粗面和光面兩種，參與蛋白質平衡的各個方面，對維持細胞功能和內環(huán)境穩(wěn)態(tài)有著不可或缺的作用。若局部出現(xiàn)缺氧缺血、病毒細菌感染、溫度變化等生理病理改變，就會導致內質網紊亂、引發(fā)ERS的產生[52]，過度ERS會啟動凋亡程序。

脊髓損傷后，由于局部微環(huán)境存在多種應激源，內質網中未折疊蛋白積累誘導未折疊蛋白反應（UPR）的激活（包含ATF6、PERK、IRE1 3類[53]）。內質網伴侶分子葡萄糖調節(jié)蛋白78（GRP78）是內質網應激的關鍵標志物，可與UPR結合，阻止錯誤折疊蛋白的輸出。但長時間過度的UPR最終會觸發(fā)細胞凋亡，啟動凋亡信號分子[54]，如CHOP、TRAF2和Caspase-12等3個關鍵途徑[55]，加速組織損傷速度。正常情況下CHOP表達量很低，但內質網應激后暴露在過量內質網應激下的少突膠質前體細胞促進CHOP含量增多，下調B細胞淋巴瘤2（Bcl-2）基因，上調促凋亡Bax表達[56-57]，此外CHOP還可通過抑制細胞周期調節(jié)蛋白p21引發(fā)細胞死亡[58]。少突膠質前體細胞（OPC）凋亡抑制再髓鞘形成，并擴大受損脊髓面積[59]。TRAF2可經IRE1集聚，激活Caspase-12，進而激活Caspase-9和Caspase-3表達，加速細胞凋亡進程[55]。電針夾脊穴能下調GRP78、Caspase-12、CHOP表達，抑制內質網應激激活[15]，并促進OPC增殖，對運動功能恢復提供積極作用[22]。

自噬是細胞分解自身成分的動態(tài)平衡過程，可觸發(fā)受損細胞器和錯誤折疊蛋白質的自我降解，形成自噬小體，最后被溶酶體酶降解[60]。誘導自噬可保護運動神經元免于變性，緩解SCI后痙攣性癱瘓，是維持中樞神經系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)必不可少的過程[61]。其主要標志物LC3-II反映了自噬小體的數(shù)量，P62是自噬貨物蛋白，增加自噬通量。內質網應激可通過PERK-eIF2α、IRE1-ASK1-JNK和CaMKK-腺苷酸活化蛋白激酶-哺乳動物雷帕霉素靶蛋白3條通路誘導細胞自噬[62]。內質網應激調節(jié)是在不同應激條件下通過調節(jié)自噬和凋亡來實現(xiàn)細胞穩(wěn)態(tài)平衡的關鍵過程，內質網自噬（reticulophagy）可通過消除UPR、清除受損內質網、降解蛋白聚體等途徑使蛋白正確折疊、促進內環(huán)境平衡穩(wěn)定[52]。研究顯示，電針夾脊穴發(fā)現(xiàn)電針可以調節(jié)溶酶體功能和自噬[16]，還可以通過抑制內質網應激并激活自噬[15]，清除錯誤折疊蛋白，維持脊髓損傷局部內環(huán)境平衡，延緩凋亡進程。

3.3.2 調節(jié)鈣蛋白酶活性 鈣蛋白酶（calpain）是屬于Ca2+依賴性的非溶酶體半胱氨酸蛋白分解酶家族，可通過解阮靶蛋白從而控制細胞重構、分化和凋亡過程[63]。其家族成員互為同工酶，在機體組織內廣泛分布的為calpain1和calpain2兩種[64]，能參與到蛋白水解、自噬、細胞凋亡等生理過程。正常情況下，calpain在胞質內以酶原形式存活，若細胞內鈣離子濃度增加，則calpain可通過與Ca2+結合被激活，過量鈣蛋白酶表達會引起蛋白沉積、水解蛋白結構細胞表達失衡[65]。SCI后，受損局部受到缺血缺氧刺激，處于穩(wěn)定狀態(tài)的Ca2+濃度失調，含量大幅度升高，造成calpain異常表達。鈣蛋白酶在細胞凋亡中主要通過對凋亡途徑調控，例如導致促凋亡基因Bcl-2/Bax失衡、Caspase-3激活、溶酶體功能紊亂、線粒體功能異常等等，引發(fā)脊髓功能喪失，加重病情。calpain裂解后會激活Caspase-3表達，Caspase-3水解又會促進calpain活性，并阻止鈣蛋白酶抑制劑的抑制作用，形成雙向變化環(huán)路[66]，進一步促進凋亡。calpain和Caspase-3也存在相似底物，例如細胞骨架、轉錄因子等，兩者形成的通路在細胞凋亡方面有獨特復雜作用?；罨腸alpain還可通過上調鈣調神經磷酸酶（CaN）表達激活細胞凋亡[67]。此外，SCI損傷會上調calpain1 mRNA水平，但對 calpain2表達無明顯影響[19]。calpastatin為calpain抑制蛋白，可與后者結合抑制活性[68]。研究發(fā)現(xiàn)，電針脊中、命門穴可上調calpastatin，抑制calpain1蛋白表達，進而對脊髓損傷和運動功能起到修復和改善的作用[19]。

3.3.3 調節(jié)凋亡相關蛋白 Bcl-2家族蛋白是通過線粒體途徑調控凋亡的重要蛋白質，它可與凋亡中的死亡受體途徑共同作用調節(jié)Caspase-3含量，最終決定細胞凋亡與否[69]。其最具代表性的基因為抑制凋亡因子Bcl-2和促凋亡因子Bax等。Bcl-2可在線粒體膜上構建陽離子通道，影響細胞色素C（Cytc）釋放，發(fā)揮抑制作用，促凋亡因子Bax主要在細胞質內，受凋亡因子誘導時，會破壞線粒體膜的完整性，激活Caspase，加速細胞凋亡進程。兩者相反相成，協(xié)同調控，維持凋亡中的動態(tài)平衡。Bcl-2/Bax競爭性的二聚體化過程決定細胞對凋亡信號敏感性，二者構建成平衡體系，所代表的蛋白比值決定細胞是凋亡還是存活[70]。半胱氨酸蛋白酶（Caspase）家族也是凋亡過程中的重要參與者，目前共發(fā)現(xiàn)14種，其中Caspase-3與凋亡關系最為密切，通常Caspase-3以酶原形式在細胞內存活，需要通過轉活化和非蛋白酶活化等形式被激活。前者指當刺激發(fā)生時，活化的凋亡信號會首先激活上游Caspase啟動因子如 Caspase-8、Caspase-9等，引起級聯(lián)反應，繼而啟動Caspase-3功能，活化的Caspase-3會造成核酸斷裂，凋亡不可逆性發(fā)展[71]。后者則指酶原可被非蛋白酶物質如阿特拉津（ATZ）、鹽霉素（SAL）等上調 Caspase-3 表達[72]。此外，研究發(fā)現(xiàn)Caspase-3與細胞焦亡關系密切，可通過切割gasdermin（GSDM）蛋白參與炎癥反應[73]。電針足三里、伏兔有助于降低Caspase-3表達[21]，同時還可上調Bcl-2/Bax比值[23]，減少細胞凋亡，促進損傷神經修復再生。

3.3.4 調節(jié)相關信號通路 Rho/Rock信號通路廣泛存在于神經系統(tǒng)中，與突觸結構功能改變、神經細胞損傷修復等存在密切聯(lián)系。Rho/Rock的過度激活會導致肌球蛋白輕鏈磷酸化中斷，繼而引發(fā)神經生長錐塌陷。研究顯示SCI后7 d內，在脊髓白質、灰質及星形膠質細胞和少突膠質細胞中都檢測到Rho信號激活[74]。說明Rho信號參與到調控脊髓損傷病理生理的不同方面，包括膠質瘢痕增生、神經細胞凋亡等各個方面。脊髓損傷的修復可以歸因于側支纖維的重構[75]，下調Rho/Rock通路表達有助于神經元的恢復。電針大椎、腰陽關、雙側次髎、足三里可以下調Rho/Rock信號通路，進而對髓鞘抑制因子NOGO及其受體NGR、胞漿磷脂酶 A2（CPLA2）等的活性產生影響[28]。ROCK II是 Rho重要的下游效應分子之一，電針夾脊穴可減輕ROCK II表達，減少抑制因子RhoA和MLC含量，促進神經功能恢復[31]。

絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路包括ERK、JNK、p38MAPK等通路，影響到炎癥反應、細胞凋亡、軸突再生及缺血再灌注等各個方面[76]。ERK通路可磷酸化轉錄因子及蛋白激酶底物，調節(jié)蛋白合成及基因轉錄等[77]。JNK是一種促分裂原活化蛋白激酶，又稱為c-Jun氨基末端激酶，可與c-Jun結合，參與細胞生長、發(fā)育、分化及凋亡。脊髓損傷后會出現(xiàn)局部磷酸化c-Jun氨基末端激酶（p-c-Jun）的大量聚集，加重神經損傷的過程[78]。p38MAPK與應激情況下的炎癥表達、細胞重構和細胞凋亡等有關，影響下游基因轉錄和翻譯。電針大椎、命門穴可上調Raf/Ras/ERK信號通路表達[32]，降低p-c-Jun的表達，抑制細胞凋亡[33]，促進運動功能及神經元的修復。

Wnt/β-catenin信號通路是調節(jié)神經元的重要因子，Wnt蛋白是一個信號蛋白大家族，參與脊髓神經元長軸突生長調節(jié)。β-catenin是其關鍵組成部分，被激活時，可以移位到細胞核，與轉錄因子相互作用，誘導靶基因表達改變，促進神經干細胞分化，并抑制其向星形膠質細胞分化[79]。電針大椎、命門能增強Wnt/β-catenin通路表達，促進細胞向脊神經元分化，增強脊髓損傷后神經元的恢復[34，36]。

4 造模方法選擇

良好的動物模型建立是保證實驗成功的基礎，脊髓損傷大鼠造模方法包括打擊法、橫切法、鉗夾法等。目前臨床常用的Allen's撞擊法，是在原有方法的基礎上進行改進后的動物造模方式，可引起模型脊髓水腫及缺血，與人類脊髓損傷病理生理特點類似，具有重復性，可實施性強的特點[80]。各種方法各有利弊，需要研究者根據(jù)實驗情況的需求進行相應選擇。

5 討論

當前隨著研究技術的進步和治療手段的發(fā)展，對脊髓損傷的認識也得到不斷深入。本病現(xiàn)有的治療手段多樣，包括藥物治療、神經營養(yǎng)因子治療、細胞移植、基因治療和生物材料移植等，但由于這些手段存在治療價格昂貴、存在后遺癥等問題，使中國傳統(tǒng)治療手段針灸得到越來越多的重視。臨床觀察、動物研究、綜述表明，針灸可以有效治療脊髓損傷后一系列并發(fā)癥，包括運動和感覺障礙、疼痛、壓瘡、痙攣和骨質疏松等。

電針作為針灸治療方式的一種，兼顧針刺和電流刺激的雙重效應，在臨床實踐中得到廣泛應用。根據(jù)動物實驗和臨床研究發(fā)現(xiàn)電針治療SCI機制主要包括：①抗氧化和抗炎；②上調神經營養(yǎng)因子，促進微環(huán)境平衡；③抑制神經元凋亡；④調節(jié)相關信號通路等幾方面，可顯著改善脊髓損傷遠期神經功能恢復，為患者提供一種風險最小的新型治療手段。

目前研究電針治療脊髓損傷的穴位主要以大椎-命門穴、夾脊穴為主。督脈主一身陽氣，為“陽脈之?！?，若督脈受損則陽氣不能四布，氣血運行不暢而致氣滯血瘀，其循行路線與SCI發(fā)病部位密切相關，大椎位于第7頸椎棘突下，胸椎與頸椎交匯處，上撐頭部，下連脊骨，有支撐椎體之效。命門為原氣之所系，蘊藏先天之氣，具有培補腎氣、強腰健脊的效用。將電針刺激用于督脈穴，能促使經脈氣血運行加速，調整陰陽、扶正祛邪。夾脊穴在脊柱旁開半寸，也可以說從屬于督脈和足太陽膀胱經，深層為胸、腰神經的后支，電針夾脊穴可刺激脊神經感覺與運動纖維，并能刺激與脊神經伴行血管，實現(xiàn)對內部環(huán)境的基本調節(jié)。此外，尚可將足陽明胃經中的足三里、伏兔作為治療脊髓損傷的代表穴位，取胃經多氣多血、束骨而利機關之意，體現(xiàn)了針灸治療多樣性、靈活性的特點，值得臨床借鑒。

不過本文尚存在一些不足之處，比如只納入了單純電針的動物模型實驗，當前電針結合康復訓練、電針結合干細胞移植、電針結合藥物等治療方式也越來越受到關注和研究，促進傳統(tǒng)理論和研究在現(xiàn)代醫(yī)學實踐中的結合，中西并用共同治療脊髓損傷，為臨床提供有效選擇。此外，電針治療仍存在一些爭議，需要指導原則來規(guī)范穴位、刺激頻率等，未來還需要大規(guī)模、多中心的針灸試驗方法。研究人員尚需提高科研能力，將傳統(tǒng)思維與現(xiàn)代思想相結合，為中醫(yī)治療疾病注入新鮮動力，以更有利于中醫(yī)藥的現(xiàn)代化發(fā)展。