煙草青枯病菌拮抗細菌的篩選、鑒定和抑菌機制研究

馮印印，李 斌，楊 洋，何佶弦，安 航，閆芳芳，安德榮*

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)植物保護學(xué)院/旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國家重點實驗室，楊凌 712100；2.中國煙草總公司四川省公司，成都 610000；3.四川省煙草公司宜賓市公司，宜賓 644000；4.四川省煙草公司廣元市公司，廣元 628000；5.四川省煙草公司攀枝花市公司，攀枝花 617000）

陜西漢中作為我國主要煙區(qū)之一，近年來受煙草青枯病影響嚴(yán)重，產(chǎn)量和質(zhì)量都大幅度降低。煙草青枯病是由青枯雷爾氏菌Ralstoniasolanacearum煙草?；鸵鸬牡湫屯羵骷毦圆『1,2]，在我國各大煙區(qū)均有不同程度的發(fā)生，近年來呈增長趨勢。據(jù)統(tǒng)計，在2015 年青枯病發(fā)病面積達到8.7 萬公頃左右，造成的經(jīng)濟損失約為 5.5 億元[3]。青枯病的防治主要是銅制劑和農(nóng)用抗生素等化學(xué)藥劑[4]，但化學(xué)藥劑的持續(xù)性使用造成病原菌抗藥性，環(huán)境污染等問題，嚴(yán)重影響了生態(tài)環(huán)境的可持續(xù)發(fā)展。隨著農(nóng)業(yè)科技的發(fā)展，生物防治成為防治植物病害的研究熱門，被越來越多的科研工作者所重視。

芽胞桿菌因其抗逆性強、易于培養(yǎng)，作為生防菌株被廣泛研究[5]。芽胞桿菌類生防菌通過競爭、分泌類植物激素、誘導(dǎo)植物抗性等方式抵御植物病害[6]。夏艷等[7]從不同煙田分離獲得 3株對煙草青枯病菌有明顯抑制作用的拮抗細菌，發(fā)現(xiàn)均具有產(chǎn)鐵載體和吲哚乙酸(IAA)的能力，且溫室促生、防治效果都較為顯著。王超等[8]從煙草植株根圍土壤及植株根內(nèi)分離獲得3株芽胞桿菌，對煙草青枯病的溫室防效可達到80%以上。Lemessa和Zeller[9]篩選出6株對煙草青枯病拮抗效果好的菌株并進行溫室植物試驗，發(fā)現(xiàn)枯草芽胞菌株APF1和B2G顯著降低了煙草植株的發(fā)病率，提高了植株產(chǎn)量。綜上表明，利用拮抗細菌防治煙草青枯病具有良好的應(yīng)用前景。但是，目前我國利用拮抗細菌防治煙草青枯病研究基礎(chǔ)還比較薄弱，特別是高效菌種資源明顯缺乏，且抑菌機理不甚明確。課題組通過采集不同生態(tài)環(huán)境中的土壤，意在發(fā)掘抗逆性更強、對植物病害防治效果更好的生防菌株。

本研究以青枯病菌為供試靶標(biāo)，從運城鹽湖湖岸邊土壤中分離到一株對煙草青枯病菌有較好拮抗效果的細菌菌株，對該菌株進行了形態(tài)學(xué)、生理生化和分子生物學(xué)鑒定，確定其分類地位。進而對該菌株進行溫室促生防病、抑菌譜、功能性代謝抗菌物質(zhì)分析、無菌濾液穩(wěn)定性及對青枯病的防治效果等研究，旨在初探拮抗細菌的抑菌機制，豐富青枯病菌拮抗細菌菌種資源，為優(yōu)良生防菌株的進一步開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

從山西運城鹽湖湖岸邊共采集土樣 38份。供試煙草“本氏”煙由陜西省漢中煙草研究所提供。供試菌株煙草青枯病菌Ralstoniasolanacearum R-2014保存于西北農(nóng)林科技大學(xué)植物病毒與微生物資源實驗室。

NA培養(yǎng)基：牛肉浸膏 3.0 g；蛋白胨 5.0 g；葡萄糖 2.5 g；瓊脂 17.5 g；pH值 7.0±0.1；無菌水定容到1 L。

1.2 拮抗菌株的分離篩選

1.2.1 菌株的分離純化 取山西運城鹽湖采集的土樣，參考陳太春等[10]的方法分離獲得純化細菌菌株。將純化出來的菌株于NA固體培養(yǎng)基上采用平板劃線法培養(yǎng)，36 h后置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 拮抗菌株的初篩 拮抗細菌的初篩參照夏艷等[7]的方法。制備濃度為108CFU/mL的煙草青枯菌菌懸液，取1 mL加入50 ℃左右的LB固體培養(yǎng)基中，搖勻，倒置平板。待培養(yǎng)基凝固后，將1.2.1中的備用菌株點接于含菌平板上，每板測試4種菌，重復(fù)3次，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，選取抑菌圈較大的菌株進行復(fù)篩。

1.2.3 拮抗菌株的復(fù)篩 將初篩獲得的效果較好的拮抗菌接種于LB液體培養(yǎng)基中活化24 h，按照1%的體積移取到 LB液體培養(yǎng)基中在28 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)48 h即為發(fā)酵液。取發(fā)酵液在4 ℃、12000 r/min離心15 min，取上清液備用。同1.2.2倒制含青枯病菌平板，在水平位置均勻地放置2只無菌牛津杯(8 mm)。同時吸取0.15 mL拮抗菌株發(fā)酵上清液加入牛津杯中，每處理重復(fù)3次。置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，用十字交叉法測量抑菌圈直徑，取平均值。選取效果最佳的1株拮抗細菌，進行后續(xù)試驗。

1.3 拮抗效果最佳菌株對青枯病菌形態(tài)的影響

通過初、復(fù)篩試驗得到一株對青枯病菌拮抗效果最好的菌株FY-C。然后挑取青枯病菌和菌株FY-C分別在LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，用LB液體培養(yǎng)基將其稀釋至OD600=0.5。將菌株FY-C發(fā)酵液12000 r/min離心10 min后取上清，過0.22 μm細菌過濾器制得無菌濾液，按照1%的比例加入到100 mL青枯病菌的發(fā)酵液中，在28 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)24 h后取出用于后續(xù)試驗。以未接種菌株FY-C無菌濾液為對照。參考高克祥等[11]試驗方法制樣并于透射電鏡觀察青枯病菌的形態(tài)特征變化。

1.4 菌株FY-C無菌濾液抗菌穩(wěn)定性分析

研究不同溫度（4 ℃，10 ℃，25 ℃，33 ℃，50 ℃和80 ℃）、pH（3，5，7，9和11）對菌株FY-C無菌濾液抗菌穩(wěn)定性的影響。取菌株FY-C發(fā)酵液制得無菌濾液，將無菌濾液在不同溫度、pH下處理2 h后，備用。制含OD600=0.5的青枯病菌平板，采用牛津杯法測定不同處理后菌株FY-C無菌濾液的活性，設(shè)置沒有經(jīng)過處理的無菌濾液為對照。

1.5 拮抗菌株的鑒定

對篩選到的拮抗效果最佳的菌株FY-C進行分類鑒定。參照《伯杰氏細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[12]與《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[13]中的革蘭氏染色、形態(tài)學(xué)與部分生理生化鑒定以及16S rDNA、gyrB 基因多基因位點聯(lián)合分析鑒定目標(biāo)菌株。采用CTAB法[14]提取菌株FY-C的 DNA，將其作為PCR反應(yīng)的模板DNA，以通用引物 27 F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和 1492 R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT -3′）為上、下游引物，擴增菌株的 16S rDNA 基因，以 F（5′-AACGATTTTGCGGGCTGAG-3′）和 R （5′-GCGTA AACATCACGATTGAAGAC-3′）為上、下游引物，擴增菌株的gyrB基因。PCR 反應(yīng)體系：模板1 μL、上下游引物各 1 μL、10×Buffer（with MgCl2）2.5 μL、10 mmol/L dNTP 1 μL、Taq酶 0.25 μL，補充 ddH2O至25 μL。PCR 反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s；60 ℃退火30 s；72 ℃延伸50 s；35個循環(huán)；72 ℃延伸5 min；PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送上海生工進行序列測定，測序結(jié)果用BLAST 軟件在GenBank進行同源性比較，并提交，獲取注冊登錄號。采用Clustal X進行多序列比對后，用 MEGA 5.0的鄰接法構(gòu)建16S rDNA基因系統(tǒng)進化樹，用最大似然法構(gòu)建gyrB基因系統(tǒng)進化樹，并進行1000次Bootstraps檢測。

1.6 菌株FY-C的抑菌譜測定

利用實驗室保存的病原真菌進行菌株FY-C的抑菌譜測定。將病原菌接種在PDA培養(yǎng)基上，培養(yǎng)5 d后用滅過菌的打孔器（φ=5 mm）在病原菌邊緣打取菌餅，再將菌餅接種到PDA培養(yǎng)基的中心位置，采用平板對峙法在其四個方向等距離（d=3 cm）點接菌株FY-C，于28 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，期間進行觀察并及時記錄。

1.7 對煙草苗的促生作用

將煙草種子用0.5%的次氯酸鈉進行表面消毒30 min，無菌水漂洗3～4次，播種于滅菌過的基質(zhì)土（基質(zhì)﹕土＝3﹕1）中。待煙草葉片為2葉真葉時進行菌株FY-C接種處理，采用灌根接種法，接種濃度為1×108CFU/mL，接種量為20 mL/株，每處理3盆，灌根LB液體培養(yǎng)基為對照處理。設(shè)3個重復(fù)，每隔7 d重復(fù)一次，共計3次。放置光照培養(yǎng)箱25 ℃，12 h黑白交替培養(yǎng)，觀察煙草的生長情況，45 d后分別取處理組和對照組植株，抖去根部土壤，再用清水洗浄根表土壤，并用吸水紙吸干根表水分，分別統(tǒng)計株高，莖粗、整棵植株鮮重、干重。

1.8 菌株FY-C對煙草青枯病的防治效果

選擇長勢相似的煙草苗（2～3真葉）時，進行盆栽防治試驗。設(shè)3個處理：1) 液體LB培養(yǎng)基；2) 接種菌株FY-C OD600=0.5；3）青枯靈1500倍。采用灌根法接種菌株′FY-C發(fā)酵液20 mL/株，以液體LB培養(yǎng)基為空白對照，以青枯靈1500倍為藥劑對照。每處理設(shè)3次重復(fù)，每重復(fù)9株。5 d后，接種青枯病菌菌懸液（1×106CFU/mL），灌根接種5 mL/株，放置于溫室28 ℃條件下培養(yǎng)。接種青枯菌一周以后每天觀察植株生長、發(fā)病狀況，計算發(fā)病率和病情指數(shù)。病情指數(shù)=100×∑（各級病株數(shù)×各級代表值）/（調(diào)查總株數(shù)×最高級代表值），防治效果（%）=（對照區(qū)病情指數(shù)-處理區(qū)病情指數(shù)）/對照區(qū)病情指數(shù)×100%。植株病情等級參照Kempe等[15]的方法。

1.9 菌株FY-C功能性代謝抗菌物質(zhì)分析

1.9.1 產(chǎn)蛋白酶檢測 將活化后的菌株FY-C采用點接的方法接種在酪蛋白培養(yǎng)基上，28 ℃恒溫倒置培養(yǎng)3 d。用0.5%剛果紅染液浸染1 h后去其染液，再用1 mol/L NaCl溶液反復(fù)沖洗3～5次，最后再靜置30 min，若發(fā)現(xiàn)菌株FY-C的周圍出現(xiàn)透明圈，則表明菌株具產(chǎn)蛋白酶的能力。

1.9.2 產(chǎn)纖維素酶的測定 將活化后的菌株FY-C采用點接的方法接種在CMC培養(yǎng)基上，其他方法同1.9.1，若在菌落周圍有透明圈的出現(xiàn)，表現(xiàn)菌株FY-C具有產(chǎn)纖維素酶的能力。

1.9.3 生物膜檢測 將菌株 FY-C接種到 LB液體培養(yǎng)基中，28 ℃、200 r/min，培養(yǎng)至對數(shù)期前期（OD600=1.0）。菌液離心后獲得的菌體用新鮮的LB培養(yǎng)基洗滌一次，最后將其重懸于等體積的LB培養(yǎng)基中。向48孔細胞培養(yǎng)板的每孔中加入1 mL LB培養(yǎng)基，隨后每孔接種0.1 mL上述制備的菌懸液，33 ℃靜置培養(yǎng)24 h，觀察菌株在LB培養(yǎng)基中的成膜情況。

1.10 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用 Excel 和SPSS 22.0軟件，差異顯著性檢驗法采用 Duncan氏新復(fù)極差法。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗菌的分離與篩選

以青枯病菌為靶標(biāo)，通過對運城鹽湖土壤中拮抗菌的初篩和復(fù)篩，共分離篩選到6株對病原菌有穩(wěn)定拮抗效果的拮抗菌株。如表1所示，菌株FY-C拮抗效果最好，牛津杯法測得抑菌圈直徑是24.21 mm。綜上，確定拮抗菌FY-C作為目的菌株進行下一步的研究。

表1 不同拮抗菌對青枯病菌的拮抗效果Table 1 The antagonistic effects of different antagonistic bacteria on R.solanacearum

2.2 菌株FY-C對青枯病菌形態(tài)的影響

用FY-C無菌濾液處理青枯病菌24 h后經(jīng)透射電鏡觀察，結(jié)果如圖1所示，正常生長的青枯病菌呈現(xiàn)長橢圓形，形狀飽滿且胞壁完整，而經(jīng)過菌株FY-C無菌濾液處理后的青枯病菌的形態(tài)有非常明顯的變化，細胞凹陷變形，菌體降解破裂，造成內(nèi)容物外滲，有些細胞甚至完全降解。

圖1 透射電鏡觀察菌株FY-C對青枯病菌的影響Fig.1 TEM observation on the influence of strain FY-C on R.solanacearum

2.3 菌株FY-C無菌濾液抗菌穩(wěn)定性研究

FY-C無菌濾液經(jīng)不同溫度處理后均有抗菌活性，當(dāng)處理溫度為25 ℃時，對青枯病菌抑菌活性最大，抑菌圈為19.3 mm；當(dāng)處理溫度為80 ℃ 時，抑制活性明顯下降，但下降幅度小于15 %（圖2A）。結(jié)果表明，菌株 FY-C無菌濾液中的抗菌物質(zhì)具有很強的熱穩(wěn)定性。

FY-C無菌濾液經(jīng)不同pH處理后均有抗菌活性，當(dāng)處理pH為5時，對青枯病菌的抗菌活性最高，抑菌圈為20.1 mm；隨著pH 值的升高，抑制活性下降，當(dāng)處理pH為11時，抑制活性下降到最小，但下降幅度小于20%（圖2B）。結(jié)果表明，菌株FY-C無菌濾液中的抗菌物質(zhì)具有很強的酸堿穩(wěn)定性。

圖2 不同處理對FY-C無菌濾液拮抗活性的影響Fig.2 Effect of different treatments on the antagonistic activity of FY-C sterile filtrate

2.4 拮抗菌FY-C的鑒定

2.4.1 形態(tài)學(xué)觀察及生理生化測定 菌株FY-C在LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)48 h后的形態(tài)呈現(xiàn)淡黃色橢圓形菌落，表面略有褶皺，周圍無規(guī)則生長，革蘭氏染色呈陽性；在掃描電鏡下的形態(tài)：菌體呈桿狀、單個或成對排列（圖3）。生理生化測定結(jié)果顯示，菌株FY-C革蘭氏染色、甲基紅測試、氧化酶反應(yīng)為陽性，吲哚測試、硫化氫檢測為陰性（表2），符合芽胞桿菌的生化代謝特征。

圖3 菌株FY-C形態(tài)學(xué)鑒定Fig.3 Morphological identification of strain FY-C

表2 菌株FY-C部分生理生化特征Table 2 Some physiological and biochemical characteristics of strain FY-C

2.4.2 分子生物學(xué)鑒定結(jié)果 以拮抗菌株FY-C的基因組DNA為模板擴增16S rDNA、gyrB基因片段，分別得到1484、492 bp的PCR特征性條帶。如圖4所示，運用鄰接法構(gòu)建該菌株的16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹發(fā)現(xiàn)該菌株與暹羅芽胞桿菌B.siamensisKCTC 13613，和貝萊斯芽胞桿菌B.velezensisCR-502在一個分支上，無法確定該菌株的分類地位。如圖5所示，運用最大似然法構(gòu)建該菌株的gyrB序列系統(tǒng)發(fā)育樹，發(fā)現(xiàn)該菌株與貝萊斯芽胞桿菌BS-37在一個分支上，結(jié)合形態(tài)學(xué)和生理生化特征，最終鑒定菌株FY-C為貝萊斯芽胞桿菌。

圖4 基于16S rDNA序列構(gòu)建的菌株FY-C系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of strain FY-C constructed based on 16S rDNA sequence

圖5 基于gyrB序列構(gòu)建的菌株FY-C系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Phylogenetic tree of FY-C strain constructed based on gyrB gene sequence

2.5 菌株FY-C的抑菌譜測定

利用實驗室保存的多種病原真菌和病原細菌對菌株FY-C進行抑菌譜檢測結(jié)果表明，菌株FY-C對多種病原真菌具有顯著拮抗作用，抑菌率50%～75 %，尤其對灰霉病菌的抑菌效果最佳，抑制率達到72.88%（表3）。但對試驗的獼猴桃潰瘍病菌無明顯效果。

表3 菌株FY-C對供試病原菌的抑菌作用試驗結(jié)果Table 3 Inhibitory effect against several fungal pathogens of strain FY-C

2.6 FY-C發(fā)酵液對煙草的促生效果

通過盆栽試驗發(fā)現(xiàn)菌株FY-C發(fā)酵液對煙草灌根處理具有明顯的促生效果，在接種FY-C發(fā)酵液處理45 d之后，煙草株高、莖粗、鮮重和干重等各項指標(biāo)都顯著高于CK處理。其中株高和鮮重較對照組增長最為明顯，分別增長28.54%、24.90%（表4）。

表4 菌株FY-C發(fā)酵液對煙草生物量的影響Table 4 Effect processing of FY-C fermentation broth on tobacco biomass

2.7 菌株FY-C發(fā)酵液對煙草青枯病的防治效果

經(jīng)菌株FY-C發(fā)酵液和青枯靈1500倍液分別預(yù)處理5 d后，接種青枯病菌的煙草植株上的發(fā)病率分別為30.12%和13.59%，對照處理發(fā)病率達到90.02%；經(jīng)FY-C發(fā)酵液和青枯靈1500倍液處理后的煙苗病情指數(shù)分別為19.21和11.45，防治效果分別為59.74%和76.00%，表明菌株FY-C對煙草青枯病具有一定的防治效果（表5）。

表5 FY-C發(fā)酵液對煙草青枯病的防治結(jié)果Table 5 Control results of FY-C fermentation broth on tobacco bacterial wilt

2.8 菌株FY-C功能性代謝物

通過皿內(nèi)培養(yǎng)試驗結(jié)果（圖6）發(fā)現(xiàn)，菌株FY-C能夠在羧甲基纖維素鈉平板和和酪蛋白平板上產(chǎn)生透明圈，說明菌株FY-C具有產(chǎn)纖維素酶和蛋白酶的能力；并且檢測發(fā)現(xiàn)FY-C菌液能夠在48孔板內(nèi)靜置培養(yǎng)24 h后形成結(jié)構(gòu)緊密的生物膜，而研究發(fā)現(xiàn)細菌的生物膜形成能力是影響定殖能力的關(guān)鍵因素，這為菌株的定殖及其防治病害提供了理論基礎(chǔ)。

圖6 菌株FY-C功能性代謝物檢測Fig.6 FY-C strain functional metabolite detection

3 討論

煙草青枯病作為一種細菌性土傳病害，一直是煙草生產(chǎn)的重要病害之一?；瘜W(xué)農(nóng)藥的過度使用不僅無法有效的防治青枯病，而且造成的環(huán)境污染問題亟需解決[16-18]。生物防治因其安全、無公害的特點，在農(nóng)業(yè)科技發(fā)展的同時也在不斷進步[19]。本研究篩選的對青枯雷爾氏菌具有較好拮抗作用的菌株FY-C分離自山西運城鹽湖湖岸的土壤中，該菌對煙草青枯病原菌的抑菌圈直徑可以達到 24.41 mm，高于張欣悅等[20]篩選的拮抗菌GZYCT-9的抑菌圈直徑為18.90 mm，夏艷等[7]篩選的拮抗菌H19的抑菌圈直徑為17.68 mm等研究效果相比，該菌抑菌效果較好。

關(guān)于生防菌株對青枯病菌形態(tài)的影響已有相關(guān)報道。在已報道的方法上進行改良，本研究通過掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)貝萊斯芽胞桿菌FY-C無菌濾液處理青枯病菌可使胞質(zhì)濃縮、胞壁降解、內(nèi)容物外滲，說明FY-C產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)可直接作用青枯病菌，這與連玲麗等[21]的研究相吻合。通過對FY-C發(fā)酵液進行不同溫度、pH處理，發(fā)現(xiàn)其對青枯病菌的拮抗效果無顯著差異，與胡雪芹等[22]分離的拮抗菌的耐高溫、耐酸堿性質(zhì)相一致。

隨著測序技術(shù)的發(fā)展，從先前只用16S rDNA/RNA序列單獨構(gòu)建系統(tǒng)樹以確定篩選拮抗細菌菌株的分類地位到現(xiàn)在多基因位點聯(lián)合分析，更能高效地鑒定菌株的分類地位[23-24]。本研究通過形態(tài)學(xué)、生理生化、16S rDNA與gyrB基因聯(lián)合建樹將菌株FY-C鑒定為貝萊斯芽胞桿菌。廣譜抑菌試驗發(fā)現(xiàn)，菌株FY-C能夠?qū)Χ喾N病原真菌菌絲造成不同程度的破壞，使其菌絲膨大畸形，無法正常生長，這為日后的生產(chǎn)應(yīng)用提供了理論依據(jù)。

促生與防治相輔相成，通過溫室盆栽試驗檢驗了菌株FY-C能夠促進煙草的生長，提高生物量，并且對煙草青枯病的防治也體現(xiàn)了較為不錯的效果。芽胞桿菌能夠分泌多種具有生物活性的代謝產(chǎn)物，包括脂肽類、蛋白類、多烯類、核酸類等[25-27]。本研究通過特定培養(yǎng)基檢測出貝萊斯芽胞桿菌 FY-C能夠分泌纖維素酶、蛋白酶等抗菌物質(zhì)。細菌通過形成生物膜能夠更好地在植物表面定殖，生物膜中的細菌通過共享環(huán)境中的營養(yǎng)物質(zhì)和氧氣，交流信息并作出相應(yīng)的反應(yīng)，具有比單細胞狀態(tài)下更強的抗逆性[28]，本研究在48孔細胞培養(yǎng)板上檢測出菌株FY-C能夠形成生物膜，這為后續(xù)的根際定殖提供了有力的理論基礎(chǔ)。

綜上，本文通過室內(nèi)試驗發(fā)現(xiàn)貝萊斯芽胞桿菌FY-C對煙草具有明顯的的促生和防病效果，這說明該菌株具有開發(fā)的潛力；并對其抑菌機理進行了初探，為后續(xù)的研發(fā)與田間應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)。但不足之處是未進行大田試驗，未考慮土壤、光照、濕度等綜合因素對生防菌株造成的影響，后續(xù)試驗仍需繼續(xù)探究。