氣質(zhì)聯(lián)用法同時測定皮革及其制品中7種限用異噻唑啉酮類抗菌劑

王成云，馮均利，白爽，孫小穎，李泳濤，李勇，楊左軍

(深圳海關(guān)工業(yè)品檢測技術(shù)中心，廣東 深圳 518067)

皮革及其制品富含蛋白質(zhì)和油脂，易發(fā)生霉變，需進行抗菌防霉整理以提高防霉性能。異噻唑啉酮類抗菌劑是一類高效、廣譜抗菌劑，首先由美國Rohm&Haas 公司取得專利權(quán)，抗菌機理是抗菌劑分子穿透微生物的細胞壁進入細胞內(nèi)部，與核酸(RNA 和DNA)中的堿性基結(jié)合，抑制微生物的再生繁殖[1,2]。異噻唑啉酮類抗菌劑大量用于皮革及其制品的防霉整理[3-6]。但是，部分異噻唑啉酮具有接觸致敏性，長期接觸時可導(dǎo)致接觸性皮炎、皮膚灼傷、濕疹、哮喘[7-19]。部分異噻唑啉酮類抗菌劑被證明對水生動物具有急性毒性[20-22]，職業(yè)性接觸時甚至可導(dǎo)致中毒性肝病死亡[23]。因此各國紛紛立法限制其使用[24,25]，2012 年發(fā)布歐盟生物殺滅產(chǎn)品法規(guī)(Biocidal Products Regulation,BPR)，禁止在皮革中使用2- 甲基 -4- 異噻唑啉 -3- 酮(2-methyl-4-isothiazolinone,MI)、1,2- 苯并異噻唑啉 -3- 酮(1,2-benzisothiazo- lin-3-one,BIT)、5- 氯 -2- 甲基 -4- 異噻唑啉 -3-酮(5-chloro-2-methyl-4-isothiazolin-3-one, CMI)、2-丁基-1,2- 苯并異噻唑啉-3- 酮(2-butyl-1,2- benzisothiazolin-3-one, BBIT)、4,5- 二 氯 -2- 正 辛 基-4- 異噻唑啉-3- 酮 (4,5-dichloro-n-octyl-4- isothiazo-lin-3-one, DCOI)、2- 正辛基 -4- 異噻唑啉-3- 酮(2-n- octyl-4- isothiazolin-3-one, OI)等 6 種異噻唑啉酮類抗菌劑，2013 年 9 月 1 日起，BPR 禁用2- 甲基-1,2- 苯并異噻唑啉-3- 酮(2- methyl-1,2-benzisothiazolin-3-one,MBIT)。皮革中異噻唑啉酮的測定已有文獻報道[26-29]，但測試對象只涵蓋了部分限用異噻唑啉酮。本文采用超聲萃取技術(shù)提取皮革及其制品中的異噻唑啉酮類抗菌劑，提取液用固相萃取柱進行凈化后進行氣質(zhì)聯(lián)用分析，建立了1 個能同時測定皮革及其制品中7 種限用異噻唑啉酮類抗菌劑的氣質(zhì)聯(lián)用分析方法。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Shimazdu GCMS-TQ 8040MX 氣質(zhì)聯(lián)用儀 (日本Shimazdu 公司)；Retch SM2000 織物研磨儀 (德國Retch 公司)；MJ-600 型超聲波清洗機(無錫市美極超聲設(shè)備有限公司)；RV10 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(廣州市華馨科學(xué)儀器有限公司)；DCY-12 型氮吹儀(常州市萬合儀器制造有限公司)；0.45μ m 聚四氟乙烯濾膜(上海安譜科學(xué)儀器有限公司)；supelclean LC-Ph 固相萃取柱(0.5g/3mL,美國 supelco 公司)。

OI (純度 99.9%)、BIT (純度 99.2%)、MI (純度99.5%)均由美國 Sigma-Aldrich 公司提供；DCOI(純度99.8%)由日本東京化成株式會社提供；MBIT(純度 98.0%)、BBIT(純度 95.0%)、CMI(純度 99.0%)均由德國Dr.Ehrenstorfer GmbH 公司提供。色譜純甲醇由美國Merck 公司提供，用甲醇配制質(zhì)量濃度約為1000 g/mL 的各標準儲備液，移取適量體積的各標準儲備液到25 mL 容量瓶中，用甲醇配制成混合標準儲備液?；旌蠘藴蕛湟褐蠱I、DCOI、CMI、BIT、MBIT、BBIT、OI 的質(zhì)量濃度分別為 40.23、39.67、39.20、38.40、20.75、20.49、19.19 g/mL，用甲醇將其分別稀釋 2、5、10、20、50、100、200、400 倍，得到系列濃度的混合標準工作液。

陽性樣品：市售黑色牛皮革，含有MI 和CMI。

1.2 樣品前處理

樣品前處理參照文獻[28]進行，選取有代表性的樣品，切割成小塊后，用織物研磨儀粉碎成粉末。準確稱取1.0 g 粉末，置于35 mL 玻璃反應(yīng)瓶中，加入25 mL 甲醇，40℃ 下超聲萃取 25 min，過濾，用雞心瓶收集濾液。將雞心瓶轉(zhuǎn)移至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中，在真空下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干。將雞心瓶轉(zhuǎn)移至氮吹儀中，用干燥氮氣緩慢吹干，用2 mL 甲醇溶解殘渣。所得溶液轉(zhuǎn)移到已經(jīng)用5 mL 甲醇進行預(yù)活化的supelclean LC-Ph 固相萃取柱(0.5g/3mL)中，用5 mL 甲醇淋洗，收集流出液，控制液體流出速度為2 滴/s。將流出液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，用干燥氮氣緩慢吹干后，用1 mL 甲醇溶解殘留物，所得溶液用0.45μ m 濾膜過濾，供 GC/MS 分析用。

1.3 分析條件

1.3.1 色譜條件

RXi-5MS(30m× 0.25mm× 0.25μ m)色譜柱，初始溫度為90℃，以15℃/min 的速度升至280℃，保持3 min。傳輸線溫度、進樣口溫度分別為280℃、270℃。不分流進樣，進樣量為1.0 L。載氣為高純氦氣(純度＞99.999%)，載氣流速為1.1 mL/min。溶劑延遲3.0 min。

1.3.2 質(zhì)譜條件

電離方式為電子轟擊電離(EI)，電離能為70eV，四極桿溫度和離子源溫度分別為150℃、210℃。采用全掃描方式定性，選擇離子監(jiān)測方式(GC/MS-SIM)定量，7 種限用異噻唑啉酮類抗菌劑的特征離子和豐度比見表1。

2 結(jié)果與討論

2.1 凈化條件優(yōu)化

皮革基質(zhì)復(fù)雜，在超聲提取目標分析物時，大量伴生雜質(zhì)也被提取出來，對儀器分析造成干擾，需要先進行凈化處理[28，29]。固相萃取柱凈化技術(shù)是一種常用的凈化技術(shù)，但經(jīng)固相萃取柱凈化后，往往會損失部分目標分析物，還可能會引入其他雜質(zhì)。分別考察了 Varian HF Bond C18SPE 柱 (2g/12mL) (1# 柱 )、Supelclean LC-18 SPE 柱 (1g/6mL)(2# 柱)、Supelclean LC-Si SPE 柱 (3g/6mL)(3# 柱)、Supelclean LC-Florisil SPE 柱 (1g/6mL)(4# 柱 )、Agilent Bond Elut C18柱(1g/6mL)(5# 柱)、Agilent Bond Elut Si SPE 柱(1g/6mL)(6# 柱)、Waters Sep-Pak Vac Silica 柱(1g/6mL)(7# 柱)、Anpelclean PA SPE 柱 (1g/6mL)(8# 柱 )、CNW Bond LC-C18SPE 柱 (1g/6mL)(9# 柱)、Supelclean ENVI-18 SPE 柱(0.5g/3mL)(10# 柱)、Agilent Bond Elut Al-N 中性氧化鋁柱(1g/6mL)(11# 柱)、Accu Bond Alumina 柱(1g/6mL) (12# 柱 )、Supelclean LC-Ph 柱 (0.5g/3mL)(13# 柱)、Waters Sep-Pak Vac C18柱 (0.5g/3mL)(14#柱)、Varian Bond Elut SCX 柱(0.5g/3mL)(15# 柱)、Accu Bond Florisil PR 柱(0.5g/3mL)(16# 柱)等 16 種固相萃取柱對混合標準儲備液的處理效果，表2 給出了經(jīng)和未經(jīng)固相萃取柱處理的混合標準儲備液色譜峰面積百分比。從表2 可知，經(jīng)固相萃取柱凈化處理后，所有目標分析物均有一定損失，其中經(jīng)supelclean LC-Ph 柱(0.5g/3mL)處理時損失最少，7 種目標分析物的回收率均大于95%。比較經(jīng)16 種固相萃取柱凈化處理后的目標分析物的譜圖，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)supelclean LC-Ph 柱(0.5g/3mL)凈化處理后，譜圖基線平穩(wěn)，基本無雜質(zhì)峰出現(xiàn)。因此，最終選擇supelclean LC-Ph 柱(0.5g/3mL)進行凈化。

2.2 超聲萃取條件優(yōu)化

萃取溶劑種類、萃取溫度、萃取時間、萃取溶劑體積、萃取方式均對萃取量有影響[30]。以甲醇為萃取溶劑，對陽性樣品進行單次超聲萃取。首先單獨考察萃取溫度(因素A)、萃取時間(因素B)、萃取溶劑體積(因素C)對萃取量的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)萃取量最大時萃取溫度、萃取時間、萃取溶劑體積的值分別為40℃、30 min、25 mL。為考察這3 個因素對萃取量的綜合影響，設(shè)計了表3 所示的三因素三水平正交實驗，在表3 給出的9 個實驗條件下對陽性樣品進行單次超聲萃取。根據(jù)表3 的數(shù)據(jù)計算各因素的k 值和極差[31]，確定優(yōu)方案，結(jié)果見表4。該陽性樣品中含有MI 和CMI，對于 MI 和 CMI，其優(yōu)方案均為 A1B2C1。在此條件下，對該陽性樣品連續(xù)萃取3 次，測定每次的萃取量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，第1 次萃取時，萃取量占總萃取量的97%以上，第3 次萃取時，MI 和CMI 均未檢出。因此，最終選用單次超聲萃取方式。在此條件下選擇不同的溶劑進行單次超聲萃取，考察MI 和CMI 萃取量的變化情況。皮革及其制品中含有大量脂肪，脂肪易溶于丙酮、正己烷、石油醚、叔丁基甲醚等弱極性溶劑，采用這些溶劑萃取時，萃取產(chǎn)物中夾雜有大量雜質(zhì)，干擾測試，因此不能使用這些溶劑來萃取。選擇極性較強的溶劑對陽性樣品進行萃取，結(jié)果見表5。從表5 可知，甲醇的萃取量最大。因此，超聲萃取條件最終優(yōu)化為：以25 mL 甲醇為萃取溶劑，40℃下超聲萃取25 min。

表1 特征離子及其豐度比

表2 經(jīng)固相萃取柱凈化后的回收率

表3 正交實驗

表4 正交實驗數(shù)據(jù)分析

表5 不同溶劑的萃取效果/mg/kg

2.3 分析條件的優(yōu)化

目標分析物在色譜柱固定相和流動相中的分配系數(shù)不同，氣相色譜分離時，目標分析物通過在固定相和流動相之間反復(fù)分配來實現(xiàn)各組分間的分離，影響分離效果的關(guān)鍵因素是固定相組成，此外，色譜柱長度、固定相厚度也對分離效果有影響。采用RXi-5MS（30m× 0.25mm× 0.25μ m）、DB- 35MS（30m×0.25mm × 0.25μ m）、DB-5HT （15m × 0.25mm ×0.10μ m）、DB-624 （30m× 0.25mm× 4.10μ m）、DB-Wax （60m × 0.25mm × 0.25μ m）、DB-5MS（30m× 0.25mm× 0.25μ m）、DB-5MS（60m× 0.25mm×0.25μ m）、DB-17MS （30m× 0.25mm× 0.25μ m）等8 種常見色譜柱對7 種異噻唑啉酮類抗菌劑混合標準溶液進行分離，改變載氣流速、升溫程序，觀察在不同色譜條件下的分離效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)采用1.3.1 中的色譜條件時，分離效果最好。在此條件下對7 種限用異噻唑啉酮類抗菌劑混合標準溶液進行分析，其GC/MS-SIM圖見圖1，7 種異噻唑啉酮類抗菌劑之間完全分離，各譜峰峰形尖銳，對稱性好。

圖1 混合標準溶液的GC/MS-SIM圖

2.4 線性關(guān)系和檢出限

按1.3 給定的分析條件對系列濃度的混合標準工作液進行測試，考察各組分峰面積(A)隨其質(zhì)量濃度(ρ )的變化情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對于每種異噻唑啉酮類抗菌劑，在一定質(zhì)量濃度(ρ )范圍內(nèi)，其峰面積(A)均與質(zhì)量濃度(ρ )線性相關(guān)，其線性關(guān)系見表6。在3倍信噪比 (S/N =3) 的條件下計算方法的檢出限，OI、MBIT、BBIT 的檢出限均為 0.05 mg/kg，CMI、DCOI、MI、BIT 的檢出限均為 0.10 mg/kg。

表6 線性關(guān)系和檢出限(LOD)

2.5 回收率和精密度

以不含目標分析物的牛皮革作為空白基質(zhì)，通過添加混合標準溶液來制備3 個不同濃度水平的測試樣，每個濃度各制備9 個平行樣，按上述方法對各測試樣進行測試，確定每個樣品中各組分的濃度，計算各組分的平均回收率和相對標準偏差(RSD,n=9)，結(jié)果見表7。7 種目標分析物的加標平均回收率為80.21%～95.87%，相對標準偏差(RSD, n=9)為1.26%～4.85%。

表7 回收率和精密度實驗

2.6 實際樣品測試

采用本文建立的方法對32 個市售皮革和皮革制品樣品(羊皮革及其制品樣品8 個、牛皮革及其制品樣品17 個、豬皮革及其制品樣品7 個)進行測試，結(jié)果在1 個黑色牛皮革樣品中同時檢出MI 和CMI，其余31 個樣品中則未檢出目標分析物。圖2是該樣品的GC/MS-SIM圖，該圖中在tR=3.754min、tR=4.152min 處各出現(xiàn)1 個尖銳譜峰，分別對應(yīng)于MI和 CMI，其含量分別為 1.98、3.55 mg/kg。

圖2 1 個陽性樣品的GC/MS-SIM圖

3 結(jié) 論

建立了1 個同時測定皮革及其制品中7 種限用異噻唑啉酮類抗菌劑的氣質(zhì)聯(lián)用分析方法，該方法采用超聲萃取技術(shù)提取皮革及其制品中殘留的異噻唑啉酮類抗菌劑，提取產(chǎn)物經(jīng)supelclean LC-Ph 柱(0.5g/3mL) 固相萃取柱凈化后直接進行GC/MS-SIM測定，外標法定量。該方法檢出限為0.05～0.10 mg/kg，遠低于相關(guān)法規(guī)的限量要求。該方法簡單快速，靈敏度高，檢出限低，可完全滿足皮革及其制品中限用異噻唑啉酮類抗菌劑日常檢測工作的需要。