反相高效液相色譜法同時(shí)測定利肝寧片中對(duì)羥基苯乙酮和綠原酸的含量*

覃芳，李廣勝，郭興輝，胡文文，劉會(huì)麗

1.河南中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院，河南 鄭州450008；2.河南省食品藥品檢驗(yàn)所，河南 鄭州450003

利肝寧片，由茵陳、虎杖、黃連、板藍(lán)根、白芍、木香、水紅花子、茯苓、砂仁、半夏等中藥組成?？v觀全方，熔清熱解毒、祛濕退黃、養(yǎng)血破瘀、理氣消痞為一爐，標(biāo)本兼顧，共奏清肝利膽，健脾和胃之功。臨床驗(yàn)證，對(duì)慢性肝炎濕熱中阻證療效顯著。

本方根據(jù)張仲景及吳鞠通論“黃疸”和“濕熱中阻”的辨證理論，結(jié)合慢性肝炎病程長及臨床表現(xiàn)多變的特點(diǎn)，選用張仲景清肝利膽之茵陳蒿湯和吳鞠通治療濕熱中阻的“辛開苦降”之法而組成本方［1-2］。該方20世紀(jì)80年代為湯劑應(yīng)用于臨床，1990年改為蜜丸，1991年改為片劑后申報(bào)為河南省重點(diǎn)科技攻關(guān)項(xiàng)目。1993年經(jīng)河南省衛(wèi)生廳藥政處與廣西省衛(wèi)生廳藥政處委托解放軍303醫(yī)院臨床觀察，有效率為85.3%。1995年申報(bào)鄭州市衛(wèi)生局批準(zhǔn)為醫(yī)院制劑使用。該方由湯劑演變成片劑，歷經(jīng)20余年。制成片劑后，療效確切，服用方便，價(jià)格適中，取得了良好的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益，深受患者好評(píng)。

目前，未見利肝寧片質(zhì)量控制的相關(guān)資料，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，對(duì)羥基苯乙酮和綠原酸為利肝寧片主藥茵陳藥材利膽藥效的有效成分，明確其含量范圍是控制本藥質(zhì)量的關(guān)鍵?，F(xiàn)參考相關(guān)文獻(xiàn)資料，對(duì)利肝寧片中指標(biāo)性成分對(duì)羥基苯乙酮和綠原酸的含量測定方法學(xué)進(jìn)行研究［3］。

1 儀器與藥品

1.1 儀器美國Agilent公司1260高效液相色譜儀，chemStation色譜工作站；1310A-IsoPump；G1314A VWD檢測器；上海梅特勒-托利多公司Mettle AE240電子分析天平［4-7］。

1.2 藥品對(duì)羥基苯乙酮對(duì)照品（中國食品藥品檢定研究院，純度：99.9%，批號(hào)：111897-201602）；綠原酸對(duì)照品（中國食品藥品檢定研究院，純度：96.8%，批號(hào)：110753-201817）；利肝寧片（批號(hào)：20180501，20180601，20180701）由河南中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院制劑室提供，除乙腈為色譜純外，其余試劑均為分析純。實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 色譜條件色譜柱：安捷倫ZORBAX Eclipse XDB C18（4.6 mm×250.0 mm，5μm）；流動(dòng)相：（體積分?jǐn)?shù)）0.05%磷酸溶液-乙腈（90∶10）；檢測波長：275 nm（對(duì)羥基苯乙酮）和327 nm（綠原酸）；柱溫：35 ℃；流 速：1.0 mL· min-1；進(jìn) 樣 量：20μL［8-16］。

2.2 溶液制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備［17-23］對(duì)羥基苯乙酮對(duì)照品溶液制備：精密稱取對(duì)羥基苯乙酮對(duì)照品10.18 mg，轉(zhuǎn)移至20 mL容量瓶中，加入體積分?jǐn)?shù)70%甲醇溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻后制成對(duì)羥基苯乙酮對(duì)照品的儲(chǔ)備液。移液管精密量取對(duì)照品的儲(chǔ)備液1 mL，轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，得對(duì)羥基苯乙酮對(duì)照品溶液，備用。

綠原酸對(duì)照品溶液制備：精密稱取綠原酸對(duì)照品10.65 mg，轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，加入體積分?jǐn)?shù)70%甲醇溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻后得綠原酸對(duì)照品儲(chǔ)備液；移液管精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備液1 mL，轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，得綠原酸對(duì)照品溶液，備用。

2.2.2 供試品溶液的制備取利肝寧片20片，精密稱定，置于研缽中研細(xì)，精密稱取約4片質(zhì)量細(xì)粉，置于具塞錐形瓶中，并精密量取50 mL體積分?jǐn)?shù)70%甲醇。調(diào)整超聲設(shè)備功率140 W，頻率42 kHz后進(jìn)行處理30 min，取出，放冷，再進(jìn)行質(zhì)量稱定。用體積分?jǐn)?shù)70%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻后離心，并取上清液過濾，取濾液備用。

2.2.3 陰性對(duì)照溶液的制備取缺茵陳的陰性樣品10片，按2.2.2供試品溶液制備方法操作，制備陰性對(duì)照品溶液。

3 結(jié)果

3.1 系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)各量取20μL的綠原酸對(duì)照品溶液、對(duì)羥基苯乙酮對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性對(duì)照溶液，分別注入色譜儀，以2.1項(xiàng)下的色譜條件為檢測條件，測定并記錄。在275 nm波長下，供試品溶液中對(duì)羥基苯乙酮的保留時(shí)間為30.8 min，理論板數(shù)按對(duì)羥基苯乙酮峰計(jì)算7 854，對(duì)羥基苯乙酮峰與其他峰分離度符合要求，且在對(duì)羥基苯乙酮對(duì)照品出峰位置陰性對(duì)照品無色譜峰出現(xiàn)。在327 nm波長下，供試品溶液中綠原酸的保留時(shí)間為14.7 min，理論板數(shù)按綠原酸峰計(jì)算9 235，綠原酸峰與其他峰分離度符合要求。在綠原酸對(duì)照品保留時(shí)間相應(yīng)的位置上，陰性對(duì)照品溶液沒有出現(xiàn)色譜峰。由此可見，在利肝寧片的處方中，其他藥材對(duì)羥基苯乙酮和綠原酸的含量測定不產(chǎn)生干擾。見圖1。

3.2 線性關(guān)系實(shí)驗(yàn)精密量取對(duì)羥基苯乙酮對(duì)照品儲(chǔ)備液0.25 mL、0.5 mL、1 mL、1.5 mL、2 mL置50 mL容量瓶中，加體積分?jǐn)?shù)70%甲醇稀釋至刻度，分別制成濃度為2.545 mg·L-1、5.09 mg·L-1、10.18 mg·L-1、15.27 mg·L-1、20.36 mg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，每個(gè)濃度連續(xù)進(jìn)樣2次，求峰面積平均值。以質(zhì)量濃度對(duì)峰面積作圖，結(jié)果經(jīng)回歸分析得回歸方程：Y＝44.915X+10.007，r＝0.999 7。結(jié)果表明，對(duì)羥基苯乙酮對(duì)照品溶液在2.545～20.360 mg·L-1內(nèi)與峰面積成良好的線性關(guān)系。

精密量取綠原酸對(duì)照品儲(chǔ)備液0.25 mL、0.5 mL、1 mL、1.5 mL、2 mL置10 mL容量瓶中，加體積分?jǐn)?shù)70%甲醇稀釋至刻度，分別制成濃度為10.31 mg·L-1、20.62 mg·L-1、41.24 mg·L-1、61.86 mg·L-1、82.47 mg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，每個(gè)濃度連續(xù)進(jìn)樣2次，求峰面積平均值。以質(zhì)量濃度對(duì)峰面積作圖，結(jié)果經(jīng)回歸分析得回歸方程：Y＝8.803 5X+1.684 8，r＝0.999 8。結(jié)果表明，綠原酸對(duì)照品溶液在10.31～82.47 mg·L-1內(nèi)與峰面積成良好的線性關(guān)系。

圖1 利肝寧片高效液相色譜圖

3.3 檢出限實(shí)驗(yàn)分別取3.2線性關(guān)系實(shí)驗(yàn)項(xiàng)下的溶液，逐級(jí)稀釋，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣20μL，信噪比S／N為3時(shí)，對(duì)羥基苯乙酮的檢出限為：20.4 ng；綠原酸的檢出限為：41.2 ng。

3.4 精密度實(shí)驗(yàn)分別精密量取對(duì)羥基苯乙酮對(duì)照品儲(chǔ)備液0.2 mL和綠原酸對(duì)照品儲(chǔ)備液1 mL置同一10 mL容量瓶中，加體積分?jǐn)?shù)70%甲醇稀釋至刻度，制成每1 mL含對(duì)羥基苯乙酮10.18μg和綠原酸41.24μg的混合對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，峰面積平均值分別為465.3和360.3，RSD分別為0.9%和1.2%，表明該方法精密度良好。

3.5 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)取2.2.2項(xiàng)下供試品溶液，分別在0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h測定，對(duì)羥基苯乙酮和綠原酸的峰面積均值分別為296.8和285.1，RSD分別為1.1%和1.3%，表明供試品溶液制備后10 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

3.6 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)精密稱取樣品6份，樣品批號(hào)：20180501。按2.2.2項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，并按2.1項(xiàng)下色譜條件測定含量，對(duì)羥基苯乙酮和綠原酸的平均含量分別為每片0.08 mg和0.35 mg，RSD分別為1.4%和1.2%，表明該方法重復(fù)性良好。

3.7 回收率實(shí)驗(yàn)精密稱取本品（批號(hào)：20180501）6份（每份約相當(dāng)于2片質(zhì)量），置具塞錐形瓶中，每份精密加入對(duì)羥基苯乙酮對(duì)照品和綠原酸對(duì)照品適量，精密加入體積分?jǐn)?shù)70%甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，按2.2.2項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，分別進(jìn)樣，按外標(biāo)法計(jì)算含量和回收率，結(jié)果見表1、表2。

表2 綠原酸回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.8 樣品含量測定分別取樣品（批號(hào)：20180501，20180601，20180701）細(xì)粉適量（約相當(dāng)于利肝寧片4片質(zhì)量），按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，測定含量，結(jié)果每片對(duì)羥基苯乙酮含量分別為：0.081 mg、0.080 mg、0.082 mg；綠原酸含量分別為：0.35 mg、0.36 mg、0.35 mg。

4 方法探討

4.1 檢測波長的選擇利肝寧片化學(xué)成分復(fù)雜，通過供試品溶液全波長紫外圖譜可知對(duì)羥基苯乙酮在275 nm波長處有最大吸收，綠原酸在327 nm波長處有最大吸收，為提高被檢測成分的靈敏度和準(zhǔn)確度，分別選擇各自的最大吸收波長作為檢測波長，進(jìn)行兩個(gè)波長同時(shí)檢測，實(shí)現(xiàn)對(duì)羥基苯乙酮和綠原酸的同時(shí)測定。

4.2 色譜條件的選擇查閱相關(guān)文獻(xiàn)，對(duì)比篩選磷酸溶液的pH值、濃度和乙腈的比例對(duì)分離結(jié)果的影響，最終確定（體積分?jǐn)?shù)）0.05%磷酸溶液-乙腈（90∶10）為流動(dòng)相條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分析。同時(shí)考察不同品牌型號(hào)的色譜柱對(duì)分離效果的影響，最終選擇安捷倫ZORBAX Eclipse XDB C18（4.6 mm×250 mm，5μm）色譜柱，主成分保留時(shí)間適中，分離效果好。

4.3 提取方法的選擇近年來中藥浸提新方法、新技術(shù)不斷涌現(xiàn)，并被廣泛推廣應(yīng)用，使中藥制劑的質(zhì)量不斷提高。如加壓逆流提取法、半仿生提取法、旋流提取法、超臨界流體萃取技術(shù)、超聲提取技術(shù)、微波萃取技術(shù)及高速逆流色譜提取技術(shù)等。本實(shí)驗(yàn)參考相關(guān)文獻(xiàn)資料，選擇超聲提取法和傳統(tǒng)回流提取法，提取后進(jìn)行對(duì)比發(fā)現(xiàn)二者并無顯著差異。超聲提取法的優(yōu)勢在于，利用超聲波增大物質(zhì)分子運(yùn)動(dòng)頻率和速度的原理，使溶劑穿透力增加，藥物溶出速度和溶出次數(shù)得到提高，縮短了提取時(shí)間，并且提取所用設(shè)備操作簡單，供試品受熱溫度低，被測成分穩(wěn)定性好，故最后選擇了超聲提取法。另對(duì)提取溶劑和提取時(shí)間進(jìn)行考察，采用體積分?jǐn)?shù)50%、70%和100%的甲醇為提取溶劑，分別超聲提取30 min、60 min、120 min，結(jié)果體積分?jǐn)?shù)70%的甲醇提取效率最高，超聲時(shí)間對(duì)含量測定結(jié)果基本無影響，故提取方法最終確定為選擇體積分?jǐn)?shù)70%的甲醇為溶劑超聲提取30 min。

5 討論

乙型肝炎病毒（hepatitis b virus，HBV）慢性感染有高度的種屬和組織特異性，HBV慢性感染會(huì)導(dǎo)致不可逆的肝細(xì)胞炎性壞死和纖維化，最終進(jìn)展為肝硬化或肝癌。近年來，治療慢性乙型病毒性肝炎領(lǐng)域的一大突破，就是已經(jīng)認(rèn)識(shí)到只有從根本上抑制HBV的復(fù)制才能夠明顯延緩疾病的進(jìn)展，并據(jù)此開發(fā)出了很多新型的抗病毒藥物，把病毒復(fù)制量控制在比較低的水平，但很多藥物存在耐藥問題，一旦抗病毒藥耐藥將無法繼續(xù)控制HBV的復(fù)制［24］。目前對(duì)HBV的感染尚無有效的徹底治愈手段。

近年來研究顯示，中醫(yī)利用其整體辨證論治的核心理念治療慢性乙型病毒性肝炎，標(biāo)本兼治，不僅改善癥狀，還通過調(diào)理機(jī)體提升免疫力，延緩疾病進(jìn)展、改善患者生活質(zhì)量。中醫(yī)治療慢性乙型病毒性肝炎具有其獨(dú)特的優(yōu)勢。

利肝寧片的組方是李學(xué)斌教授的經(jīng)驗(yàn)方，應(yīng)用臨床多年，療效顯著。方中茵陳苦、微寒，歸肝、膽、脾、胃經(jīng)，清熱利濕，為退黃要藥，常用于治療濕瘡瘙癢、黃疸尿少及傳染性黃疸型肝炎。大量文獻(xiàn)報(bào)道，綠原酸、咖啡酸和對(duì)羥基苯乙酮為茵陳藥材利膽作用的有效成分［25］。

本實(shí)驗(yàn)利用RP-HPLC法測定利肝寧片中對(duì)羥基苯乙酮和綠原酸的含量。選用綠原酸和對(duì)羥基苯乙酮的最大吸收波長為檢測波長進(jìn)行雙波長檢測，最大程度減少其他成分對(duì)檢測成分的干擾。流動(dòng)相選擇（體積分?jǐn)?shù)）0.05%磷酸溶液-乙腈（90∶10），在選定的色譜條件下，對(duì)羥基苯乙酮和綠原酸的保留時(shí)間分別是30.8 min和14.7 min，目標(biāo)峰與其他峰分離度良好，且在該時(shí)間點(diǎn)陰性對(duì)照品無其他干擾峰出現(xiàn)。該實(shí)驗(yàn)為利肝寧片的質(zhì)量控制提供了有效方法，對(duì)進(jìn)一步明確其療效補(bǔ)充了理論依據(jù)。