哈巴苷對病毒性心肌炎模型小鼠的影響*

王成攀，高峰，吳敬欣，張麗德，劉寶文

遼寧中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，遼寧沈陽117000

病毒性心肌炎是一種炎癥性心臟病，由導致心肌壞死的病毒感染引起的［1］，其特征為心肌的炎性浸潤和心肌細胞壞死。病毒性心肌炎是嚴重心力衰竭的主要原因，甚至引發(fā)患者猝死［2］?？滤_奇病毒B3（coxsackievirus group B type3，CVB3）是病毒性心肌炎的主要病原因子，常用于誘導小鼠心肌炎模型，其模型與人類病毒性心肌炎有許多共同特征［3］。目前，臨床上已嘗試了許多治療策略，如抗病毒、免疫抑制和抗氧化療法治療病毒性心肌炎，然而這些方法并沒有產生足夠的效果及改善患者的存活率［4］。哈巴苷是提取自中藥玄參的一種環(huán)烯醚萜類活性成分，具有抗炎、神經保護、增強免疫、抑制血小板凝聚等作用［5-6］。由于哈巴苷的抗炎活性，我們考慮其是否可用于改善病毒性心肌炎。本研究旨在探討哈巴苷對病毒性心肌炎模型小鼠的作用。

1 材料

1.1 動物90只雄性Balb／c小鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，5周齡，體質量（20±2）g，許可證號：SCXK（京）2016-0006，置于溫度（22±2）℃，濕度55% ～75%，12 h光暗循環(huán)動物設施內飼養(yǎng)。

1.2 藥物及試劑哈巴苷（中國食品藥品檢定研究院，批號：111729-201707），化學式：C15H24O10，分子量：364，純度≥96.8）；卡托普利（中國食品藥品檢定研究院，貨號：100318-201904）；B3型柯薩奇病毒（上海一基實業(yè)有限公司，貨號：DA647049）；Eagle′s培養(yǎng)液（上海經科化學科技有限公司，貨號：GNM-14266）；蘇木素伊紅染色（HE）試劑盒（上海碧云天生物技術研究所，貨號：C0105）；乳酸脫氫酶（lactatedehy drogenase，LDH）試劑盒（南京建成生物工程研究所，貨號：A020-2）；肌酸激酶同工酶-MB（creatine kinase lsoenzyme-MB，CK-MB）、心肌肌鈣蛋白I（myocardialtroponin I，cTnI）、心肌肌鈣蛋白T（cardiac troponin，cTnT）測定試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司，貨號分別為：E006-1-1、ml001932、ml037292）；腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）ELISA試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司，貨號分別為：ab6671、ab100704、ab100712）；NOD樣受體蛋白3（NOD-like receptor protein 3，NLRP3）抗體（美國Abcam公司，貨號：ab214185）；半胱天冬酶-1（cleaved caspase-1）抗體（美國Abcam公司，貨號：ab2302）；GAPDH抗體（美國Abcam 公司，貨號：ab9485）。

1.3 儀器UV1900型紫外分光光度計（上海讓奇儀器科技有限公司）；HBS-1096A型全自動酶標儀（北京華泰和合商貿有限公司）；KR-S80型超聲診斷儀（徐州市凱爾醫(yī)學儀器有限公司）；JS-power600型電泳儀（上海培清科技有限公司）；VILBER INFINITY 3026型凝膠成像儀（法國VILBER LOURMAT公司）。

2 方法

2.1 病毒性心肌炎慢性期心肌纖維化模型復制將90只小鼠隨機分為6組，每組15只，即對照組：第0、14、28天腹腔接種不含病毒的Eagle′s液；CVB3組［7］：第0天腹腔接種含CVB3／TCD50＝10-5的1∶2 000病毒稀釋液0.2 mL，第14天腹腔接種1∶1 600病毒稀釋液0.2 mL，第28天腹腔注射1∶800病毒稀釋液0.2 mL；哈巴苷低劑量組：模型建立同CVB3組，第60天灌胃哈巴苷（2 mg·kg-1），持續(xù)45 d；哈巴苷中劑量組：模型建立同CVB3組，第60天灌胃哈巴苷（10 mg·kg-1），持續(xù)45 d；哈巴苷高劑量組：模型建立同CVB3組，第60天灌胃哈巴苷（20 mg·kg-1），持續(xù)45 d；卡托普利組：模型建立同CVB3組，第60天灌胃 0.2 mL 卡托普利（15 mg·kg-1），持續(xù)45 d。造模60 d后存活小鼠為病毒性心肌炎模型，第105天取外周血150μL，4℃、離心半徑8 cm、3 000 rpm·min-1離心，取上清，-20℃保存待用。

2.2 超聲心動圖檢查每組取15只小鼠，用3%水合氯醛將其麻醉，左側臥位，采用彩色多普勒超聲儀檢測小鼠左室舒張期后壁厚度（LVPWd）、射血分數(shù)（EF%）、舒張早期二尖瓣血流速度（E）、舒張早期二尖瓣環(huán)運動速度（E′IVS），計算舒張早期二尖瓣血流速度與舒張早期二尖瓣環(huán)運動速度的比值。

2.3 心肌酶指標每組取10只小鼠心肌勻漿液，采用紫外分光光度計檢測CK-MB、LDH、cTnI、cTnT水平。CK-MB在340 nm處測OD值，LDH、cTnI、cTnT在450 nm處測OD值。

2.4 HE染色斷頭法處死小鼠，取心臟用10%福爾馬林固定行石蠟包埋切片。采用蘇木素伊紅染液進行染色：將石蠟切片脫蠟，蒸餾水潤濕組織，核染液染色5 min，水洗5 s，漿染液染色30 s，水洗后，濾紙吸干，無水乙醇脫水2次后封片，在熒光顯微鏡下觀測。

2.5 ELISA檢測血清中TNF-α、IL-6、IL-1β水平在4℃下用50 mM的碳酸鹽緩沖液溶解抗原，每孔取100μL到96孔酶標板，將抗原包被過夜，棄去包被液，用PBST洗滌3次，每次5 min，每孔加150μL的1%BSA封閉1 h，PBST洗滌3次，加入100μL不同倍比稀釋度的血清，并加入對照樣品，37℃孵育2 h，PBST洗滌5次，加入100μL稀釋后的HRP標記的二抗，37℃孵育1h，PBST洗滌5次后顯色劑顯色20 min，用酶標儀測定。

2.6 Western blot法檢測心肌組織的蛋白表達取3只小鼠心肌組織置于玻璃勻漿器內勻漿，在冰上溶解25 min。以4℃、離心半徑8 cm、12 000 r·min-1離心20 min，加入含蛋白酶抑制劑的細胞裂解液進行總蛋白提取，用BCA試劑盒測定蛋白質含量。提取等量的蛋白質樣品，在100℃下變性5 min。使用SDS-PAGE凝膠電泳法分離并轉移至PVDF膜，在4℃下加入相應一抗并孵育過夜，清洗，在4℃下加入辣根過氧化物酶標記的二抗，孵育2 h，最后加入發(fā)光液，曝光處理。用ImageJ軟件統(tǒng)計灰度值。

2.7 統(tǒng)計學方法用SPSS 17.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，兩兩比較用獨立的t檢驗，結果以均數(shù)±標準差（±s）表示。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 哈巴苷對病毒性心肌炎小鼠心肌組織病理損傷程度的影響對照組心肌細胞形態(tài)正常，心肌纖維排列整齊、紋理清晰、無炎性細胞浸潤；CVB3組心肌細胞核發(fā)生形變細胞斷裂，心肌纖維排列紊亂、水腫、大量炎性細胞浸潤，表現(xiàn)出明顯病毒性心肌損傷；哈巴苷低、中、高劑量組和卡托普利組較CVB3組病理損傷程度均有不同程度的改善，炎性細胞浸潤減少、心肌纖維排列整齊、水腫減退。見圖1。

圖1 哈巴苷對病毒性心肌炎小鼠心肌組織病理損傷程度的影響（HE染色，×400）

3.2 哈巴苷對病毒性心肌炎模型小鼠血清中CK-MB、LDH和cTnI、cTnT水平的影響與對照組比較，CVB3組CK-MB、LDH、cTnI、cTnT水平明顯升高（P＜0.05）；與CVB3組比較，哈巴苷低、中、高劑量組和卡托普利組CK-MB、LDH、cTnI、cTnT水平明顯降低（P＜0.05）。見表1。

表1 哈巴苷對病毒性心肌炎模型小鼠血清中心肌酶CK-MB、LDH和cTnI、cTnT水平的影響 （±s）

表1 哈巴苷對病毒性心肌炎模型小鼠血清中心肌酶CK-MB、LDH和cTnI、cTnT水平的影響 （±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與CVB3組比較，＃P＜0.05

組別n劑量／mg·kg-1 CK-MB（ρ／pg·L-1）LDH／IU·L-1 cTnI（ρ／pg·L-1）cTnT（ρ／pg·L-1）10-55.1±8.5 210.5±10.8 0.05±0.02 0.08±0.02 CVB3組10-137.3±24.0*576.4±45.7*0.37±0.04*0.32±0.05*哈巴苷低劑量組10 2 111.5±15.7＃447.4±36.5＃0.31±0.05＃0.29±0.04＃哈巴苷中劑量組10 10 88.4±9.6＃355.2±42.8＃0.28±0.03＃0.21±0.03＃哈巴苷高劑量組10 20 72.5±8.3＃230.8±16.3＃0.22±0.03＃0.13±0.02?？ㄍ衅绽M10 15 84.8±7.4＃247.0±25.5＃0.24±0.04＃0.18±0.02對照組＃

3.3 哈巴苷對CVB3誘導的病毒性心肌炎模型小鼠心功能的影響與對照組比較，CVB3組LVPWD、E／E′IVS明顯升高（P＜0.05），EF%明顯降低（P＜0.05）；哈巴苷低、中、高劑量組和卡托普利組LVPWD、E／E′IVS明顯低于CVB3組（P＜0.05），CVB3組EF%明顯低于哈巴苷低、中、高劑量組和卡托普利組（P＜0.05）。見表2。

表2 哈巴苷對CVB3誘導的病毒性心肌炎模型小鼠心功能的影響 （±s）

表2 哈巴苷對CVB3誘導的病毒性心肌炎模型小鼠心功能的影響 （±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與CVB3組比較，＃P＜0.05

組別n 劑量／mg·kg-1 LVPWD（l／mm）EF%E／E′IVS對照組15-0.75±0.08 58.1±6.5 19.2±2.3 CVB3組15-1.26±0.09* 40.5±5.4* 46.6±5.5*哈巴苷低劑量組 15 2 1.15±0.05＃ 43.3±4.8＃ 40.8±4.6＃哈巴苷中劑量組 15 10 1.09±6.4＃48.8±5.0＃ 37.3±4.1＃哈巴苷高劑量組 15 20 0.95±6.3＃54.8±5.9＃ 28.4±3.4?？ㄍ衅绽M15 15 0.86±6.7＃50.2±5.4＃ 25.0±3.2＃

3.4 哈巴苷對CVB3誘導的病毒性心肌炎模型小鼠炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β水平的影響與對照組比較，CVB3組TNF-α、IL-6、IL-1β水平明顯升高（P＜0.05）；哈巴苷低、中、高劑量組和卡托普利組TNF-α、IL-6、IL-1β水平明顯低于CVB3組（P＜0.05）。見表3。

表3 哈巴苷對CVB3誘導的病毒性心肌炎模型小鼠炎癥 因子TNF-α、IL-6、IL-1β水平的影響 （±s，ng·L-1）

表3 哈巴苷對CVB3誘導的病毒性心肌炎模型小鼠炎癥 因子TNF-α、IL-6、IL-1β水平的影響 （±s，ng·L-1）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與CVB3組比較，＃P＜0.05

組別n劑量／mg·kg-1 TNF-αIL-6 IL-1 β 10-46.1±5.3 149.1±12.51 97.2±14.3 CVB3組10-115.3±20.5*580.1±59.4* 635.6±64.5*哈巴苷低劑量組 10 2 65.6±4.5＃ 436.3±33.8＃ 560.8±55.6＃哈巴苷中劑量組 10 10 52.9±6.4＃ 372.8±35.0＃ 384.3±38.1＃哈巴苷高劑量組 10 20 41.5±6.3＃ 314.8±25.9＃ 212.4±24.4?？ㄍ衅绽M10 15 40.7±6.7＃ 310.2±10.4＃ 161.0±13.2對照組＃

3.5 哈巴苷對CVB3誘導的病毒性心肌炎模型小鼠NLRP3、cleaved caspase-1蛋白水平的影響與對照組比較，CVB3組NLRP3、cleaved caspase-1蛋白水平明顯升高（P＜0.05）；哈巴苷低、中、高劑量組和卡托普利組NLRP3、cleaved caspase-1蛋白水平明顯低于CVB3組（P＜0.05）。見表4、圖2。

表4 哈巴苷對CVB3誘導的病毒性心肌炎模型小鼠NLRP3、cleaved caspase-1蛋白水平的影響 （±s）

表4 哈巴苷對CVB3誘導的病毒性心肌炎模型小鼠NLRP3、cleaved caspase-1蛋白水平的影響 （±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與CVB3組比較，＃P＜0.05

組別n 劑量／mg·kg-1 NLRP3 cleaved caspase-1對照組3-0.20±0.03 0.12±0.02 CVB3組3-1.45±0.16*1.33±0.15*哈巴苷低劑量組 3 2 1.02±0.09＃0.98±0.10＃哈巴苷中劑量組 3 10 0.81±0.10＃0.83±0.09＃哈巴苷高劑量組 3 20 0.42±0.05＃0.48±0.06＃卡托普利組3 15 0.22±0.03＃0.31±0.04＃

圖2 NLRP3、cleaved caspase-1蛋白水平

4 討論

以心肌炎癥為特征的病毒性心肌炎是心臟病學中最具挑戰(zhàn)性的臨床問題之一。據(jù)估計，40歲以下患者猝死的比例高達12%［8］，其中，CVB3是病毒性心肌炎的主要原因。由于適當?shù)母腥究刂拼胧┤匀粺o法完全用于CVB3感染，因此心肌炎患者常常發(fā)展為慢性擴張型心肌病，最終死于心力衰竭［9］。目前，臨床尚無治療病毒性心肌炎的特效藥物，以營養(yǎng)心肌、改善癥狀、穩(wěn)定心肌酶及對癥治療為主［10］。本研究采用CVB3病毒制備病毒性心肌炎小鼠模型，給予不同劑量的哈巴苷進行干預，明確藥物的劑量效應關系。研究發(fā)現(xiàn)，CVB3誘導的小鼠心肌組織具有病理損傷，而哈巴苷低、中、高劑量組均可有效改善病毒性心肌炎小鼠心肌細胞病理指標，改善LVPWD、EF%、E／E′IVS等心室重構指標，說明哈巴苷對CVB3誘導的心肌組織損傷具有保護作用。

心肌酶譜變化被認為是病毒性心肌炎的診斷指標之一，具有重要的臨床意義，其中LDH 和CK-MB是用于評估心肌酶水平的參數(shù)［11］，cTnT是用于心肌炎診斷評估的敏感生物標志物［12］，高水平的cTnI與嚴重心肌炎的臨床和超聲心動圖證據(jù)相關［13］。Zhang Y等［14］研究發(fā)現(xiàn)，MicroRNA-381通過靶向環(huán)氧合酶-2降低CK-MB和LDH水平，從而抑制CVB3誘導的心肌細胞損傷。Zhang Z等［15］研究發(fā)現(xiàn)，黃芪通過降低CK-MB和cTnI水平改善病毒性心肌炎兒童外周Treg細胞免疫失衡。本研究表明，哈巴苷有降低CK-MB、LDH、cTnI、cTnT水平的作用，說明其可通過調節(jié)心肌酶對CVB3誘導的病毒性心肌炎起到治療作用。

病毒性心肌炎的特征在于心肌過度炎癥導致心臟損傷，在病毒感染過程中，由心肌細胞和浸潤的炎性細胞產生的細胞因子和趨化因子對于疾病進展是重要的［16］。心肌細胞中的病毒感染引發(fā)促炎細胞因子的表達，包括TNF-α、IL-6、IL-1β和趨化因子，這些細胞因子招募和積聚在受感染的心臟強烈促進促炎癥細胞因子的表達，并進一步激活免疫細胞，導致心臟大量炎癥和嚴重傷害［17］。Li SG等［18］研究發(fā)現(xiàn)，尼古丁以劑量依賴的方式通過下調TNF-α、IL-6、IL-1β炎癥因子水平以降低CVB3誘導的病毒性心肌炎的嚴重程度。Li-Sha G等［19］研究發(fā)現(xiàn)，卡維地洛通過降低TNF-α、IL-6水平改善CVB3誘導的病毒性心肌炎。本研究發(fā)現(xiàn)，哈巴苷具有降低炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β水平的作用，推測哈巴苷對CVB3誘導的病毒性心肌炎具有治療作用。

NLRP3炎癥小體是一種胞內蛋白復合體，由NLRP3、凋亡相關點樣蛋白（ASC）和半胱天冬酶-1前體（pro-caspase-1）組成，NLRP3可以調控IL-1β的表達，NLRP3激活后產生活化的cleaved caspase-1，進而將IL-1β前體加工為成熟狀態(tài)，引起炎癥反應［20］。相關研究表明，CVB3誘導的病毒性心肌炎中，由ROS和K+外流引發(fā)的NLRP3炎性小體激活在發(fā)病過程中可能是至關重要的［21］。Tschope C等［22］研究發(fā)現(xiàn)，敲除NOD2可減少CVB3誘導的病毒性心肌炎中NLRP3的生成，使ASC、CARD、caspase-1、IL-1β的表達下調改善病毒性心肌炎。本研究發(fā)現(xiàn)，哈巴苷具有下調NLRP3、cleaved caspase-1的蛋白水平，說明哈巴苷通過下調NLRP3、cleaved caspase-1水平改善CVB3誘導的病毒性心肌炎炎癥。

本研究揭示了哈巴苷對CVB3誘導的病毒性心肌炎小鼠的作用。即通過改善心肌組織病理損傷程度，降低血清中心肌酶CK-MB、LDH和cTnI、cTnT水平，降低LVPWD、E／E′IVS，升高EF%，降低炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β水平，下調NLRP3、cleaved caspase-1蛋白表達，發(fā)揮對CVB3病毒性心肌炎小鼠的保護作用。