探頭式共聚焦激光顯微內(nèi)鏡在微創(chuàng)保膽手術(shù)中的應(yīng)用*

湯泊夫，賈語婧，劉 琳，王秋紅，韓唯杰，常志恒，黨 彤

(內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院內(nèi)蒙古消化病研究所，內(nèi)蒙古包頭 014030)

膽囊結(jié)石、膽囊息肉是臨床常見的膽囊病變，近年來發(fā)病率逐年升高。全球成年人膽囊結(jié)石患病率達(dá)10.0 %～20.0 %[1]，膽囊息肉患病率也在0.3 %～12.3 %[2]。近年來，腹腔鏡膽囊切除術(shù)，逐漸成為治療膽囊良性病變的“金標(biāo)準(zhǔn)”。但是膽囊切除后的并發(fā)癥，包括血管損傷、膽道損傷、患右半結(jié)腸癌風(fēng)險(xiǎn)增加、膽囊切除術(shù)后綜合征(胃-十二指腸返流、長期腹瀉、脂肪瀉等)卻長期得不到應(yīng)有的重視[3-5]。1985年，Akiyama等[6]首次報(bào)道保膽取石手術(shù)，最大限度保留膽囊功能，防止上述并發(fā)癥出現(xiàn)。隨著膽道鏡技術(shù)不斷成熟，出現(xiàn)了內(nèi)鏡微創(chuàng)保膽手術(shù)(choledochoscopic gallbladder-preserving surgery，CGPS)治療膽囊良性疾病[7]。因CGPS術(shù)前診斷依靠超聲、CT、MRI等影像學(xué)結(jié)果，無法對(duì)膽囊黏膜進(jìn)行直觀的檢查，有漏診膽囊癌前病變甚至膽囊癌的可能，越微小、越早期的病變越容易被漏診[8]；且CGPS無法獲得術(shù)后膽囊大體標(biāo)本，術(shù)中冰凍切片等待時(shí)間較長，延長手術(shù)時(shí)間，增加手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)，取材部位局限，還可能出現(xiàn)漏診。

探頭式共聚焦激光顯微內(nèi)鏡(probe-based confocal laser endomicroscopy,pCLE)，是一種新型內(nèi)鏡，可通過多種內(nèi)窺鏡鉗道，具備即時(shí)的虛擬組織學(xué)成像與檢測功能,獲得放大500～1 000倍的內(nèi)鏡圖像,可以實(shí)時(shí)進(jìn)行黏膜的細(xì)胞層面掃查,有助于進(jìn)行靶向活檢,可顯著提高消化系統(tǒng)腫瘤發(fā)現(xiàn)率,被譽(yù)為“光活檢”或“光學(xué)切片”[9]。pCLE在診斷消化系統(tǒng)疾病方面已有較多研究，尤其在病變良惡性鑒別、微小病變診斷方面有很高的準(zhǔn)確性，具有準(zhǔn)確、快速、實(shí)時(shí)的特點(diǎn)。pCLE在膽囊疾病方面的應(yīng)用鮮有報(bào)道，且尚無保膽手術(shù)中應(yīng)用pCLE的相關(guān)研究報(bào)道。本研究在CGPS術(shù)中應(yīng)用pCLE進(jìn)行全膽囊黏膜掃查，無創(chuàng)替代傳統(tǒng)游離膽囊病理，結(jié)合術(shù)前影像學(xué)診斷、術(shù)后病理診斷與術(shù)中pCLE診斷對(duì)照，分析pCLE在膽囊疾病診斷方面的準(zhǔn)確率，評(píng)估pCLE在CGPS中的應(yīng)用價(jià)值；結(jié)合病理診斷結(jié)果，歸納不同膽囊疾病中pCLE下膽囊黏膜特點(diǎn)，初步建立pCLE膽囊疾病圖譜，充實(shí)CGPS評(píng)估指標(biāo)，完善CGPS標(biāo)準(zhǔn)。

1 對(duì)象與方法

1.1對(duì)象 選取2019年9月-2020年7月28例擬行CGPS+pCLE膽囊檢查患者。患者中男性7例，女性21例；年齡26～71歲，平均51.75歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡18～80歲；(2)術(shù)前腹部彩超、MRI、CT等檢查診斷膽囊結(jié)石或膽囊良性息肉；(3)同意行CGPS+pCLE；(4)熒光素鈉過敏實(shí)驗(yàn)陰性；(5)無膽囊急性水腫;(6)膽囊壁厚度<4 mm;(7)膽囊收縮功能大于正常水平的30.0 %。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)膽囊萎縮或瓷性膽囊;(2)懷疑膽囊惡性腫瘤;(3)膽道梗阻;(4)凝血功能嚴(yán)重異常；(5)精神疾病不能配合手術(shù)?；颊呔炇鹬橥鈺?，本研究獲包頭醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2方法

1.2.1pCLE診斷標(biāo)準(zhǔn) 目前尚無膽囊黏膜相關(guān)pCLE診斷標(biāo)準(zhǔn)，故參照pCLE相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)[10]及膽囊黏膜組織學(xué)特征，定義了pCLE下不同膽囊狀態(tài)的診斷標(biāo)準(zhǔn)。具體標(biāo)準(zhǔn)為：(1)正常膽囊黏膜：由單層高柱狀上皮細(xì)胞、少量基底細(xì)胞及特征性的鉛筆樣細(xì)胞組成，無杯狀細(xì)胞、黑色素細(xì)胞，僅膽囊頸部存在真腺體；(2)慢性膽囊炎：可見幽門腺化生及增多的阿-羅氏竇；(3)固醇性息肉：可見大量泡沫樣巨噬細(xì)胞；(4)腺瘤性腺瘤：可見不規(guī)則或絨毛狀腺體結(jié)構(gòu)，上皮不規(guī)則增厚；(5)腺癌：絨毛狀結(jié)構(gòu)紊亂或喪失、細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則、細(xì)胞邊界模糊和不規(guī)則血管擴(kuò)張。參考pCLE相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)[10]，選擇微血管直徑(microvessel diameter，MVD)、微血管走行(microvessel run，MVR)、細(xì)胞直徑(cell diameter,CD)、細(xì)胞形態(tài)(cell morphology，CM)、細(xì)胞間距(cells spacing，CS)、腺體形態(tài)(gland morphology，GM)等6個(gè)指標(biāo)，比較各指標(biāo)在不同狀態(tài)下膽囊黏膜的差異性，評(píng)估各指標(biāo)在診斷各類膽囊疾病中的意義，量化pCLE在膽囊疾病中的診斷標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.2操作過程 (1)術(shù)前評(píng)估：患者具備行全身麻醉下CGPS的條件，熒光素鈉過敏實(shí)驗(yàn)陰性(2.0 %，1 mL靜脈注射，觀察30 min，無心慌、氣促、呼吸困難、皮疹等)。(2)手術(shù)過程：在包頭醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院手術(shù)室進(jìn)行，手術(shù)團(tuán)隊(duì)包括3名外科醫(yī)師及1名pCLE醫(yī)師。術(shù)中使用腹腔鏡、膽道鏡及pCLE?；颊呷檠雠P位，采用閉合CO2氣腹技術(shù)，建立10 mm臍孔置入腹腔鏡，腹腔壓力維持在10～12 mmHg。劍突下、右上腹放置2個(gè)Trocar，以引入手術(shù)器械。根據(jù)結(jié)石大小在膽囊體部做一切口，吸引器吸出膽汁，膽囊腔內(nèi)置入可彎曲式膽道鏡，用5.0 %葡萄糖水沖洗膽囊腔，清洗附著在膽囊壁上的膽汁及黏液、充盈膽囊腔。膽囊結(jié)石通過取石網(wǎng)籃取出或用抽吸法取出。(3)pCLE檢查：結(jié)石取凈后，靜脈注射熒光素鈉(10.0 %,2 mL,Alcon Laboratories,Inc.)30 s后，從膽道鏡孔道中置入pCLE(Cholangioflex, Mauna Kea Technologies,法國)探查膽囊黏膜，可彎曲式膽道鏡輔助pCLE移動(dòng)。(4)進(jìn)一步治療：根據(jù)pCLE檢查結(jié)果，正常膽囊用活檢鉗(Radial JawTM 4,波士頓科學(xué)，美國)在經(jīng)典部位取材送活檢，膽囊良性息肉用熱活檢鉗行電切除，腫瘤性病變或癌前病變行膽囊切除術(shù)，所有標(biāo)本送病理科行組織學(xué)檢查。用3-0可吸收線縫合膽囊體部切口，觀察無活動(dòng)出血、無膽汁漏出后關(guān)腹。(5)術(shù)后處理：術(shù)后觀察24 h，患者無出血、穿孔等并發(fā)癥，術(shù)后24 h進(jìn)食，術(shù)后72 h出院。術(shù)后3個(gè)月隨訪肝功能、腹部超聲等檢查。

2 結(jié)果

2.1pCLE診斷與病理結(jié)果 納入的28例患者中，共獲得29段pCLE檢查錄像，根據(jù)pCLE圖像獲得29個(gè)pCLE診斷；送檢標(biāo)本29例，獲得29個(gè)術(shù)后病理診斷結(jié)果。其中，19例患者術(shù)中pCLE膽囊掃查診斷為正常膽囊黏膜，術(shù)后病理結(jié)果與pCLE一致；1例術(shù)中發(fā)現(xiàn)小網(wǎng)膜隆起，術(shù)中pCLE檢查考慮惡性腫瘤，行膽囊切除+小網(wǎng)膜隆起切除術(shù)，術(shù)后膽囊病理未見異常，小網(wǎng)膜隆起病理結(jié)果考慮血管源性腫瘤；8例術(shù)中發(fā)現(xiàn)膽囊息肉樣病變，術(shù)中pCLE考慮膽固醇性息肉5例(行息肉電切術(shù))，腺瘤性息肉2例、惡性腫瘤1例(3例行膽囊切除術(shù))；術(shù)后病理顯示膽固醇性息肉5例，腺上皮低級(jí)別瘤變2例，中分化腺癌1例。本次研究中，術(shù)中pCLE與術(shù)后病理結(jié)果對(duì)照，準(zhǔn)確率達(dá)100 %。見表1。

2.2不同膽囊狀態(tài)下pCLE特點(diǎn)

2.2.1正常膽囊黏膜 pCLE下為高亮的背景和直徑為5～10 μm的黑色細(xì)胞，細(xì)胞間可見直徑約10 μm的微血管，局部可見約50 μm×120 μm的腺體樣結(jié)構(gòu)，中央黑色，邊緣為高亮的刷狀緣，排列整齊。

表1 患者術(shù)前、術(shù)中、術(shù)后診斷情況表

其中，膽囊底黏膜背景透亮，細(xì)胞排列稀疏，可見袢狀微血管；膽囊體可見大量灰色背景細(xì)胞，直徑5～10 μm線性微血管；膽囊頸可見較多橢圓形腺體，邊緣可見大量柱狀腺細(xì)胞之間少量鉛筆樣細(xì)胞，呈刷狀緣排列。部分病例可見少量約25 μm×40 μm的類似腺體結(jié)構(gòu)，結(jié)合術(shù)后病理，考慮為阿-羅氏竇。

2.2.2膽固醇性息肉 pCLE下呈緊密排列的黑色圓形細(xì)胞，細(xì)胞邊緣清晰，排列整齊，密度尚均勻，直徑約20 μm，周圍黏膜缺乏血供，息肉基底部為正常膽囊背景細(xì)胞。

2.2.3腺瘤性息肉 pCLE下可見明顯增大的腺體，邊緣為整齊、拉長的腺細(xì)胞，細(xì)胞界限清晰，腺體排列較正常腺體緊密。與正常腺體不同的是，腺瘤性息肉腺體由許多黑白相間的腺細(xì)胞組成，直徑約40 μm。腺體之間可見直徑約20 μm的線性微血管。

2.2.4血管源性腫瘤 pCLE下呈大量大小不一、排列紊亂的黑色細(xì)胞，細(xì)胞直徑20～40 μm，間隙中可見大量5～10 μm的微血管袢。因?yàn)榇瞬∽兪窃谛【W(wǎng)膜發(fā)現(xiàn)的，病變周圍可見大量透亮背景下排列整齊、大小不等的四邊形黑色脂肪細(xì)胞。

2.2.5腺癌 pCLE下呈團(tuán)塊狀，細(xì)胞極向紊亂，大小不等，形狀不規(guī)則，細(xì)胞邊界模糊，腺體極度不規(guī)則，局部腺體消失，腺體之間可見直徑>40 μm、走行扭曲的微血管。

2.3各形態(tài)指標(biāo)在pCLE診斷不同膽囊疾病中的意義 與正常膽囊黏膜相比，本研究預(yù)先建立的MVD、MVR、CD、CM、CS、GM等6個(gè)指標(biāo)中，膽固醇性息肉在CD上有區(qū)別，腺瘤性息肉在MVD、CD、GM方面有區(qū)別，腺癌在MVD、MVR、CD、CM、GM上差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而CS在膽囊正常黏膜與各種疾病之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2、表3。

表2 不同膽囊疾病黏膜pCLE形態(tài)特點(diǎn)

表3 不同膽囊疾病黏膜pCLE下MVD、CD、CS值與正常膽囊黏膜差異性比較[P,95 %CI]

3 討論

大量研究表明，共聚焦激光顯微內(nèi)鏡(confocal laser endomicroscopy，CLE)在消化系統(tǒng)疾病診斷和應(yīng)用方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢，可獲得與病理準(zhǔn)確性相當(dāng)?shù)脑\斷結(jié)果[11]，尤其在早期疾病診斷、判斷病變良惡性、或癥狀較輕時(shí)微小結(jié)構(gòu)的改變有著不可替代的優(yōu)勢[12-13]。CLE可大大提高靶向活檢的效率，更大程度保持病變完整，有利于后續(xù)治療[14]。在膽胰疾病診斷方面，CLE因其“活體病理”的優(yōu)勢可在無創(chuàng)傷的前提下獲得更多病理信息，配合現(xiàn)有的內(nèi)鏡診斷技術(shù)，診斷準(zhǔn)確率及操作時(shí)間均優(yōu)于細(xì)胞學(xué)檢查。一項(xiàng)薈萃分析[15]指出，CLE診斷胰腺漿液性囊腺瘤的準(zhǔn)確率高達(dá)88.6 %，敏感性和特異性分別為82.4 %和96.6 %，對(duì)比單純超聲內(nèi)鏡下細(xì)針穿刺，CLE更準(zhǔn)確(OR=3.94,95 %CI=1.58-9.82;P=0.003)，且平均操作時(shí)間僅6.094 min，可快速、高效、準(zhǔn)確地診斷胰腺囊性疾病。

在CGPS中，對(duì)于膽囊潛在惡變風(fēng)險(xiǎn)或“意外膽囊癌”等情況[16]無法作出可靠的判斷和及時(shí)的應(yīng)對(duì)。pCLE通過可彎曲式膽道鏡的輔助迅速對(duì)全膽囊黏膜進(jìn)行掃查，實(shí)現(xiàn)術(shù)中“活體病理”診斷。本研究中共有28例擬行CGPS患者，通過術(shù)中pCLE檢查，有14.3 %(4/28)的患者術(shù)中改變手術(shù)方案，行腹腔鏡下膽囊切除術(shù)。術(shù)后病理結(jié)果也證實(shí)了pCLE的準(zhǔn)確性(100 %，28/28)。所有pCLE檢查均在15 min內(nèi)完成，體現(xiàn)出pCLE的高效性。pCLE具備實(shí)時(shí)、無創(chuàng)、準(zhǔn)確、快速、高效等特點(diǎn)，是對(duì)CGPS術(shù)中診斷很好的補(bǔ)充。

結(jié)石復(fù)發(fā)是目前CGPS術(shù)后主要并發(fā)癥之一[17]。CGPS術(shù)前診斷依賴超聲、CT、MRI等影像學(xué)結(jié)果，有漏診癌前病變甚至癌的可能，越微小、越早期的病變越容易被漏診。有研究認(rèn)為CGPS術(shù)后膽囊是膽囊癌的危險(xiǎn)因素之一[8]。本研究中，pCLE在膽囊頸部發(fā)現(xiàn)阿-羅氏竇結(jié)構(gòu)。阿羅氏竇的增多是慢性膽囊炎癥的重要表現(xiàn)之一。膽囊慢性炎癥的程度與周期是膽囊癌、膽囊結(jié)石形成的因素之一[8,17]。通過pCLE對(duì)阿-羅氏竇的觀察與分析，或許能為CGPS術(shù)后膽囊結(jié)石復(fù)發(fā)、膽囊癌發(fā)生等的相關(guān)因素提供新的依據(jù)。

本研究初步對(duì)膽囊正常黏膜、膽固醇性息肉、腺瘤性息肉及腺癌的pCLE表現(xiàn)作出了特征性描述，通過對(duì)比各微觀指標(biāo)差異性，發(fā)現(xiàn)微血管直徑、微血管走行、細(xì)胞直徑、細(xì)胞形態(tài)、腺體形態(tài)等5個(gè)指標(biāo)可能會(huì)成為pCLE診斷膽囊疾病標(biāo)準(zhǔn)的指標(biāo)。由于本研究總體樣本量不大，其中膽囊腺瘤性息肉、腺癌樣本量較小，需要以后大樣本量研究的進(jìn)一步支持與驗(yàn)證。

綜上所述，本研究利用pCLE作為CGPS術(shù)中診斷，說明其具有實(shí)時(shí)、無創(chuàng)、準(zhǔn)確、快速、高效的特點(diǎn)，在臨床應(yīng)用中具有很大的潛力和廣闊的前景。