扎沖十三味丸干預血管內皮細胞損傷炎性反應相關因素探討*

林 琳,張東威,塔 娜,劉 鑫,劉月英,白夢蕾,孫天洋，陶 春

(1.內蒙古民族大學醫(yī)學院,內蒙古通遼 028000；2.內蒙古民族大學附屬醫(yī)院；3.包頭醫(yī)學院)

蒙成藥扎沖十三味丸(又名嘎迪-13味丸)，由制草烏、訶子、麝香、禹糧土、制珊瑚、制珍珠、木香、石菖蒲、沉香、甘草、丁香、煅磁石、肉豆蔻13味單藥組成，蒙醫(yī)臨床一直用于治療半身不遂，神經麻痹，風濕，關節(jié)疼痛等疾病，療效滿意[1]，已收錄入《中華人民共和國藥典》[2]。木香和沉香的主要的化學成分均有木香內酯，木香內酯具有極強的抗炎鎮(zhèn)痛效果。丁香在蒙醫(yī)臨床治療心血管疾病中，也被認為具有抗炎、抗氧化作用[3]。本實驗制備改良大鼠腹主動脈縮窄模型，通過血流動力學改變造成實驗大鼠血管內皮損傷，應用扎沖十三味丸干預，探討該藥對血管內皮細胞損傷所致炎癥反應干預作用的相關因素。

1 材料與方法

1.1實驗動物 選用8周Sprague-Dawley(SD)健康大鼠100只，雄性，體重180～210 g，購于長春市億斯實驗動物技術有限責任公司(SPF級，動物編號：SCXK(吉)-2018-0007)，于內蒙古民族大學醫(yī)學院動物實驗室(清潔級)適應性飼養(yǎng)一周，標準大鼠飼料飼養(yǎng)，自由攝食飲水，溫度23～25 ℃，濕度55 %～70 %。術前12 h禁食。

1.2試劑與儀器 扎沖十三味丸由內蒙古民族大學附屬醫(yī)院蒙藥制劑室提供(批準文號：內藥制字M14060747)，Elisa試劑盒購自武漢華聯科生物技術有限公司。酶標儀為芬蘭Labsystems Multiskan MS公司產品，儀器型號為352型。透射電子顯微鏡為日本日立綜合跨國公司(hitachi)生產，儀器型號HT7700。

1.3方法

1.3.1分組 首先將100只SD大鼠隨機選出25只為假手術組，只暴露腹主動脈，不做其他手術；其余75只進行改良腹主動脈縮窄模型手術；將手術后的實驗大鼠隨機分為模型組、扎沖十三味丸組、曲美他嗪組，每組25只，自由飲水攝食。

1.3.2給藥 藥量參考《藥理實驗方法學》計算方法。扎沖十三味丸以蒸餾水配制成2 %濃度，灌胃給藥，每日一次，每次1.2 mL；模型組給予生理鹽水灌胃；假手術組在同一環(huán)境下飼養(yǎng)不予灌胃。西藥鹽酸曲美他嗪用于心血管疾病的治療，具有改善心肌細胞缺氧和血管內皮細胞功能作用[4]，本實驗作為實驗比對組。曲美他嗪按成人口服劑量6.3倍，用雙蒸水稀釋后灌胃。

1.3.3模型建立 建立改良腹主動脈縮窄模型。實驗大鼠10 %水合氯醛(0.35 mL/100 mg)腹腔注射麻醉，大鼠右側臥位固定于操作臺上，腹左側肋弓下緣脊柱前備皮，常規(guī)消毒，在肋脊角下縱型切開皮膚1～2 cm，鈍性分離筋膜及肌肉，暴露左腎及其上方的腹主動脈，分離出腹主動脈，用4號縫合線從腹主動脈下方穿過備用，將磨鈍的0.7 mm注射針頭平行至于腹主動脈外側，將針頭與腹主動脈一起捆綁后，迅速小心拔出針頭，造成腹主動脈部分狹窄，縫合后常規(guī)消毒，大鼠保溫復蘇至清醒，自由飲食飲水。扎沖十三味丸組在手術第二天開始給扎沖十三味丸組灌配置好的扎沖十三味丸藥液、模型組灌生理鹽水、曲美他嗪比對組灌配置好的曲美他嗪藥液。共建模28天。

1.3.4標本的采集與檢測 于造模28 d腹主動脈取血(麻醉同上)，剪下帶有結扎線段的腹主動脈2～3cm。將腹主動脈做相應的染色觀察，方法嚴格按照說明書進行；采用Western-blot法檢測血管組織中IL-6、TNF-α蛋白的表達；Elisa法檢測實驗大鼠血清中IL-6、TNF-α含量及血漿中血管內皮因子NO、ET-1的含量。

2 結果

2.1通過Masson染色法觀察扎沖十三味丸對大鼠血管組織纖維化程度 Masson染色法觀察血管組織，膠原纖維呈藍色，肌纖維呈紅色。假手術組膠原纖維、肌纖維厚薄均勻排列正常；模型組藍染膠原纖維增多，提示有膠原纖維化；扎沖十三味丸組血管組織藍染面積與模型組相比減少；曲美他嗪比對組血管組織藍染面積與扎沖十三味丸組藍染面積相似，與模型組相比藍染面積減少。通過Image J軟件計算膠原容積分數，分析血管組織纖維化程度。假手術組膠原容積分數為7.318 %；模型組膠原容積分數高于假手術組；扎沖十三味丸組與曲美他嗪組膠原容積分數差距不大但小于模型組大于假手術組。

通過對實驗大鼠血管壁組織進行Masson染色，結果顯示見模型組較假手術組實驗大鼠血管壁組織的藍染膠原纖維增多，膠原容積分數增高，提示有膠原纖維化。

圖1 大鼠血管組織Masson染色圖

圖2 各組大鼠Masson染色膠原容積分數

2.2HE染色觀察扎沖十三味丸對實驗大鼠血管內皮細胞炎性損傷的干預 通過HE染色法，觀察血管組織炎性細胞浸潤情況：假手術組實驗大鼠的血管內皮細胞的排列和形態(tài)均正常、無炎性細胞浸潤；模型組實驗大鼠的血管組織中局部管壁結構不清，可見較多炎性細胞、多核巨細胞、中性粒細胞浸潤；扎沖十三味丸組實驗大鼠的血管組織局部管壁可見少量炎性細胞浸潤，較模型組炎性細胞浸潤數量減少；曲美他嗪組實驗大鼠血管組織有炎性細胞浸潤與扎沖十三味丸組相似，較模型組炎性細胞浸潤數量減少。

2.3通過透射電鏡觀察 透射電子顯微鏡下觀察血管超微結構的變化，可見各組血管平滑肌均存在不同程度損傷。假手術組血管平滑肌細胞有較輕微的損傷，線粒體數量較少，輕度腫脹，線粒體嵴模糊，粗面內質網未見明顯擴張；模型組血管平滑肌細胞損傷較為嚴重，膜內脂滴較多，細胞器空泡變；扎沖十三味丸組血管平滑肌細胞損傷較模型組輕，線粒體數量較少，輕度腫脹；曲美他嗪組平滑肌細胞損傷較模型組重較扎沖十三味丸組輕，內質網可見明顯擴張。

圖3 大鼠血管組織HE染色

圖4 大鼠透射電鏡圖×60K

2.4通過 ELISA法觀察扎沖十三味丸對大鼠血管內皮功能的影響 通過 ELISA法檢測實驗大鼠血清中IL-6和TNF-α的含量。與假手術組相比較，模型組中IL-6和TNF-α的含量增加，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；扎沖十三味丸組、曲美他嗪組IL-6和TNF-α的含量增加，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與模型組相比較，扎沖十三味丸組、曲美他嗪組IL-6和TNF-α的含量降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

通過ELISA法檢測實驗大鼠血漿NO和ET-1含量，觀察血管的舒張收縮狀態(tài)。與假手術組相比，模型組中NO和ET-1的含量均顯著增加(P<0.05)；扎沖十三味丸組較模型組NO和ET-1的含量降低，差異顯著(P<0.05)；曲美他嗪組較模型組NO和ET-1的含量降低，差異顯著(P<0.05)；曲美他嗪組較扎沖十三味丸組差異不明顯(P>0.05)。

表1 各組大鼠血清IL-6、TNF-α含量比較

表2 各組大鼠血漿中NO、ET-1含量比較

2.5計算各組大鼠血漿中NO/ET-1比值 內皮細胞依賴性血管舒張收縮功能ET-1/NO系統(tǒng)，是評價內皮功能的重要標準。模型組NO和ET-1含量較假手術組均增高，且NO/ET-1比值(1.025)高于假手術組(0.628)；扎沖十三味丸組NO和ET-1含量均高于假手術組而低于模型組，NO/ET-1比值(1.001)。扎沖十三味丸可以降低血漿中NO和ET-1含量，對模型組血管的緊張度無改變影響；曲美他嗪組，NO/ET-1比值下降，為0.704，較模型組小，較假手術組高，較扎沖十三味丸組小。見表3、圖5。

表3 各組大鼠血漿中NO/ET-1比值比較

圖5 各組大鼠血漿中NO/ET-1比值比較

2.6通過免疫印跡法觀察 通過免疫印跡法檢測實驗大鼠血管組織中IL-6和TNF-α蛋白的表達。大鼠血管組織中IL-6蛋白表達：模型組較假手術組表達顯著增加(P<0.05)；扎沖十三味丸組、曲美他嗪比對組較模型組表達顯著降低(P<0.05)。大鼠血管組織中TNF-α蛋白表達：模型組較假手術組表達顯著增加(P<0.05)；扎沖十三味丸組、曲美他嗪組較模型組表達顯著降低(P<0.05)。見圖6、表4。

圖6 大鼠血管組織中IL-6和TNF-α蛋白的表達

表4 大鼠血管組織中IL-6和TNF-α蛋白的表達

3 討論

血管縮窄，血流動力學會發(fā)生改變，致使血管內皮細胞損傷引起炎性反應的發(fā)生，炎性細胞因子TNF-α不但促使炎性細胞聚集和炎癥介質的釋放及誘導炎性細胞因子IL-6的分泌，也可影響內皮舒張因子NO的合成和生物利用率，導致血管內皮細胞功能紊亂，血管內皮細胞損傷和血栓的形成等一系列病理生理過程[5]。IL-6由單核細胞分泌，在炎癥反應中，使血管通透性增加及血管內皮細胞損傷加重并破壞其完整性和使其功能障礙。內皮細胞依賴性血管舒張功能NO/ET-1系統(tǒng)失衡，將引發(fā)血管內皮機能失衡，由此造成諸如血栓、斑塊的產生等[6]。

本實驗應用改良腹主動脈縮窄模型，通過血流動力學改變致實驗大鼠血管內皮細胞損傷，而后給予相應的藥物干預。結果顯示，扎沖十三味丸干預血管內皮細胞損傷炎性反應，使管壁組織中炎性細胞減少，線粒體腫脹減輕，粗面內質網擴張程度減少，此作用與改善血管組織纖維化程度、降低血管組織中IL-6和TNF-α蛋白的表達、減少血清中炎性細胞因子IL-6和TNF-α的含量因素相關，且優(yōu)于西藥曲美他嗪，而與內皮細胞依賴性血管舒張功能NO/ET-1系統(tǒng)平衡無關。西藥曲美他嗪有調節(jié)內皮細胞依賴性血管舒張功能NO/ET-1系統(tǒng)平衡的作用。

蒙成藥扎沖十三味丸對心腦血管和神經系統(tǒng)疾病都有一定的療效，但其在其他疾病治療中的應用仍不明確。扎沖十三味丸具有舒筋活血、鎮(zhèn)靜止痛、擴張微血管、抑制血小板凝集、保護血管內皮細胞等作用，其作用機制尚有待進一步從臨床、病理和分子角度進行深入研究，從而不斷拓展其臨床適應證，為人類健康服務。