ABCB1、CYP2C19、CES1基因多態(tài)性與缺血性腦卒中患者氯吡格雷抵抗及療效的關(guān)系

劉亞巍 趙小朗 姚璞 程林 孫鳳軍 曹秋婷

氯吡格雷是目前世界范圍內(nèi)使用最廣泛的噻吩并吡啶類抗血小板藥，主要用于急性缺血性腦卒中等循環(huán)障礙疾病的二級預(yù)防。氯吡格雷是一種前體藥物，其在小腸的吸收受到編碼P-糖蛋白的三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體超家族B1(ATP binding cassette transporter B1，ABCB1)基因的調(diào)控，進(jìn)入肝臟后約85%經(jīng)羧酸酯酶1(carboxylesterase 1，CES1)調(diào)控代謝轉(zhuǎn)化為無活性代謝產(chǎn)物排出體外，僅15%在細(xì)胞色素P450(cytochrome P450，CYP450)酶系作用下分兩步代謝轉(zhuǎn)化為活性代謝產(chǎn)物發(fā)揮抗血小板作用。相關(guān)研究表明亞洲人群中約20%～65%的患者在接受常規(guī)劑量的氯吡格雷治療后不能達(dá)到抑制血小板聚集的作用，從而導(dǎo)致心腦血管不良事件的發(fā)生，這一現(xiàn)象被稱為氯吡格雷抵抗(clopidogrel resistance，CR)[1]。CR確切的發(fā)生機(jī)制目前仍不十分清楚，已有文獻(xiàn)報(bào)道CR的影響因素眾多，包括年齡、煙酒史、高血壓、糖尿病、藥物間相互作用、用藥依從性、基因多態(tài)性等，其中與藥物代謝相關(guān)的基因多態(tài)性與CR發(fā)生的相關(guān)性研究受到越來越多關(guān)注。

根據(jù)2010年美國FDA黑框警告及相關(guān)指南[2]推薦，若CYP450酶系中的CYP2C19 基因突變?yōu)楣δ苋毕菪?lose-of-function，LOF)時(shí)需加大劑量或者換用藥物進(jìn)行治療，不同代謝表型及基因型的個(gè)體應(yīng)采用不同的用藥方案。隨著臨床應(yīng)用氯吡格雷越來越廣泛，基因多態(tài)性與CR及臨床終點(diǎn)事件的關(guān)系日漸成為研究熱點(diǎn)。本研究旨在探討與氯吡格雷體內(nèi)代謝密切相關(guān)的ABCB1、CYP2C19、CES1基因多態(tài)性與缺血性腦卒中患者發(fā)生CR及其預(yù)后的關(guān)系。

1 對象和方法

1.1 研究對象選擇2016年10月至2017年12月期間確診的缺血性腦卒中并服用氯吡格雷治療的患者90例，其中男68例(75.6%)、女22例(24.4%)，年齡42～75歲，平均(62.8±9.5)歲，BMI值17.3～31.8，平均24.17±3.2。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡18～75歲，符合全國第四屆腦血管學(xué)術(shù)會(huì)議通過制定的腦卒中患者診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]，并經(jīng)腦部CT檢查明確診斷為缺血性腦卒中的患者；(2)有能力依從研究方案；(3)無其他嚴(yán)重疾?。?4)所有研究方案均經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)，且受試者自愿參加研究并簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)對氯吡格雷過敏或不能耐受者；(2)半年內(nèi)有內(nèi)臟出血性疾病病史者；(3)嚴(yán)重肝臟疾患和(或)凝血功能異常者、具有抗血小板治療禁忌證或近期擬行外科手術(shù)者；(4)患瓣膜病、心肌病、心肌炎、先心病、周圍血管病、感染性心內(nèi)膜炎者；(5)晚期腎功能不全、腫瘤及慢性心力衰竭等嚴(yán)重影響近期預(yù)后的疾病者。

1.2 儀器與試劑流式細(xì)胞儀(美國Becton-Dickinson公司)；全自動(dòng)核酸提取儀〔珀金埃爾默企業(yè)管理(上海)有限公司〕；Nanodrop全波長分光光度計(jì)(美國賽默飛世爾科技公司)；TDZ4-WS臺(tái)式低速離心機(jī)(湘儀離心機(jī)儀器有限公司)；焦磷酸測序由凱杰生物技術(shù)(上海)有限公司完成。多甲藻素-葉綠素蛋白標(biāo)記的抗血小板GPⅢa的單克隆抗體(CD61PerCP；美國Becton-Dickinson公司)；1%(體積分?jǐn)?shù))多聚甲醛(PFA；美國Sigma公司)；0.2 mmol/L的二磷酸腺苷(ADP；美國Biopool公司)；PCR buffer、Taq酶、dNTP、5×Q-Solution〔(凱杰生物技術(shù)(上海)有限公司〕；PCR擴(kuò)增儀(Bio-Rad公司)；核酸提取試劑盒(適用于200 μL人全血樣本；上海浩源生物有限公司)；引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.3 方法

1.3.1實(shí)驗(yàn)方案與血樣采集：患者在接受至少3 d的雙重抗血小板治療(氯吡格雷75 mg/d，阿司匹林100 mg/d)后進(jìn)行血小板聚集率測定。

由專業(yè)的護(hù)士分別抽取氯吡格雷給藥前及給藥后4 h的靜脈血4 mL，棄去前2 mL，后2 mL加入到枸櫞酸鈉抗凝管中充分混勻，將混勻的抗凝管以500 r/min(相對離心力×35 g)離心3 min，取上清液，得到富含血小板血漿(platelet rich plasma，PRP)，為避免血小板體外活化，標(biāo)本采集后2 h內(nèi)完成血小板聚集率的測定。使用正常未活化的樣品作為質(zhì)量控制以檢測和控制血小板的活化狀態(tài)。

目前對于CR尚無公認(rèn)的一致性標(biāo)準(zhǔn)。不同研究采用的定義大都是經(jīng)驗(yàn)性的[4-5]。本研究中，用ADP(20 μmol/L)誘導(dǎo)血小板聚集，給予氯吡格雷后的聚集率與未服用藥物的聚集率基線值比較，該聚集率差值作為血小板抑制率。將血小板抑制率小于30%，定義為氯吡格雷反應(yīng)不全；血小板抑制率≥30%，定義為氯吡格雷反應(yīng)良好。

流式細(xì)胞術(shù)測定血小板聚集率：分別取未加ADP活化及加20 μmol/L ADP活化的PRP標(biāo)本5 μL，加入10 μL CD61PerCP輕輕混勻，常溫避光染色15 min后加入1 mL冷(2～8℃)固定液以1%(體積分?jǐn)?shù))PFA充分混勻，置4℃下固定30 min，之后采用流式細(xì)胞術(shù)檢測血小板聚集率。以未加ADP標(biāo)本為血小板零聚集對照，ADP活化標(biāo)本中單個(gè)血小板數(shù)量減少顯示血小板聚集率大小。

1.3.2CES1、ABCB1、CYP2C19基因型測定：(1)全血基因組DNA提?。撼槿§o脈血2 mL，置EDTA抗凝管中充分混勻，于-20℃保存。取200 μL EDTA抗凝血，按全血DNA提取試劑盒的操作方法進(jìn)行基因組DNA的提取，采用Nanodrop全波長分光光度計(jì)測定DNA濃度后稀釋制成濃度50 ng/μL的DNA模板，DNA模板置于-20℃保存。

(2)CES1、ABCB1、CYP2C19基因片段擴(kuò)增：采用PCR方法分別進(jìn)行目的片段擴(kuò)增，目標(biāo)位點(diǎn)包括ABCB1 C3435T、CES1 A816C、CYP2C19*2及CYP2C19*3，引物序列見表1。

表1 各檢測單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的引物序列

PCR總反應(yīng)體積20 μL，包括 10×PCR buffer 2 μL，dNTP mix(包括dATP、dCTP、dGTP、dTTP 等成分，濃度均為1 mmol/L)4 μL，5×Q-Solution 4 μL，上下游引物各 0.2 μmol/L×2 μL，50 ng DNA模板，2.5 U Taq酶，加水補(bǔ)充至20 μL。PCR擴(kuò)增條件：(1)94℃預(yù)變性5 min；(2)94℃變性30 s，60℃復(fù)性30 s，72℃延伸1 min，共計(jì)35個(gè)循環(huán)；(3)72℃延伸10 min；(4)4℃條件下保存。

(3)焦磷酸測序：采用PyroMark Q96 MD型儀器進(jìn)行擴(kuò)增產(chǎn)物焦磷酸測序以獲基因多態(tài)性分型結(jié)果。

1.3.3用藥劑量調(diào)整：根據(jù)《中國急性缺血性腦卒中診治指南2018》[6]推薦，根據(jù)血小板抑制率及基因多態(tài)性結(jié)果調(diào)整患者的用藥劑量。本研究針對血小板抑制率低且攜帶CYP2C19功能缺陷型基因的患者進(jìn)行氯吡格雷的治療劑量調(diào)整。若僅有一個(gè)等位基因發(fā)生突變(LOF1)，建議增加氯吡格雷用量至150 mg/d；若兩個(gè)等位基因均發(fā)生突變(LOF2)，則建議增大用量至300 mg/d，若仍反應(yīng)不良，則建議將氯吡格雷替換為替格瑞洛。

1.3.4隨訪：分別在缺血性腦卒中患者接受治療后的第3、6、12個(gè)月進(jìn)行隨訪，隨訪內(nèi)容包括主要終點(diǎn)事件和次要終點(diǎn)事件。

本研究中主要終點(diǎn)事件包括缺血事件和出血事件。根據(jù)《高危非致殘性缺血性腦血管事件診療指南》[7]，將缺血性事件采用臨床檢查分為兩大類：(1)有癥狀的缺血并發(fā)癥，如氯吡格雷治療期間新出現(xiàn)的短暫性缺血發(fā)作或永久性缺血梗死；(2)臨床無明顯癥狀的急性血栓栓塞現(xiàn)象。出血事件定義為患者接受氯吡格雷治療后CT檢查發(fā)現(xiàn)的顱內(nèi)出血或顱外出血，停止治療后出血狀況消失。

次要終點(diǎn)采用改良Rankin量表(mRS)評估患者接受治療后第3、6、12個(gè)月的臨床表現(xiàn)，本研究采用電話訪問或門診面談的方式，mRS評分≤2認(rèn)定為臨床效果良好，mRS評分>2認(rèn)定為臨床效果不佳。隨訪失訪率>20%則認(rèn)為該隨訪無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料若符合正態(tài)分布，用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本資料t檢驗(yàn)；若不符合正態(tài)分布，用四分位數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)描述，兩組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料用例數(shù)(率)〔n(%)〕表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血小板抑制率氯吡格雷反應(yīng)良好52例，反應(yīng)不全38例。兩組血小板聚集情況及血小板抑制率見表2。

表2 患者氯吡格雷反應(yīng)情況(%)

2.2 基因分型兩組患者一般資料及臨床資料比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具體見表3。采用單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)基因分型試劑對90例患者的ABCB1、CYP2C19及CES1基因型分型，分型結(jié)果如表4。結(jié)果顯示，反應(yīng)不全組與反應(yīng)良好組的ABCB1 C3435T、CES1 A816C基因型分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；反應(yīng)不全組與反應(yīng)良好組的CYP2C19*2及CYP2C19*3基因型分布比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，結(jié)果見表5。

表3 不同治療反應(yīng)患者一般資料及臨床資料比較

表4 患者CES1、ABCB1、CYP2C19等位基因及基因型的分布

表5 反應(yīng)良好組與反應(yīng)不全組基因型分布比較〔n(%)〕

2.3 隨訪結(jié)果根據(jù)患者臨床表現(xiàn)、血小板抑制率及基因型檢測結(jié)果，本研究針對9例氯吡格雷反應(yīng)不良患者調(diào)整用藥方案，其中5例LOF2患者換用替格瑞洛90 mg/d，4例LOF1患者增加氯吡格雷用量至150 mg/d。調(diào)整治療方案的患者臨床效果良好，血小板抑制率為(30.1±6.8)%。隨訪結(jié)果顯示，隨訪3、6、12個(gè)月時(shí)分別有2例(2.2%)、3例(3.3%)、8例(8.9%)患者由于遷居或更換電話而失訪，失訪率為14.4%(13例)。最終參與統(tǒng)計(jì)的隨訪患者共計(jì)77例，其中有13例(16.9%)患者發(fā)生缺血事件，4例(5.2%)患者發(fā)生出血事件，59例(76.6%)患者的Rankin評分≤2。

結(jié)果顯示，ABCB1 C3435T、CYP2C19*2、CYP2C19*3和CES1 A816C野生型與突變型比較治療后缺血事件、預(yù)后良好情況差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，ABCB1 C3435T、CYP2C19*2和 CYP2C19*3野生型與突變型比較治療后出血事件差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而CES1 A816C野生型與突變型比較治療后出血事件差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，突變型基因更易引起治療后出血事件的發(fā)生(P<0.05)，具體見表6。

表6 基因多態(tài)性與治療后情況比較

3 討論

本研究旨在探討ABCB1、CYP2C19、CES1基因多態(tài)性與缺血性腦卒中患者發(fā)生CR的關(guān)聯(lián)性。

CYP2C19是將無活性的氯吡格雷代謝為活性代謝物的主要代謝酶，其具有多種等位基因突變類型[2]。CYP2C19基因目前共發(fā)現(xiàn)35個(gè)等位基因，CYP2C19*1為野生型等位基因，CYP2C19*2或CYP2C19*3等多種常見于亞洲人群的等位基因突變可降低酶活性甚至引起酶活性喪失，稱為功能缺失型突變。在中國人群中CYP2C19基因突變的類型主要是CYP2C19*2和CYP2C19*3，這兩類等位基因占到了CYP2C19突變的90%～99%，因此本研究中只納入了CYP2C19*2、CYP2C19*3多態(tài)性的檢測，結(jié)果顯示CYP2C19 突變基因頻率為50.0%，與文獻(xiàn)[8]中南方漢族人中的突變頻率(48.45%)相當(dāng)。

目前，有關(guān)ABCB1基因C3435T多態(tài)性的研究較多，但該位點(diǎn)突變與氯吡格雷低反應(yīng)之間的關(guān)聯(lián)性仍存在爭議?，F(xiàn)有資料顯示中國漢族人群中，ABCB1 3435T位點(diǎn)頻率達(dá)35.38%[9]，因此本研究中選擇ABCB1 3435T多態(tài)性進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示ABCB1 3435T頻率為43.9%，大于文獻(xiàn)報(bào)道頻率。

有研究表明CES1酶常見突變位點(diǎn)包括G143E、D260fs和A816C[10]，上述位點(diǎn)突變均引起CES1酶水解活性顯著降低?，F(xiàn)有研究顯示，G143E、D260fs在亞洲人群的突變率為0%，816C在中國人群的突變頻率達(dá)23.8%[11]，因此本研究選擇816C突變位點(diǎn)進(jìn)行研究，結(jié)果顯示本研究中CES1 816C頻率為31.7%，亦大于文獻(xiàn)報(bào)道。綜上，除CYP2C19外，本研究中ABCB1 C3435T及CES1 A816C的突變頻率均比現(xiàn)有研究資料所示結(jié)果高，這可能與患者所處地域以及納入的樣本量有關(guān)。

阿司匹林通過抑制血小板環(huán)氧化酶-1，阻斷花生四烯酸生成血栓烷A2；氯吡格雷通過特異性干擾ADP介導(dǎo)血小板的活化，兩者通過不同的途徑降低血小板的聚集率從而發(fā)揮抗血小板聚集的作用。在一項(xiàng)納入230例缺血性腦卒中患者的臨床研究中，阿司匹林抵抗(asiprin resistance，AR)發(fā)生率為1.2%，CR發(fā)生率為24.8%[12]，CR發(fā)生率遠(yuǎn)高于AR。一項(xiàng)前瞻性臨床體外血小板研究中，與單獨(dú)使用阿司匹林100 mg相比，使用雙抗(氯吡格雷75 mg+阿司匹林100 mg)或單獨(dú)使用氯吡格雷75 mg治療的患者經(jīng)不同ADP濃度誘導(dǎo)的血小板聚集率均顯著降低(P<0.05)，且雙抗與單獨(dú)使用氯吡格雷者抑制程度相似。分別接受不同劑量阿司匹林(100 mg、300 mg)與氯吡格雷(75 mg)聯(lián)合治療7 d，經(jīng)ADP誘導(dǎo)的血小板聚集率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)[13]。綜上所述，AR在缺血性腦卒中人群中發(fā)生率較低，常規(guī)劑量阿司匹林血小板聚集抑制率個(gè)體差異性較小，且阿司匹林不影響經(jīng)ADP誘導(dǎo)途徑的血小板聚集率，因此本研究主要關(guān)注氯吡格雷與經(jīng)ADP誘導(dǎo)的血小板聚集抑制率之間的聯(lián)系。

本研究結(jié)果表明患者出現(xiàn)氯吡格雷反應(yīng)良好與反應(yīng)不全者性別、年齡、BMI、煙酒史、高血壓史、糖尿病史、血脂異常、心肌梗死及是否合并用PPI等情況均差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，與文獻(xiàn)[14]報(bào)道一致。氯吡格雷反應(yīng)良好與反應(yīng)不全者ABCB1 C3435T、CES1 A816C位點(diǎn)的突變患者比例差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而CYP2C19*2和CYP2C19*3位點(diǎn)突變患者比例差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，提示CYP2C19*2和CYP2C19*3位點(diǎn)的突變可能影響藥物的藥代動(dòng)力學(xué)，甚至影響治療效果。本研究中根據(jù)臨床表現(xiàn)、血小板抑制率及基因多態(tài)性調(diào)整了9例患者的臨床治療方案，結(jié)果顯示調(diào)整用藥后患者臨床表現(xiàn)改善。一項(xiàng)多中心研究結(jié)果表明根據(jù)血小板抑制率情況調(diào)整治療方案對臨床終點(diǎn)事件并沒有改善，所以是否采用常規(guī)的CYP2C19基因多態(tài)性或血小板抑制率調(diào)整治療方案仍存在爭議。因此，建議綜合臨床表現(xiàn)、血小板抑制率及CYP2C19基因多態(tài)性情況來指導(dǎo)臨床的個(gè)體化用藥方案。

本研究隨訪12個(gè)月，總失訪率為14.4%。本研究中主要對氯吡格雷治療后的缺血事件及出血事件觀察研究。隨訪結(jié)果顯示ABCB1 C3435T、CYP2C19*2、CYP2C19*3和CES1 A816C位點(diǎn)不同基因型治療后缺血事件、臨床轉(zhuǎn)歸情況差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；ABCB1 C3435T、CYP2C19*2和CYP2C19*3位點(diǎn)不同基因型治療后缺血事件差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而CES1 A816C位點(diǎn)不同基因型治療后缺血事件差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。有研究顯示CES1 A816C通過對非活性代謝物濃度的影響而顯著影響氯吡格雷抗血小板活性[10]，本研究結(jié)果與文獻(xiàn)結(jié)論相一致。

綜上，本研究顯示，氯吡格雷對缺血性腦卒中療效較好。氯吡格雷治療缺血性腦卒中過程中，CYP2C19*2及CYP2C19*3基因型可能對血小板抑制率有影響，CES1 A816C基因可能對臨床出血事件有影響。阿司匹林及氯吡格雷均可影響患者的缺血事件及出血事件，可能與用藥劑量和患者基本情況有關(guān)，在后續(xù)研究中，可對單用這兩種藥物患者的缺血事件及出血事件發(fā)生情況進(jìn)行觀察，以便臨床治療缺血性腦卒中時(shí)更好的選擇血小板抑制藥物。