自身反應(yīng)性CD8+中心記憶性T細(xì)胞對(duì)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎致病作用

楊亭亭 姜紅 向雅娟 何洋 劉噴颶 殷賀 高旭光 劉廣志

多發(fā)性硬化(multiple sclerosis，MS)是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system，CNS)的炎性脫髓鞘疾病[1]，多發(fā)生于中青年，主要表現(xiàn)為肢體運(yùn)動(dòng)、感覺(jué)障礙和視力下降等癥狀。約85%的MS患者以復(fù)發(fā)-緩解的形式發(fā)病，疾病初期恢復(fù)較完全，隨后逐漸出現(xiàn)不可逆的神經(jīng)功能缺損而造成終生重度殘疾。因此，明確MS的早期發(fā)病機(jī)制，盡早采取針對(duì)性治療對(duì)于控制疾病的進(jìn)展至關(guān)重要。

目前認(rèn)為，MS的病因主要與T細(xì)胞所介導(dǎo)的針對(duì)CNS髓鞘的免疫應(yīng)答有關(guān)。以往認(rèn)為CD4+T細(xì)胞(尤其是Ⅰ型輔助性T細(xì)胞，typeⅠ helper T cell，Th1)在MS的發(fā)病機(jī)制中起著關(guān)鍵作用，現(xiàn)今更多研究從遺傳學(xué)、病理學(xué)和免疫學(xué)方面證實(shí)了CD8+T細(xì)胞的重要性[2-5]。據(jù)報(bào)道，將源自MS患者髓鞘抗原〔包括髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白(myelin oligodendrocyte glycoprotein，MOG)35-55和蛋白脂蛋白(proteolipid protein，PLP)〕特異性CD8+T細(xì)胞過(guò)繼轉(zhuǎn)移至人類白細(xì)胞抗原(human leucocyte antigen，HLA)-A2或-A3轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)時(shí)，可誘導(dǎo)出類似于MS的早期病理改變[6-7]，提示自身反應(yīng)性CD8+T細(xì)胞在MS早期發(fā)病中的重要致病效應(yīng)。

以往研究發(fā)現(xiàn)，根據(jù)趨化性細(xì)胞因子受體7(chemokine receptor 7，CCR7)的表達(dá)，可將記憶性T細(xì)胞(包括CD4+T細(xì)胞及CD8+T細(xì)胞)分為中心記憶性T細(xì)胞(central memory T cells，TCM；即CCR7+CD45RA-)、效應(yīng)記憶性T細(xì)胞(effector memory T cells，TEM；即CCR7-CD45RA-)兩個(gè)亞群；對(duì)于CD8+T細(xì)胞尚可進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為終末效應(yīng)記憶性T細(xì)胞(terminal effector memory T cells，Ter TEM；CCR7-CD45RA+)亞群[8]。在生理狀態(tài)下，初始T細(xì)胞接觸抗原或白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-2、IL-7和IL-15等細(xì)胞因子后分化為TCM，在血流、組織結(jié)構(gòu)和淋巴器官之間循環(huán)執(zhí)行免疫監(jiān)視功能，在機(jī)體再次接觸抗原時(shí)于相應(yīng)組織內(nèi)經(jīng)抗原提呈細(xì)胞(antigen-presenting cells，APC)刺激后分化為TEM，參與組織結(jié)構(gòu)(包括CNS)內(nèi)的炎性應(yīng)答[9]。其中CD8+TEM亞群表達(dá)向炎性組織遷移的受體(如CCR5、CXCR3等)，能迅速產(chǎn)生細(xì)胞毒性效應(yīng)，包括穿孔素、顆粒酶-B、干擾素(interferon，IFN)-γ和死亡因子(factor associated suicide，F(xiàn)as)等介導(dǎo)的途徑，但增殖活性較低，最終多數(shù)轉(zhuǎn)化為Ter TEM；而CD8+TCM亞群則表達(dá)歸巢受體(如CD62L)，增殖活性較高，但較TEM細(xì)胞毒性功能的產(chǎn)生速度相對(duì)緩慢。與上述TCM發(fā)現(xiàn)結(jié)果相一致，數(shù)項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)源自同源性TCM(而不是TEM)的抗原特異性CD8+T細(xì)胞克隆在獼猴或小鼠體內(nèi)可長(zhǎng)期存活，能夠重獲記憶性T細(xì)胞的表型和功能特性，并在記憶性T細(xì)胞庫(kù)中占據(jù)優(yōu)勢(shì)[10-12]。這些研究結(jié)果提示，CD8+TCM可能在炎性疾病(如MS)的發(fā)生和維持過(guò)程中較TEM具有更強(qiáng)的免疫活性和存活能力。

作者團(tuán)隊(duì)的前期研究發(fā)現(xiàn)，與健康對(duì)照比較，復(fù)發(fā)-緩解型MS患者外周血CD8+TCM顯著增多，而表達(dá)顆粒酶-B和穿孔素的CD8+TEM則顯著減少且與臨床評(píng)分(Kurtzke量表)呈負(fù)相關(guān)，經(jīng)免疫調(diào)節(jié)治療后CD8+TCM呈減少趨勢(shì)[13-14]，提示自身反應(yīng)性CD8+TCM在MS發(fā)病過(guò)程中，尤其是早期具有重要作用。因此，本研究通過(guò)過(guò)繼轉(zhuǎn)移自身反應(yīng)性CD8+TCM至Rag-1-/-小鼠，觀察對(duì)MOG35-55誘導(dǎo)的EAE早期病情及病理改變的影響程度，以探討該細(xì)胞亞群對(duì)MS的致病效應(yīng)及其作用機(jī)制驗(yàn)證CD8+TCM的致病效應(yīng)，期望可以為臨床MS早期開(kāi)展針對(duì)性治療積累資料。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：6～10周齡、體質(zhì)量17～20 g雌性C57 BL/6(B6)小鼠，由北京維通利華責(zé)任有限公司提供，用于誘導(dǎo)EAE模型獲取CD8+T細(xì)胞。6～10周齡、體質(zhì)量17～20 g雌性Rag-1-/-基因敲除小鼠(B6.129S7-Rag1 tmiMom/J)自美國(guó)Jackson實(shí)驗(yàn)室購(gòu)得。

1.1.2主要試劑及儀器：鼠源性MOG35-55肽段(MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK，北京賽百盛公司)，變性高效液相色譜分析(denaturing high performance liquid chromatography，DHPLC)純度>97%，與完全弗氏佐劑(complete Freund’s adjuvant，CFA；其中含結(jié)核分枝桿菌4 mg/mL，美國(guó)Sigma公司)1︰1混合后反復(fù)抽打制備成乳化液(肽段濃度300μg/mL)。百日咳毒素(pertussis toxin，PTX；美國(guó)Enzo life science公司)。小鼠CD8+T細(xì)胞陰性選擇磁珠試劑盒(德國(guó)Miltenyi公司)。細(xì)胞示蹤劑(Cell TrackerTMGreen BODIPY? dyes)及小鼠多甲藻黃素-葉綠素-蛋白質(zhì)復(fù)合物(peridinin chlorophylla protein，PerCP)標(biāo)記的CD8單克隆抗體〔美國(guó)Becton Dickinson(BD)公司〕；別藻藍(lán)蛋白(allophycocyanin，APC)標(biāo)記的CCR7抗體及其同型對(duì)照Rat IgG2a κ Isotype Control；異硫氰酸(fluorescence isothiocyanate，F(xiàn)ITC)標(biāo)記的CD44抗體及其同型對(duì)照Rat IgG2b Isotype Control(美國(guó)eBbioscienc公司)。主要組織相容性抗原(major histocompatibility complex，MHC)Ⅰ H-2Db-MOG35-55四聚體(MHC Ⅰ H-2Db-VGWYRSPFSRVVHL，PE標(biāo)記，廣州雅怡公司)。淋巴細(xì)胞分離液(瑞典GE公司)。

細(xì)胞培養(yǎng)箱(德國(guó)Heraeus公司)，磁珠分選磁力架(德國(guó)Miltenyi公司)，F(xiàn)ACS Calibur流式細(xì)胞儀、流式細(xì)胞分選儀(美國(guó)BD公司)，異氟烷氣體麻醉機(jī)(上海任誼生物科技有限公司)，Lecia組織脫水機(jī)、Lecia包埋機(jī)、Lecia組織切片機(jī)、Lecia熒光顯微鏡(德國(guó))。北大醫(yī)學(xué)部試驗(yàn)技術(shù)中心完成分選。

1.2 方法

1.2.1動(dòng)物分組、EAE模型的建立及TCM分選：(1)動(dòng)物分組、EAE模型的建立：C57 BL/6小鼠分為EAE組(n=50)及對(duì)照組(n=10)。EAE組小鼠按照文獻(xiàn)[15]的方法，于脊柱旁兩側(cè)4點(diǎn)(腋窩和脊髓腰膨大平面)皮下注射MOG35-55/CFA乳化液100 μL(含MOG35-55肽段300 μg)/只。免疫后0 h(注射乳化液當(dāng)時(shí))、48 h給予小鼠腹腔注射PTX 200 μL(400 ng)/只。對(duì)照組小鼠用等體積NS乳化液替代，同法注射PTX。

自免疫誘導(dǎo)當(dāng)日始測(cè)量小鼠的體質(zhì)量，并采用雙盲法通過(guò)Kono 5分法自誘導(dǎo)當(dāng)日開(kāi)始每日進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分[15-16]。具體評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：0分，無(wú)臨床表現(xiàn)；1分，精神委靡，尾部無(wú)力；2分，行走步態(tài)異常，雙后肢無(wú)力；3分，雙后肢癱瘓；4分，雙后肢癱瘓伴一側(cè)或者兩側(cè)前肢癱瘓；5分，瀕死或者死亡。1分<評(píng)分<5分者考慮建模成功，進(jìn)入下一步實(shí)驗(yàn)。

(2)CD8+T細(xì)胞的分離：于EAE小鼠發(fā)病高峰期3 d后將其處死，在超凈工作臺(tái)內(nèi)器械分離取其淋巴結(jié)和脾臟，經(jīng)過(guò)70 μm細(xì)胞篩碾磨，利用淋巴細(xì)胞分離液經(jīng)密度梯度離心法獲得單個(gè)核細(xì)胞(mononuclear cells，MNC)，經(jīng)小鼠CD8+T細(xì)胞陰性選擇免疫磁珠試劑盒分選CD8+T細(xì)胞，部分細(xì)胞加入CD8-PerCP抗體，經(jīng)FACS Calibur流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD8+T細(xì)胞比例，如所獲得CD8+T細(xì)胞純度達(dá)90%以上，提示分選純度高，臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)算細(xì)胞活率>95%，提示細(xì)胞活性好。可用于進(jìn)一步的分選及細(xì)胞過(guò)繼轉(zhuǎn)移。健康鼠CD8+T細(xì)胞取自同周齡的B6鼠，方法同EAE鼠CD8+T細(xì)胞的分離。

(3)CD8+TCM分選：用小鼠CD8-PerCP、CCR7-APC和 CD44-FITC抗體標(biāo)記經(jīng)免疫磁珠分選后的EAE鼠CD8+T細(xì)胞(>1.0×107/100 μL)，孵育30 min后用磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)清洗細(xì)胞，利用同型對(duì)照設(shè)門，經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)分選(圖4)獲得CD8+CCR7+CD44high細(xì)胞群(即CD8+TCM，在CD8+T細(xì)胞中比例為4.3%～24.9%)及CD8+CCR7-CD44low細(xì)胞群(即CD8+Ter TEM，在CD8+T細(xì)胞中比例為2.8%～20.4%)，行臺(tái)盼藍(lán)染色，鏡下觀察細(xì)胞活率>90%，則提示分選后的細(xì)胞仍具有較好的活性，可用于進(jìn)一步的過(guò)繼轉(zhuǎn)移。

1.2.2EAE鼠CD8+T細(xì)胞及不同亞群進(jìn)行致病性研究：(1)CD8+T細(xì)胞及不同亞群的過(guò)繼轉(zhuǎn)移及其致病性評(píng)估：①CD8+T細(xì)胞：將分離的CD8+T細(xì)胞重懸于PBS中(1×107/mL)，經(jīng)鼠尾靜脈注射至Rag-1-/-小鼠中(2×106/只)，按CD8+T細(xì)胞不同來(lái)源分為EAE鼠CD8+T細(xì)胞組(n=6)和健康鼠CD8+T細(xì)胞組(n=6)。

②CD8+TCM：將Rag-1-/-小鼠分為4組：CD8+TCM常規(guī)劑量組(n=6)、Ter TEM組(n=6)、PBS對(duì)照組(n=6)及CD8+TCM高劑量組(n=3)。將分選的TCM(常規(guī)劑量組2.5×106/mL，高劑量組7.5×106/mL)、Ter TEM(2.5×106/mL)分別重懸于PBS中，經(jīng)鼠尾靜脈注射至Rag-1-/-小鼠中，每只200 μL；PBS對(duì)照組注射PBS 200 μL。

注射當(dāng)日予以100 μL(300 μg)MOG35-55/CFA乳化液背部4點(diǎn)皮下注射，并于免疫當(dāng)日及48 h后予以PTX 200 μL(400 ng)/(次·只)腹腔注射，操作同1.2.1(1)。自免疫誘導(dǎo)當(dāng)天起開(kāi)始測(cè)量小鼠的體質(zhì)量，并采用雙盲Kono 五分法[15-16]進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)同前。觀察40 d后全部處死觀察病理學(xué)改變。

③病理學(xué)檢測(cè)：小鼠麻醉后經(jīng)左心耳予以冰生理鹽水灌注，隨后4%多聚甲醛灌注，分離腦組織和腰段脊髓，腦組織冠狀位紋狀體部位切片取材，軸位切取脊髓腰膨大段，經(jīng)Leica全自動(dòng)組織脫水機(jī)脫水，石蠟包埋，切片機(jī)制作切片，厚5μm，行HE、LFB染色，，每只鼠每種染色取冠狀位紋狀體、腰膨大各三個(gè)不同層面)，于光學(xué)顯微鏡下觀察其炎性浸潤(rùn)、髓鞘脫失等病理學(xué)改變，炎性浸潤(rùn)(0-4分)和脫髓鞘(0-3分)參照炎性細(xì)胞浸潤(rùn)的部位、炎性細(xì)胞數(shù)目及脫髓鞘程度確定[17]。

(2)CD8+TCM體外刺激的抗原特異性檢測(cè)及體內(nèi)示蹤：① CD8+TCM體外刺激的抗原特異性檢測(cè)：分選后CD8+TCM加入IL-2(20 U/mL)培養(yǎng)基中，與經(jīng)鈷(30 Gray)預(yù)照射的MNC(1×105/孔)作為APC共培養(yǎng)，每3 d換培養(yǎng)液1次，6 d后加入MOG35-55肽段(終濃度20 μg/mL)做進(jìn)一步刺激，繼續(xù)培養(yǎng)3 d收獲細(xì)胞。加入PE-MHC Ⅰ H-2Db-VGWYRSPFSRVVHL四聚體進(jìn)行標(biāo)記，經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD8+TCM體外培養(yǎng)前、后表達(dá)MHC Ⅰ H-2Db/MOG35-55的細(xì)胞比例(即經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)PE通道陽(yáng)性細(xì)胞比例)，以評(píng)估CD8+TCM體外培養(yǎng)后的抗原反應(yīng)性，如比例增加提示抗原反應(yīng)性增強(qiáng)。

②CD8+TCM的體內(nèi)示蹤：用10 μmol/L細(xì)胞示蹤劑工作液標(biāo)記CD8+TCM并重懸于200 μL PBS中，經(jīng)尾靜脈注射至Rag-1-/-小鼠體內(nèi)(n=2，5×105細(xì)胞/只)。為評(píng)價(jià)細(xì)胞是否通過(guò)血腦屏障進(jìn)入CNS，24 h后處死小鼠，取其脾臟、腦、脊髓行冰凍切片，利用Lecia熒光顯微鏡10倍、20倍鏡觀察組織內(nèi)綠色熒光表達(dá)的示蹤細(xì)胞。

2 結(jié)果

2.1 EAE發(fā)病、神經(jīng)功能評(píng)分及TCM分選

2.1.1EAE的發(fā)病、神經(jīng)功能評(píng)分：EAE組于免疫后第13～20 d〔平均(16.4±1.6)d〕陸續(xù)出現(xiàn)尾部肌張力減低、下垂等發(fā)病表現(xiàn)，后進(jìn)展為后肢無(wú)力、行走不穩(wěn)；第17～25 d〔平均(21.4±2.4 d)〕癥狀達(dá)高峰，Kono神經(jīng)功能評(píng)分為3.3±0.6分(圖1)，此時(shí)小鼠體質(zhì)量較免疫當(dāng)天下降〔(17.4±1.4)g 比(19.4±0.8)g，P<0.01〕，高峰期持續(xù)4～12 d，發(fā)病率100%。對(duì)照組無(wú)發(fā)病。

注：EAE：實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎，圖4～6同

2.1.2CD8+T細(xì)胞的分離：于免疫后第25～40 d處死小鼠，取其淋巴結(jié)和脾臟獲得MNC，分離CD8+T細(xì)胞。所獲得CD8+T細(xì)胞純度達(dá)90%以上(圖2)，臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)算細(xì)胞活率>95%，可用于進(jìn)一步的分選及細(xì)胞過(guò)繼。

注：R1：?jiǎn)蝹€(gè)核細(xì)胞；R2：CD8+ T細(xì)胞；Forward Scatter：前向散射光；Side Scatter：側(cè)向散射光；PerCP：多甲藻黃素-葉綠素-蛋白質(zhì)復(fù)合物，圖3、圖9同

(3)TCM的分選：經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)分選(圖3)獲得CD8+TCM，行臺(tái)盼藍(lán)染色顯示細(xì)胞活率>90%，可用于進(jìn)一步的過(guò)繼轉(zhuǎn)移。

注：FSC(Forward Scatter)-A：前向散射光-面積；SSC(Side Scatter)-A：側(cè)向散射光-面積。APC：別藻藍(lán)蛋白；FITC：異硫氰酸。P1、P2、P3和P4區(qū)域分別為淋巴細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、CD8+ TCM(CD8+CCR7+CD44high)和CD8+Ter TEM(CD8+CCR7-CD44low)

2.2 CD8+T細(xì)胞及其亞群的致病性研究

2.2.1CD8+T細(xì)胞及其亞群的過(guò)繼轉(zhuǎn)移：(1)CD8+T細(xì)胞過(guò)繼轉(zhuǎn)移可誘導(dǎo)EAE發(fā)?。篍AE鼠CD8+T細(xì)胞組第27～29 d后出現(xiàn)雙后肢癱瘓癥狀，第32～34 d高峰期Kono神經(jīng)功能評(píng)分均為3分，體質(zhì)量呈下降趨勢(shì)；健康鼠CD8+T細(xì)胞組均未發(fā)病，體質(zhì)量亦未明顯變化(圖4)。

圖4 CD8+ T細(xì)胞過(guò)繼轉(zhuǎn)移至Rag-1-/-小鼠后神經(jīng)功能評(píng)分

(2)CD8+TCM過(guò)繼轉(zhuǎn)移未能誘導(dǎo)EAE：CD8+TCM常規(guī)劑量組、Ter TEM組、PBS對(duì)照組及CD8+TCM高劑量組經(jīng)連續(xù)觀察40 d，均未出現(xiàn)尾部無(wú)力、肢體癱瘓等癥狀，且體質(zhì)量均呈增長(zhǎng)趨勢(shì)。

(3)病理學(xué)表現(xiàn)：①EAE組病理學(xué)改變：EAE組小鼠腦和脊髓切片HE染色可見(jiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，LFB染色可見(jiàn)脫髓鞘改變。對(duì)照組小鼠則均未發(fā)病，病理學(xué)未見(jiàn)相關(guān)改變(圖5)。

圖5 兩組小鼠腦和脊髓病理表現(xiàn)：HE染色顯示：對(duì)照組腦組織和脊髓(腰段)內(nèi)未見(jiàn)明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，腦組織和脊髓(腰段)內(nèi)可見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(圖中紅色箭頭所示)。LFB染色顯示，對(duì)照組腦紋狀體及脊髓(腰段)內(nèi)未見(jiàn)明顯脫髓鞘改變，EAE組小鼠腦紋狀體和脊髓(腰段)內(nèi)可見(jiàn)廣泛脫髓鞘改變(圖中黃色箭頭所示)

②EAE鼠CD8+T細(xì)胞組及健康鼠CD8+T細(xì)胞組病理學(xué)改變：EAE鼠CD8+T細(xì)胞組腦和脊髓切片HE染色可見(jiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，LFB染色可見(jiàn)脫髓鞘改變。健康鼠CD8+T細(xì)胞組則未見(jiàn)相關(guān)改變(圖6)。

注：對(duì)照組：健康鼠CD8+ T細(xì)胞組；EAE組：EAE鼠CD8+ T細(xì)胞組

③ CD8+TCM過(guò)繼轉(zhuǎn)移后病理學(xué)表現(xiàn)：CD8+TCM常規(guī)劑量組、Ter TEM組、PBS對(duì)照組及CD8+TCM高劑量組小鼠的腦實(shí)質(zhì)和腰段脊髓HE染色均未見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(圖7)，LFB染色亦未見(jiàn)及脫髓鞘改變(圖8)。

圖7 各組小鼠腦和脊髓病理表現(xiàn)(HE染色)：各組小鼠腦實(shí)質(zhì)和腰段脊髓HE染色未見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)

圖8 各組小鼠腦和脊髓病理表現(xiàn)(LFB染色)：各組小鼠腦實(shí)質(zhì)和腰段脊髓LFB染色未見(jiàn)脫髓鞘改變。

2.2.2CD8+TCM呈現(xiàn)抗原反應(yīng)性且通過(guò)血腦屏障：(1)CD8+TCM的體外培養(yǎng)后抗原反應(yīng)性增強(qiáng)：EAE鼠CD8+T細(xì)胞經(jīng)流式分選獲取CD8+TCM，利用四聚體MHC Ⅰ H-2Db/MOG35-55檢測(cè)抗原特異性T細(xì)胞，比例為1.2%。另將部分CD8+TCM進(jìn)行體外培養(yǎng)，經(jīng)IL-2和MOG35-55刺激后，經(jīng)同法檢測(cè)，所得比例為5.06%(圖9)。

注：MHCⅠ H-2Db/MOG35-55PE：主要組織相容性抗原Ⅰ H-2Db-MOG35-55四聚體

(2)CD8+TCM可通過(guò)血腦屏障：示蹤細(xì)胞注射后，脾臟中可見(jiàn)大量熒光細(xì)胞，而腦和脊髓中可見(jiàn)少量熒光細(xì)胞(圖10)。

圖10 示蹤細(xì)胞注射后組織中CD8+ T細(xì)胞熒光表現(xiàn)：脾臟(A)可見(jiàn)大量熒光細(xì)胞，腦組織(B)和脊髓(C)中可見(jiàn)少量熒光細(xì)胞(圖中紅色箭頭所示)

3 討論

MS現(xiàn)是一種主要由CD4+T細(xì)胞介導(dǎo)的CNS自身免疫性疾病，其中Th1/Th2、Th17/調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cells，Treg)比例失調(diào)被證實(shí)構(gòu)成了MS發(fā)病機(jī)制的病理生理學(xué)基礎(chǔ)。但更多的研究[2-5]亦發(fā)現(xiàn)CD8+T細(xì)胞在MS發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮著重要作用。以往Sun等[18]報(bào)道體外培養(yǎng)EAE來(lái)源CD8+T細(xì)胞并予以MOG35-55抗原二次刺激，可形成MOG35-55特異性CD8+T細(xì)胞，將該細(xì)胞過(guò)繼轉(zhuǎn)移至B6或Rag-1-/-小鼠中(2×106/只)均可造成小鼠癱瘓發(fā)病。與之相一致，在本研究中將EAE鼠來(lái)源CD8+T細(xì)胞過(guò)繼轉(zhuǎn)移至Rag-1-/-小鼠體內(nèi)，同時(shí)經(jīng)皮下注射予以MOG35-55/CFA二次抗原刺激，可在第27～29 d出現(xiàn)后肢癱瘓癥狀，病理學(xué)檢測(cè)可見(jiàn)腦組織和脊髓內(nèi)明顯的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及脫髓鞘改變，再次表明CD8+T細(xì)胞具有EAE致病效應(yīng)。然而，目前尚無(wú)研究明確CD8+TCM亞群是否也具有致病效應(yīng)，故本研究通過(guò)將CD8+TCM過(guò)繼轉(zhuǎn)移進(jìn)行了初探。

以往研究顯示MS患者病情復(fù)發(fā)或惡化時(shí)外周血中記憶性T細(xì)胞比例較緩解期明顯增加[19]。利用MOG35-55/CFA誘導(dǎo)B6小鼠所建立的EAE模型，在免疫后第10天脾臟中淋巴細(xì)胞主要為效應(yīng)性T細(xì)胞，而在1～3個(gè)月后則主要為記憶性T細(xì)胞[20]。因此，為獲取足量CD8+TCM，本研究選擇EAE小鼠發(fā)病高峰期后(即免疫后第25～40天，而非免疫后第10天)取其脾臟和淋巴結(jié)獲得CD8+TCM。

為鑒定CD8+TCM的抗原特異性，本研究將其在體外用MOG35-55肽段刺激后通過(guò)四聚體技術(shù)檢測(cè)了MOG35-55表達(dá)陽(yáng)性的CD8+T細(xì)胞克隆比例。以往研究報(bào)道，獲取MOG35-55誘導(dǎo)EAE小鼠淋巴結(jié)中T細(xì)胞(CD8+和CD4+)后，予以MOG35-55和IL-2再刺激，經(jīng)二聚體(MOG35-55-H-2Db)技術(shù)檢測(cè)陽(yáng)性細(xì)胞比例是20%～60%[18]。本研究顯示，CD8+TCM經(jīng)體外培養(yǎng)后MHC Ⅰ H-2Db/MOG35-55表達(dá)陽(yáng)性的CD8+T克隆比例為5.06%，較刺激前明顯增高，表明部分CD8+TCM經(jīng)MOG35-55肽段刺激后可分化為抗原特異性T細(xì)胞，從而在二次抗原刺激時(shí)可參與免疫應(yīng)答反應(yīng)。此外，目前尚無(wú)CD8+TCM體外培養(yǎng)經(jīng)MOG35-55刺激后抗原特異性CD8+T細(xì)胞克隆比例的報(bào)道，故本發(fā)現(xiàn)無(wú)疑為今后的相關(guān)研究提供了有益的參考。為明確靜脈注射后CD8+TCM能否進(jìn)入CNS內(nèi)，本研究采用熒光示蹤劑對(duì)其進(jìn)行標(biāo)記及示蹤。正常情況下，少量TCM可進(jìn)入CNS內(nèi)執(zhí)行免疫監(jiān)視功能[21]。在病理狀態(tài)下，T細(xì)胞的CNS浸潤(rùn)過(guò)程被發(fā)現(xiàn)由2個(gè)時(shí)相構(gòu)成[22-23]：(1)在過(guò)繼轉(zhuǎn)移后數(shù)小時(shí)內(nèi)，少量T細(xì)胞即進(jìn)入CNS內(nèi)，現(xiàn)認(rèn)為此類細(xì)胞穿過(guò)血腦屏障后被APC識(shí)別，釋放炎性因子IFN-γ、IL-2，形成初次免疫應(yīng)答；(2)該免疫應(yīng)答促使3 d后大量T細(xì)胞再次進(jìn)入CNS，進(jìn)而引起臨床發(fā)病。在本研究中，我們過(guò)繼轉(zhuǎn)移示蹤劑標(biāo)記CD8+TCM細(xì)胞至Rag-1-/-小鼠中，24 h后在脾臟中可見(jiàn)大量綠色熒光細(xì)胞，在腦和脊髓內(nèi)可見(jiàn)及少量熒光細(xì)胞浸潤(rùn)，與既往研究結(jié)果類似[22-24]，這表明CD8+TCM經(jīng)靜脈注射后進(jìn)至CNS內(nèi)，可能進(jìn)一步誘導(dǎo)或促進(jìn)了CNS免疫應(yīng)答。

在本研究中，自身反應(yīng)性CD8+T細(xì)胞過(guò)繼轉(zhuǎn)移(2×106/只)可致病，而將自身反應(yīng)性CD8+TCM、CD8+Ter TEM過(guò)繼轉(zhuǎn)移至Rag-1-/-小鼠(5×105/只)體內(nèi)，觀察40 d未見(jiàn)發(fā)病癥狀，腦和脊髓的病理學(xué)檢測(cè)亦未顯示CNS內(nèi)的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)或髓鞘脫失。據(jù)此，以上結(jié)果表明CD8+T細(xì)胞具有EAE致病效應(yīng)，而CD8+TCM則明顯缺乏此類效應(yīng)。對(duì)于CD8+TCM過(guò)繼轉(zhuǎn)移細(xì)胞量(5×105/只)的選擇主要基于如下兩方面依據(jù)：一方面，根據(jù)本研究結(jié)果顯示，CD8+TCM亞群在CD8+T細(xì)胞中比例為4.3%～24.9%，而CD8+Ter TEM則為2.8%～20.4%。鑒于過(guò)繼轉(zhuǎn)移2×106EAE鼠來(lái)源CD8+T細(xì)胞至每只Rag-1-/-小鼠即可誘發(fā)EAE，而CD8+TCM、CD8+Ter TEM亞群在CD8+T細(xì)胞中比例均低于25%，故可認(rèn)為0.5×105(即2×106×25%)的過(guò)繼轉(zhuǎn)移細(xì)胞量足以滿足本研究的要求。另一方面，目前已有研究證實(shí)，過(guò)繼轉(zhuǎn)移抗原特異性CD8+T細(xì)胞(5x105/只)至B6或Rag-1-/-小鼠即可引起小鼠癱瘓[18]。綜上，本研究將過(guò)繼轉(zhuǎn)移的細(xì)胞(CD8+TCM和CD8+Ter TEM)數(shù)量定為5×105/只。Elyaman等[20]研究發(fā)現(xiàn)，將EAE鼠來(lái)源CD4+記憶性T細(xì)胞經(jīng)尾靜脈注射過(guò)繼轉(zhuǎn)移至TCRαβ-/-小鼠體內(nèi)〔(1～1.5)×106/只〕可明顯其引起癱瘓發(fā)病。鑒于本研究中以5×105/只CD8+TCM數(shù)量過(guò)繼轉(zhuǎn)移至Rag-1-/-小鼠(n=6)均未發(fā)病，為排除因細(xì)胞量不足影響本實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可能性，另設(shè)一更大劑量CD8+TCM過(guò)繼轉(zhuǎn)移組(n=3)，其細(xì)胞量達(dá)1.5×106/只，同樣觀察40 d亦未見(jiàn)小鼠發(fā)病此，因細(xì)胞量不足而導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果陰性的可能性不大，進(jìn)一步支持本研究的結(jié)論。

以往針對(duì)MS患者的研究(人體研究)中，CD8+TCM在MS患者中顯著增多，經(jīng)免疫調(diào)節(jié)治療后顯著減少。但在本研究中，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果未發(fā)現(xiàn)被動(dòng)轉(zhuǎn)移CD8+TCM能夠誘導(dǎo)EAE的發(fā)生。對(duì)此矛盾結(jié)果，分析原因，一方面可能是動(dòng)物與人體自身免疫應(yīng)答差異較大，另一方面可能是本文作者團(tuán)隊(duì)前期人體研究?jī)H為初步研究，其樣本量不大且沒(méi)有進(jìn)一步的亞組研究(如緩解期、復(fù)發(fā)期相關(guān)研究)等諸多不足，今后可進(jìn)一步深入研究(如擴(kuò)大人體研究的樣本量、分組研究及機(jī)制研究，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中其他記憶性CD8+T細(xì)胞亞群等)探討。

此外，本研究中CD8+TCM過(guò)繼轉(zhuǎn)移未曾發(fā)病，分析其原因有以下兩種可能性：(1)以往Sun等[18]發(fā)現(xiàn)將同源性細(xì)胞過(guò)繼轉(zhuǎn)移至B6小鼠第7～8天后即可發(fā)病，而將B6來(lái)源MOG特異性T細(xì)胞過(guò)繼轉(zhuǎn)移至Rag-1-/-鼠后，其發(fā)病時(shí)間延遲至數(shù)周或數(shù)月不等。本研究在CD8+TCM過(guò)繼轉(zhuǎn)移后觀察時(shí)間持續(xù)40 d未發(fā)病，可能存在受體小鼠延遲發(fā)病的可能性；(2)Ifergan等[25]報(bào)道純化的TEM較非TEM更易穿透血腦屏障內(nèi)皮細(xì)胞，且血腦屏障內(nèi)皮選擇性募集了TEM，據(jù)此推測(cè)CD8+TCM的致病作用可能主要是維持CNS內(nèi)的慢性炎性狀態(tài)，并非之前所述的誘導(dǎo)MS相關(guān)的免疫應(yīng)答，而TEM則可能在誘導(dǎo)對(duì)CNS免疫應(yīng)答的過(guò)程中起著更為重要的作用。對(duì)此，尚需今后延長(zhǎng)對(duì)TCM過(guò)繼轉(zhuǎn)移后的觀察時(shí)間或圍繞TEM亞群進(jìn)行研究求證。

總之，本研究顯示，雖然EAE自身反應(yīng)性CD8+T細(xì)胞的過(guò)繼轉(zhuǎn)移可誘導(dǎo)Rag-1-/-小鼠發(fā)病，但自身反應(yīng)性CD8+TCM的過(guò)繼轉(zhuǎn)移則未能誘導(dǎo)出EAE病癥及其相應(yīng)的病理學(xué)改變，表明該TCM亞群缺乏明顯的EAE致病效應(yīng)，究其原因可能是該細(xì)胞群在疾病發(fā)病過(guò)程中主要參與了對(duì)CNS內(nèi)慢性炎癥的維持，而非對(duì)MS相關(guān)之免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)。由于本研究存在觀察周期宜更長(zhǎng)、無(wú)TEM組以及未觀察過(guò)繼轉(zhuǎn)移后CNS的炎性狀態(tài)等局限性，故對(duì)TCM及其相關(guān)亞群(如TEM)在EAE中的確切作用，仍需今后進(jìn)一步的研究予以明確。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突