Fe2O3提高高濃造紙污水厭氧顆粒污泥產(chǎn)甲烷性能的機(jī)理研究

吳 明，楊振虎，吳開麗，江 闖，王凱晴，劉 葦，侯慶喜

（天津市制漿造紙重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)輕工科學(xué)與工程學(xué)院，天津300457）

污水的厭氧生物處理可以有效地降低污染并回收能源。污水中可生物降解的有機(jī)物在多種厭氧微生物的協(xié)同作用下被分解成易于回收的甲烷、二氧化碳等穩(wěn)定副產(chǎn)品，有利于降低污水的處理成本。廢紙?jiān)旒埼鬯锈}離子濃度為1250～2000 mg/L[1]，在厭氧反應(yīng)器長(zhǎng)期運(yùn)行過(guò)程中，污水中的鈣離子容易形成碳酸鈣或碳磷灰石等物質(zhì)沉積到污泥表面或在污泥內(nèi)部形成硬核，造成污泥的鈣化。在鈣化的過(guò)程中，無(wú)機(jī)成分積累造成污泥灰分升高，污泥中微生物含量的比例降低，產(chǎn)甲烷的能力大大降低，工廠需要定期更換反應(yīng)器中的污泥，這就提高了運(yùn)行成本，并且對(duì)污水處理效果造成嚴(yán)重影響；此外，如果顆粒污泥完全鈣化，甚至?xí)?dǎo)致整個(gè)厭氧系統(tǒng)無(wú)法正常運(yùn)行，重新恢復(fù)系統(tǒng)需花費(fèi)數(shù)月時(shí)間，這已成為高鈣污水厭氧處理過(guò)程中的頑疾。

胞外聚合物（extracellular polymeric substance，EPS）在生物顆粒和生物膜中的空間分布對(duì)其微孔結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定和微孔強(qiáng)度的維持起著至關(guān)重要的作用[2]。近年來(lái)，許多研究指出在厭氧反應(yīng)器中添加鐵的氧化物可以作用于EPS，加強(qiáng)互營(yíng)菌與產(chǎn)甲烷菌之間的直接電子轉(zhuǎn)移（direct interspecies electron transfer，DIET），促進(jìn)了甲烷的生成[3-5]，與H2/甲酸轉(zhuǎn)移相比，DIET具有更高的電子傳遞效率和能源利用率。鐵還原微生物可以利用有機(jī)物作為電子供體，F(xiàn)e(III)作為電子受體，使得Fe(III)被還原為Fe(II)，這就是異化鐵還原過(guò)程[6]。異化鐵還原發(fā)生在厭氧環(huán)境，在這一過(guò)程中有效地降解多種有機(jī)污染物，因此對(duì)厭氧顆粒污泥EPS存在潛在的影響。由于污泥EPS的組成非常復(fù)雜，含有蛋白質(zhì)、多糖、核酸、脂質(zhì)等[7]，已有研究主要集中于導(dǎo)電礦物材料對(duì)厭氧體系的影響，對(duì)厭氧消化過(guò)程中EPS分泌變化的研究不多。因此，本研究旨在探討添加Fe2O3對(duì)厭氧顆粒污泥EPS的影響及顆粒污泥中微生物群落的變化，揭示EPS在厭氧消化中的作用，為應(yīng)用Fe2O3提高厭氧消化產(chǎn)甲烷能力，緩解顆粒污泥鈣化問(wèn)題提供理論基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 原料與試劑

厭氧顆粒污泥取自南寧某造紙廠，新鮮的污泥在4°C條件下儲(chǔ)存。使用篩網(wǎng)選取粒徑為0.3～0.6 mm的種泥備用。分析純Fe2O3粉末過(guò)100目篩待用。

本研究所采用的模擬污水（pH 7.20±0.20）以葡萄糖（25.50 g/L）為底物，NH4Cl和KH2PO4為氮源和磷源，模擬污水按照COD∶N∶P的質(zhì)量比為200∶5∶1進(jìn)行配制。FeSO4·4H2O(0.032 g/L)、CaCl2(0.038 g/L)和MgSO4·7H2O(0.042 mg/L)作為微量元素添加到營(yíng)養(yǎng)液中。此外，添加CaCl2(2000 mg/L)以模擬高濃造紙污水。

1.2 實(shí)驗(yàn)裝置

實(shí)驗(yàn)在三個(gè)容積為250 mL的封閉的厭氧反應(yīng)瓶中進(jìn)行。每個(gè)厭氧反應(yīng)瓶中加入50 mL厭氧顆粒污泥和150 mL模擬污水。其中兩個(gè)厭氧反應(yīng)瓶分別添加0.2 g和3 g的Fe2O3，對(duì)照組不添加Fe2O3。在厭氧反應(yīng)開始前，對(duì)每個(gè)瓶子通入氮?dú)?5 min，以排除氧氣，厭氧反應(yīng)全過(guò)程在37°C±1°C的溫度下持續(xù)30 d。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中產(chǎn)生的生物氣先通入飽和氫氧化鈉水溶液，再用排水法測(cè)量其體積。在第0、7、14、21、28天對(duì)樣品EPS進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后對(duì)樣品進(jìn)行高通量測(cè)序，分析顆粒污泥中微生物的變化情況。

1.3 分析方法

1.3.1 EPS分析

采用激光粒度儀分析厭氧顆粒污泥的粒度。污泥中的總懸浮物（TSS）和可揮發(fā)性懸浮物（VSS）濃度參照《水和廢水監(jiān)測(cè)分析方法》（第4版）[8]的方法進(jìn)行測(cè)定。

EPS采用NaOH-甲醛法提取[9]。EPS中多糖含量采用蒽酮硫酸法測(cè)定[10]，腐殖質(zhì)和蛋白質(zhì)含量采用修正的洛瑞法測(cè)定[11]。利用三維熒光光譜儀(three-dimensional excitation emission matrix fluorescence，3-DEEM)對(duì)EPS進(jìn)行分析，激發(fā)波長(zhǎng)為220～500nm，步長(zhǎng)5nm；發(fā)射波長(zhǎng)為250～500nm，步長(zhǎng)5nm。

1.3.2 厭氧顆粒污泥菌群結(jié)構(gòu)分析

分別收集培養(yǎng)30 d后來(lái)自實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組反應(yīng)器的5 mL污泥樣品，進(jìn)行高通量16SrRNA焦磷酸測(cè)序，分析其微生物群落。

2 結(jié)果與討論

2.1 Fe2O3對(duì)厭氧顆粒污泥產(chǎn)甲烷能力對(duì)影響

通過(guò)記錄1個(gè)厭氧反應(yīng)周期（28 d）內(nèi)反應(yīng)器中的甲烷積累量來(lái)表征反應(yīng)器內(nèi)厭氧顆粒污泥的產(chǎn)甲烷活性。由圖1可知，添加Fe2O3后增強(qiáng)了厭氧顆粒污泥的產(chǎn)甲烷能力。在模擬的高濃造紙污水中，添加了Fe2O3的實(shí)驗(yàn)組仍能保持較高的甲烷產(chǎn)量，并且隨著Fe2O3添加量的增加，甲烷積累量也隨之增加。

經(jīng)過(guò)28 d的培養(yǎng)后，在Fe2O3添加量為15 g/L的實(shí)驗(yàn)組中甲烷積累量達(dá)到4.19 L，相比對(duì)照組提高了67.6%；在Fe2O3添加量為1 g/L的實(shí)驗(yàn)組中甲烷積累量達(dá)到2.89 L，相比對(duì)照組提高了15.8%。在厭氧反應(yīng)進(jìn)行的前12天，隨著有機(jī)底物的快速消耗，三組反應(yīng)器中的甲烷積累量快速升高，尤其是添加Fe2O3的實(shí)驗(yàn)組，這說(shuō)明Fe2O3可能通過(guò)提高污泥水解酸化效率，促進(jìn)厭氧反應(yīng)的進(jìn)行。此外，厭氧反應(yīng)前期對(duì)照組的甲烷積累量高于實(shí)驗(yàn)組（圖1），這可能是由于Fe2O3的添加改變了厭氧微生物的生存環(huán)境，微生物需要一定時(shí)間去適應(yīng)所導(dǎo)致的。

圖1 在模擬高濃造紙污水中添加Fe2O3對(duì)甲烷產(chǎn)量的影響

2.2 Fe2O3對(duì)厭氧顆粒污泥微環(huán)境的影響

EPS為微生物的結(jié)合提供了廣闊的物質(zhì)交換場(chǎng)所，黏附在胞外多糖中的絮凝體可以為一些有機(jī)物和無(wú)機(jī)物提供吸引位點(diǎn)，幫助其進(jìn)行物質(zhì)交換，如傳遞細(xì)胞外蛋白質(zhì)等[12]。EPS不但幫助形成微生物聚集體，使其共同作用抵御外界環(huán)境變化和有毒物質(zhì)對(duì)細(xì)胞的危害，而且可將環(huán)境中的大分子營(yíng)養(yǎng)成分富集，再通過(guò)胞外酶降解成小分子后吸收到細(xì)胞內(nèi)，也方便微生物種間電子的傳遞。

圖2表明，F(xiàn)e2O3促進(jìn)了厭氧顆粒污泥分泌EPS。由圖2（a）可知：在培養(yǎng)前期，EPS總量隨培養(yǎng)時(shí)間增長(zhǎng)呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，之后隨著培養(yǎng)時(shí)間的增長(zhǎng)，EPS含量逐漸下降。相比對(duì)照組，添加Fe2O3后EPS中的多糖、蛋白質(zhì)和腐殖質(zhì)含量均明顯提高。當(dāng)厭氧反應(yīng)進(jìn)行到第7天時(shí)，F(xiàn)e2O3添加量為1 g/L和15 g/L的實(shí)驗(yàn)組中EPS總量比對(duì)照組分別提高16.56%和45.97%。

圖2 Fe2O3對(duì)EPS中多糖、蛋白質(zhì)和腐殖質(zhì)含量的影響及不同實(shí)驗(yàn)組EPS的三維熒光光譜圖

隨著厭氧消化的進(jìn)行，EPS濃度逐漸降低。這是因?yàn)镋PS的主要成分（蛋白質(zhì)和多糖）可以被生物降解，成為細(xì)胞生長(zhǎng)的碳源，在營(yíng)養(yǎng)缺乏的情況下被消耗以維持細(xì)胞生長(zhǎng)[13]；隨著厭氧反應(yīng)的進(jìn)行，厭氧顆粒污泥的降解能力得到了極大的提高，培養(yǎng)液中營(yíng)養(yǎng)缺乏造成了EPS組分中多糖和蛋白質(zhì)降解。

根據(jù)文獻(xiàn)[14]，以激發(fā)波長(zhǎng) （λEx）和發(fā)射波長(zhǎng)（λEm）為界將三維熒光光譜的激發(fā)-發(fā)射矩陣劃分為5個(gè)區(qū)域：區(qū)域I，λEx/λEm=200～250 nm/280～330 nm；區(qū)域II，λEx/λEm=200～250 nm/330～380 nm；區(qū)域III，λEx/λEm=200～250 nm/380～550 nm； 區(qū) 域IV，λEx/λEm=250～450 nm/280～380 nm；區(qū)域V，λEx/λEm=250～450 nm/380～550 nm。

EPS的熒光光譜圖如圖2(b)—圖2(d)所示。厭氧反應(yīng)進(jìn)行至第28天時(shí)，各反應(yīng)器中厭氧顆粒污泥EPS的熒光光譜峰值主要出現(xiàn)在峰B和峰D，分別為可溶性微生物副產(chǎn)物[15]熒光峰和類胡敏酸類[16-18]熒光峰。

與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組中峰B的出峰位置沒(méi)有明顯變化，出峰位置均在λEx/λEm=290 nm/370 nm。但與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組中類胡敏酸類熒光峰(峰D)均發(fā)生紅移，峰值位置均在λEx/λEm=330 nm/410 nm。據(jù)文獻(xiàn)[19]可知，熒光峰（峰D）的紅移可能是由于添加Fe2O3改變了厭氧顆粒污泥EPS中蛋白質(zhì)的組成成分及含量，造成EPS中羰基、羥基、烷氧基、氨基和羧基等官能團(tuán)的出現(xiàn)或增加。添加Fe2O3改變了實(shí)驗(yàn)組反應(yīng)器中微生物的群落結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致EPS中蛋白質(zhì)組分發(fā)生改變。綜上，隨著厭氧反應(yīng)的進(jìn)行，微生物不斷生長(zhǎng)代謝，添加Fe2O3使厭氧顆粒污泥分泌的EPS中蛋白質(zhì)組分出現(xiàn)不同的變化，從而提高了厭氧消化產(chǎn)甲烷能力。

2.3 Fe2O3對(duì)微生物群落的影響

2.3.1 Alpha多樣性分析

Alpha多樣性是一類綜合指標(biāo)，反映一個(gè)特定區(qū)域或生態(tài)系統(tǒng)內(nèi)物種的豐富度和均勻度[20-22]。細(xì)菌Alpha多樣性分析結(jié)果如圖3所示。

圖3 細(xì)菌Alpha多樣性分析

三組實(shí)驗(yàn)的Ace指數(shù)及Chao指數(shù)差異明顯（見圖3(a)、圖3(b)），結(jié)合圖3(c)的Venn圖分析可知，在不改變環(huán)境條件的情況下，添加Fe2O3的反應(yīng)器中微生物多樣性明顯高于對(duì)照組。在OTU分類水平上，添加1 g/L Fe2O3和15 g/L Fe2O3實(shí)驗(yàn)組的物種總數(shù)分別為333和378，相比對(duì)照組的物種總數(shù)328分別上升了1.5%和15.2%。因此，添加Fe2O3可以提高厭氧反應(yīng)器中的微生物物種多樣性。結(jié)合前人的研究[23]可以得出，添加Fe2O3后微生物物種多樣性的增加可能是使厭氧消化系統(tǒng)產(chǎn)甲烷活性明顯提高的主要原因。

2.3.2 微生物群落結(jié)構(gòu)分析

為了進(jìn)一步解微生物群落結(jié)構(gòu)對(duì)厭氧反應(yīng)活性的影響，分別對(duì)古菌和細(xì)菌在門水平和屬水平上的微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析，結(jié)果見表1—表4，表中相對(duì)豐度小于1%的古菌和細(xì)菌群落均被列入其他（門或?qū)伲?/p>

根據(jù)表1對(duì)古菌的門水平的群落分析結(jié)果可知，在反應(yīng)器中添加Fe2O3并未改變古菌群落的主要結(jié)構(gòu)組成。在經(jīng)歷28 d培養(yǎng)后，三組反應(yīng)器中的優(yōu)勢(shì)菌均屬于Euryarchaeota(廣古菌門)，分別占對(duì)照組、1 g/L Fe2O3和15 g/L Fe2O3實(shí)驗(yàn)組古菌的56.60%、67.94%和68.61%；Crenarchaeota(泉古菌門)在三組中占比分別為43.02%、31.69%和31.19%。已有研究表明[24-26]，Crenarchaeota可利用的碳源多為碳酸氫鹽或CO2。

表1 古菌群落組成（門水平）

由表2對(duì)古菌的屬水平的群落分析結(jié)果可知，添加Fe2O3的實(shí)驗(yàn)組中細(xì)菌群落以氫營(yíng)養(yǎng)型產(chǎn)甲烷古菌為主，實(shí)驗(yàn)組的優(yōu)勢(shì)菌為Methanobacterium、norank_c_Bathyarchaeia、Methanomassiliicoccus。其中，Methanobacterium分別占對(duì)照組、1 g/LFe2O3和15 g/L Fe2O3實(shí)驗(yàn)組古菌群落的34.04%、37.22%和36.69%；norank_c_Bathyarchaeia分別占各組中古菌群落的42.92%、31.64%和31.16%；Methanomassiliicoccus分別占各組中古菌群落的9.54%、9.84%和13.12%。Fe2O3的加入引入了大量Fe（III），異化鐵還原過(guò)程促進(jìn)了復(fù)雜的有機(jī)物降解釋放大量氫氣，這也導(dǎo)致了氫營(yíng)養(yǎng)型產(chǎn)甲烷古菌占據(jù)優(yōu)勢(shì)。在添加1 g/L和15 g/L Fe2O3的反應(yīng)器中Methanosaeta占比分別提高了58.2%和90.0%，這可能是隨著水解酸化的進(jìn)行，乙酸不斷積累導(dǎo)致，Methanosaeta可以與地桿菌屬產(chǎn)生直接的電子傳遞，加速了甲烷的產(chǎn)生。同時(shí)，Methanolinea作為一種利用H2/CO2為營(yíng)養(yǎng)源的產(chǎn)甲烷古菌[27]在添加了Fe2O3的兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組中占比上升，均比對(duì)照組提高了75.2%。綜上可知，氫營(yíng)養(yǎng)型產(chǎn)甲烷古菌(如Methanolinea、Methanobacterium、Methanosaeta等)在古菌群落中取得優(yōu)勢(shì)地位可能是造成實(shí)驗(yàn)組產(chǎn)甲烷效率顯著高于對(duì)照組的原因之一。

表2 古菌群落組成（屬水平）

結(jié)合細(xì)菌與古菌之間的互營(yíng)代謝理論來(lái)分析細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)可能會(huì)為解析Fe2O3提高厭氧發(fā)酵產(chǎn)甲烷能力提供一種新的思路。如表3所示，在添加Fe2O3的實(shí)驗(yàn)組中，細(xì)菌主要微生物群落在門水平上的變化非常明顯，F(xiàn)irmicutes（厚壁菌門）占優(yōu)。有研究表明[28]，F(xiàn)irmicutes占比與VFA（揮發(fā)性脂肪酸）含量呈負(fù)相關(guān)，與CH4產(chǎn)量呈正相關(guān)，對(duì)照組厭氧消化效率低，甲烷產(chǎn)量少，可能造成VFA的積累，因此Firmicutes的相對(duì)豐度占總體微生物豐度的85.33%，高于實(shí)驗(yàn)組。此外，F(xiàn)irmicutes、Chloroflexi（緑彎菌門）和Actinobacteria（放線菌門）都已經(jīng)被證明可以在污水中形成生物膜結(jié)構(gòu)，并且生成大量的EPS[29]，因此，添加Fe2O3的實(shí)驗(yàn)組中EPS含量遠(yuǎn)高于對(duì)照組。

表3 細(xì)菌群落組成（門水平）

如表4所示，在屬水平下，三組反應(yīng)器中物種組成差異較大，但屬于Syntrophobacter（互營(yíng)桿菌屬）的細(xì)菌占比增加，互營(yíng)菌可能與產(chǎn)甲烷古菌形成互營(yíng)共聚體，參與產(chǎn)酸菌與產(chǎn)甲烷古菌之間的種間氫轉(zhuǎn)移[30]，受氫分壓的調(diào)控，也在轉(zhuǎn)移代謝產(chǎn)物方面發(fā)揮著中要作用。在互營(yíng)共聚體的參與下，氫轉(zhuǎn)移速度提高在一定程度上加快了產(chǎn)甲烷速率，由此，添加Fe2O3的實(shí)驗(yàn)組中Syntrophobacter占比的增加很可能提高了厭氧發(fā)酵產(chǎn)甲烷能力。此外，Tepidimicrobium出現(xiàn)，作為一種發(fā)酵型鐵還原菌，能以Fe（III）為電子受體，參與異化鐵還原過(guò)程；Clostridia綱出現(xiàn)（包括unclassified_o_Clostridiales、Tepidimicrobium等），主要通過(guò)改善VFA的降解并促進(jìn)甲烷生成來(lái)維持厭氧消化的穩(wěn)定。

表4 細(xì)菌群落組成（屬水平）

綜上，由互營(yíng)菌與產(chǎn)甲烷古菌形成的互營(yíng)共聚體參與并調(diào)控了種間氫轉(zhuǎn)移。在添加了Fe2O3的反應(yīng)器中，互營(yíng)菌屬占比增加可能是提高產(chǎn)甲烷古菌產(chǎn)甲烷效率的主要原因，而EPS中各組分濃度的提高主要由Firmicutes、Chloroflexi、Actinobacteria等調(diào)控。結(jié)合甲烷產(chǎn)量、EPS組分及含量的分析結(jié)果，在高濃造紙污水環(huán)境下添加Fe2O3可以有效促進(jìn)微生物厭氧產(chǎn)甲烷效果。

3 結(jié)論

本研究提出了一種通過(guò)添加Fe2O3有效提高厭氧顆粒污泥產(chǎn)甲烷能力的方法，并通過(guò)實(shí)驗(yàn)考察了添加Fe2O3對(duì)厭氧顆粒污泥胞外聚合物分泌的影響及顆粒污泥中微生物群落的變化。結(jié)果表明：與對(duì)照組相比，添加Fe2O3可使甲烷產(chǎn)量提高67.6%。此外，F(xiàn)e2O3還具有刺激微生物分泌EPS的作用，添加Fe2O3使得細(xì)菌群落分布更均勻，厭氧消化系統(tǒng)能夠維持穩(wěn)定的狀態(tài)；同時(shí)，富集了Fe（III）還原菌（如Tepidimicrobium等），微生物異化鐵還原作用促進(jìn)了有機(jī)污染物降解；還加強(qiáng)了互營(yíng)菌與產(chǎn)甲烷菌之間的直接電子轉(zhuǎn)移，提高了電子傳遞效率，從而加速了厭氧反應(yīng)進(jìn)程。以上結(jié)論充實(shí)了Fe（III）促進(jìn)厭氧反應(yīng)產(chǎn)甲烷能力的作用機(jī)制，并為解決造紙高濃有機(jī)污水難處理的問(wèn)題提供了一種新思路。